Method Article

Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

DOI:

10.3791/56133

⸱

December 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive protocolli di video microscopia in vitro per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale del ratto. Il manoscritto descrive anche tecniche per la valutazione di densità del microvessel con aspersione di lectine e tessuto fluorescente contrassegnato utilizzando flussometria del Laser Doppler.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive l'uso di in vitro televisione microscopia per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale isolata (e altre navi) e vengono descritte le tecniche per valutare la perfusione tissutale mediante Laser Doppler flussometria (LDF ) e la densità del microvessel utilizzando fluorescente denominata lectina di Griffonia simplicifolia (GS1). Attuali metodi per lo studio isolato di arterie di resistenza alle pressioni incontrate transmurale in vivo e in assenza di influenze delle cellule parenchimatiche forniscono un collegamento critico tra gli studi in vivo e le informazioni acquisite da molecolare approcci riduzionisti che forniscono approfondimenti limitato di risposte integrative a livello animale intero. LDF e tecniche per identificare in modo selettivo le arteriole e capillari con fluorescente-etichetta GS1 lectina forniscono soluzioni pratiche per consentire ai ricercatori di estendere le conoscenze acquisite dagli studi delle arterie di resistenza isolata. Questo articolo descrive l'applicazione di queste tecniche per acquisire conoscenze fondamentali della fisiologia vascolare e della patologia nel ratto come modello sperimentale generale e in una varietà di specializzato geneticamente ceppi di ratti "designer" che possono fornire importante approfondire l'influenza dei geni specifici sui fenotipi vascolari importanti. Utilizzando questi approcci sperimentali preziosi in ceppi di ratti sviluppati da strategie di allevamento selettivo e nuove tecnologie per la produzione di modelli di knockout del gene nel ratto, si espanderà il rigore delle premesse scientifiche sviluppate in modelli murini knockout e estendere tale conoscenza per un modello animale più rilevante, con una priorità bassa fisiologica ben compreso e idoneità per studi fisiologici a causa delle sue dimensioni più grandi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I primi studi di funzione vascolare nelle arterie utilizzate condotto arterie e in molti casi l'aorta. Generazione di forza nelle grandi arterie è stato studiato in genere allegando un segmento anello dell'arteria a un trasduttore di forza in un bagno di tessuto; nel caso dell'aorta, di taglio elicoidale strisce della nave affinché le fibre di muscolo liscio sono state orientate in senso longitudinale tra il punto di attacco e il trasduttore di forza, di fornire la migliore stima della forza generata dalla contrazione del il muscolo liscio lungo il suo asse longitudinale. La tecnica standard per il taglio elicoidale strisce delle aorte era quello di inserire un bastoncino di vetro nel lume del vaso, fare un taglio nella parete del vaso all'angolazione desiderata e resisti fino alla fine del bordo esposto della parete del vaso, come il taglio è stato esteso per produrre un'intera striscia elicoidale della nave. A quel punto, lato endoteliale della nave generalmente è stato cancellato per rimuovere detriti prima di agganciare la striscia di nave per il trasduttore di forza e sommergendo la preparazione in un ossigenato e bagno tessuto a temperatura controllata. Alla fine, che approccio ha portato a una delle scoperte più famose e importanti nella storia della fisiologia di Furchgott e osservando1, vale a dire il ruolo dell'endotelio ha derivato il fattore rilassante (EDRF), successivamente identificato come l'ossido di azoto, in che regolano la funzione vascolare. L'evento cruciale che conduce a quella scoperta era una situazione in cui i ricercatori hanno mantenuto un endotelio intatto da evitando il contatto del lato endoteliale dell'arteria con superfici straniere e notato che la striscia aortica non ha esibito il previsto contrazione di acetilcolina (ACh), ma invece rilassato in risposta a ACh. Sulla base di tale osservazione, i ricercatori hanno sviluppato una preparazione di "sandwich" in cui hanno attaccato un segmento aortico con un endotelio intatto (ma in grado di generare forza contrattile) ad una striscia elicoidale standard dell'aorta e convertito ACh-indotta contrazione in un rilassamento.

