Questo manoscritto descrive protocolli di video microscopia in vitro per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale del ratto. Il manoscritto descrive anche tecniche per la valutazione di densità del microvessel con aspersione di lectine e tessuto fluorescente contrassegnato utilizzando flussometria del Laser Doppler.
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Articolo metodologico
Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive l'uso di in vitro televisione microscopia per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale isolata (e altre navi) e vengono descritte le tecniche per valutare la perfusione tissutale mediante Laser Doppler flussometria (LDF ) e la densità del microvessel utilizzando fluorescente denominata lectina di Griffonia simplicifolia (GS1). Attuali metodi per lo studio isolato di arterie di resistenza alle pressioni incontrate transmurale in vivo e in assenza di influenze delle cellule parenchimatiche forniscono un collegamento critico tra gli studi in vivo e le informazioni acquisite da molecolare approcci riduzionisti che forniscono approfondimenti limitato di risposte integrative a livello animale intero. LDF e tecniche per identificare in modo selettivo le arteriole e capillari con fluorescente-etichetta GS1 lectina forniscono soluzioni pratiche per consentire ai ricercatori di estendere le conoscenze acquisite dagli studi delle arterie di resistenza isolata. Questo articolo descrive l'applicazione di queste tecniche per acquisire conoscenze fondamentali della fisiologia vascolare e della patologia nel ratto come modello sperimentale generale e in una varietà di specializzato geneticamente ceppi di ratti "designer" che possono fornire importante approfondire l'influenza dei geni specifici sui fenotipi vascolari importanti. Utilizzando questi approcci sperimentali preziosi in ceppi di ratti sviluppati da strategie di allevamento selettivo e nuove tecnologie per la produzione di modelli di knockout del gene nel ratto, si espanderà il rigore delle premesse scientifiche sviluppate in modelli murini knockout e estendere tale conoscenza per un modello animale più rilevante, con una priorità bassa fisiologica ben compreso e idoneità per studi fisiologici a causa delle sue dimensioni più grandi.
Introduzione
I primi studi di funzione vascolare nelle arterie utilizzate condotto arterie e in molti casi l'aorta. Generazione di forza nelle grandi arterie è stato studiato in genere allegando un segmento anello dell'arteria a un trasduttore di forza in un bagno di tessuto; nel caso dell'aorta, di taglio elicoidale strisce della nave affinché le fibre di muscolo liscio sono state orientate in senso longitudinale tra il punto di attacco e il trasduttore di forza, di fornire la migliore stima della forza generata dalla contrazione del il muscolo liscio lungo il suo asse longitudinale. La tecnica standard per il taglio elicoidale strisce delle aorte era quello di inserire un baston....
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Protocollo
Il Medical College del Wisconsin istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) ha approvato tutti i protocolli descritti in questa carta e tutte le procedure sono conforme ai National Institutes of Health (NIH) ufficio di laboratorio Animal Welfare (OLAW) regolamenti.
1. preparazione di soluzioni e vaso camera
- Prima di svolgere una serie di esperimenti, preparare 2 L di 20x concentrata soluzione madre sale composto da 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11,52 Co.GE MgSO4. 7H2O; e 9,4 g/L CaCl2. 2H2O. Anche preparare 2 L di 20x stock tampone concentrato composto da ....
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Risultati
In vitro la microscopia del arterie della resistenza cannulate permette per lo studio dei fattori che influenzano il tono attivo nelle arterie di piccola resistenza (e più grande arteriole) alle pressioni di transmurale normale in vivo e in assenza di cellule parenchimatiche influenze. Oltre a valutare la reattività dei vasi ai vari stimoli vasodilatatori e vasocostrittori e risposte myogenic all'elevazione di pressione transmurale in normale PSS, il Ca2 +-PSS.......
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Discussione
Come indicato nell'introduzione, questo articolo descrive l'uso di microscopia di televisione e dell'arteria resistenza isolata si avvicina per valutare la funzione vascolare non solo nei modelli standard del ratto (come impiegato nel video), ma anche in altamente specializzata geneticamente ceppi di ratti ingegnerizzati, che mostrano il romanzo e le intuizioni potente che possono essere acquisite utilizzando questi approcci. L'utilizzo di queste potenti tecniche per valutare il tono attivo e passivo proprietà meccaniche.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Gli autori esprimono loro sincero grazie a Katie Fink e Lynn Dondlinger per la loro preziosa assistenza nella preparazione di questo manoscritto.
Supporto di Grant: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; e n #R01-HL128242.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| SS Rat | Medical College of Wisconsin | SS/JHsd/Mcwi ceppo | Contatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.5BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 5BN/Mcwi ceppo | Contatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.13BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 13BNCeppo /Mcwi | Contatta il Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-BN Collegio medico del ratto congenico | del Wisconsin | SS. BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi ceppo | Contattare il Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSA Ratto congenico | Medical College of Wisconsin | SS. BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi ceppo | Contattare il Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSB Ratto congenico | Medical College del Wisconsin | SS. BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi ceppo | Contatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates | Medical College of Wisconsin | SD-Nfe212em1Mcwi ceppo | Contatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | ||
| Chow di ratto ad alto contenuto di sale (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | ||
| Colorado Calibro video | Colorado Video, Inc. | Modello 308 | |
| Videocamera | Hitachi | KPM1AN | |
| Microscopio | Olympus Life Science | CKX41 | |
| Monitor televisivo | Panasonic | ||
| Stoelting | 56360 | ||
| Unità di visualizzazione della pressione sanguigna | Stoelting | 50115 | |
| Camera arteriosa cannulata | Sistemi viventi Strumentazione | CH-1 | Camera a recipiente singolo per uso generale |
| Regolatore di temperatura per | sistemi abitativi a camera singola Strumentazione | TC-09S | |
| Tubo di dispersione del gas, miniaturizzato, rettilineo | Sistemi viventi Strumentazione | GD-MS | Fornisce l'aerazione nel bagno del vaso |
| Ossigenatore a scambio di gas, | Strumentazione miniaturizzata dei sistemi viventi | OX | Consente lo scambio di gas con perfusato |
| Laser-Doppler Flussimetro | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| GS1 Lectina | Vector Labs | RL-1102 | |
| Provette capillari in vetro per micropipette | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm ID |
| Verticle Pipetta Estrattore | David Kopf Instruments | Modello 700C | |
| Materiale di sutura in nylon (10/0)-3 PLY | Ashaway Line e Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | Singoli fili di sutura in nylon a 3 strati estratti per l'uso su vasi |
| Dumont #5 Forcipe-Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forbici Vannas | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Protandim | Protandim | NRF2 Induttore: Contatta il Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
| Cloruro di sodio | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Bicarbonato di sodio | Fisher Chemical | S233-3 | |
| Destrosio (d-glucosio) anidro | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
| Cloruro di calcio (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
| Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
| Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA) | Sigma | ED255-500G |
Riferimenti
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension ....
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Ristampe e permessi