Due importanti novità in questo settore che sono ampiamente utilizzati oggi sono lo sviluppo di preparazioni per misurare forza contrattile attiva resistenza piccole arterie2,3 (come quelli nel mesentere intestinale3 ) e cannulati resistenza arteria preparazioni4,5,6. In uno dei rapporti più iniziali, Mulvany e Halpern3 descritto l'impiego del filo myograph preparato per studiare la forza contrattile attiva nelle arterie di resistenza isolata dal mesentery intestinale di ratti spontaneamente ipertesi (SHR) e comandi WKY normotesi. Successivamente lo sviluppo del sistema myograph filo, cannulate resistenza arteria preparati sono stati sviluppati per consentire studi dei vasi più vicino a in vivo condizioni4,5,6.  Mentre entrambi gli approcci forniscono risultati importanti, la preparazione dell'arteria cannulate ha il vantaggio aggiunto di più efficacemente preservare tono attivo intrinseco nelle arterie; e consentendo ai ricercatori di studiare le risposte myogenic attive ai cambiamenti nelle risposte di vaso e pressione transmurale alle variazioni di portata ed endoteliali shear stress (Vedi recensione di Halpern e Kelley6).

Degli obiettivi principali del presente lavoro è descrivere come impiegare la tecnica "classica" di video microscopia utilizzando isolato, cannulate resistenza arterie al fine di ottenere informazioni precise per quanto riguarda i meccanismi che regolano il tono attivo in queste cruciali vasi, indipendente da influenze delle cellule neurali, umorale o parenchimatica. Queste informazioni di base, impiegando un modello standard del ratto ed esempi dai nostri studi di nuovo geneticamente ingegnerizzati ceppi di ratti, fornirà al lettore un'idea dei tipi di approfondimenti per quanto riguarda la funzione vascolare che può essere acquisita con la televisione approcci di microscopia, e che possono essere impiegati in studi condotti su qualsiasi controllo e gruppo sperimentale di scelta dello sperimentatore, tra cui potenti nuovi modelli di ratto sperimentale prodotto da incroci selettivi e genetiche di nuova concezione tecniche di ingegneria.

Grazie alla precisione di televisione microscopia approcci, misurazione delle variazioni di diametro nelle preparazioni cannulate arteria può fornire informazioni altamente importanti meccanismi endotelio-dipendente e indipendente dall'endotelio vascolare relax, nonché importante (e a volte inaspettate) alterazioni nei meccanismi di controllo vascolare che si verificano con ipertensione, alta dieta del sale e altri interventi sperimentali. Inoltre, misurazione dei rapporti di pressione-diametro in isolato e cannulati arterie di resistenza che sono rilassate al massimo dal trattamento con Ca2 +-libera soluzione o un farmaco vasodilatatore farmacologici, consente al ricercatore di valutare cambiamenti strutturali nelle arterie a causa di rimodellamento vascolare e per calcolare la sollecitazione-deformazione passiva relazioni7 che può fornire la comprensione importante nei cambiamenti nelle proprietà meccaniche passive delle arterie che possono influenzare la funzione arteriosa indipendente di (o in aggiunta a) cambiamenti nei meccanismi di controllo attivo. È anche importante notare che le informazioni ottenute da studi di arterie di resistenza isolata possono essere integrati da informazioni ottenute utilizzando LDF, un metodo pratico per valutare la perfusione tissutale al livello animale intero8,9 ,10, e da informazioni ottenute dalla valutazione di densità del microvessel utilizzando fluorescente etichettati GS1 lectina, che si lega specificamente a moiety glicoproteina nella membrana dello scantinato di piccole arteriole e capillari11 , 12. il metodo di quest'ultimo fornisce una stima molto accurata di densità del microvessel che non è soggetto alle classiche difficoltà incontrate nello stimare la densità del microvessel contando le navi in vivo, ad esempio mancanti non perfusi navi dove il flusso sanguigno è interrotto a causa di chiusura attivo delle arteriole. Quando utilizzati insieme, questi approcci possono fornire la comprensione importante per correlare le alterazioni funzionali nelle arterie di resistenza isolata ai cambiamenti nella perfusione tissutale a livello microcircolatorio; e alcuni esempi dell'uso di tali approcci preziosi in combinazione con tecniche di arteria cannulate saranno fornite anche nel presente manoscritto.

Il presente documento si concentra sull'uso di tecniche di video microscopia per valutare i cambiamenti vascolari nelle arterie dei topi Sprague Dawley nazionali. Tuttavia, è importante notare che queste tecniche hanno dimostrato di essere molto prezioso nel delucidamento alterazioni fenotipiche in ceppi di ratti geneticamente altamente specializzato creati da allevamento selettivo o gene editing utilizzando tecniche. In questo manoscritto, forniamo esempi di come il video tecniche di microscopia hanno fornito informazioni importanti per quanto riguarda la funzione vascolare in una serie di prezioso ratto modelli, compreso il ceppo di ratto-un topo inbred Dahl sale sensibili (SS) è il più ampiamente usato modello sperimentale per studiare i meccanismi di sale sensibili hypertenson18,19,20,21,22,23; e consomic ratti creato tramite allevamento selettivo dei ratti di SS con il ceppo di ratto marrone Norvegia (BN) sale-insensibile. Nei pannelli del ratto consomic, ogni cromosoma dal ratto di chiavica di Brown è stato introgressi singolarmente nel background genetico Dahl SS24,25,26 . Utilizzo di pannelli di ratto consomic ha fornito indizi preziosi per quanto riguarda specifici cromosomi che contribuiscono alla sensibilità del sale di pressione sanguigna e altri fenotipi, compreso la reattività vascolare24,25,26 ,27,28.

Strategie di allevamento selettivo utilizzando ratti consomic portando singoli cromosomi BN e SS hanno anche permesso la generazione di ceppi Congenici ristretto con piccoli segmenti di singoli Brown Norvegia cromosomi introgressi negli SS Dahl genetica sfondo22,29. Questi possono fornire estremamente preziosi input su geni specifici o restringere le regioni dei cromosomi che possono influire sulle variabili fisiologiche cruciali, come la pressione sanguigna, danno renale e reattività vascolare22,29. Un'altra potente aggiunta alla casella degli strumenti genetici di ratto è lo sviluppo di modelli di knockout del gene del ratto utilizzando gene avanzate tra cui ZFNs, transcriptional activator-come-effector nucleasi (TALENS), tecniche di editing e più recentemente CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. L'avvento di queste potenti tecniche che permettono di geni essere buttato nel ratto è uno sviluppo immensamente importante perché gli studi di knockout del gene fino ad oggi hanno usato (e continuano a utilizzare) topi quasi esclusivamente. Un altro componente sperimentale nella carta attuale dimostra il valore di arteria cannulate tecniche e video microscopia di valutare i meccanismi di controllo fisiologici in topi knockout difettare la trascrizione di protezione antiossidante e cella master fattore, fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2) - come - 2 (NRF2)30,31, che sono stati sviluppati utilizzando la tecnologia TALEN a Sprague-Dawley background genetico17. In questi esperimenti in vitro video microscopia tecniche sono state usate per fornire la verifica funzionale di perdita del gene NRF2 e testare un approccio terapeutico potenzialmente importante basato sul diretto upregulation di NRF2-mediata antiossidante difese. NRF-2 è di notevole importanza terapeutica nella lotta contro lo sforzo ossidativo vascolare in esseri umani, alla luce dei deludenti risultati di studi clinici che coinvolgono l'amministrazione diretta di antiossidanti quali le vitamine C ed E32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il Medical College del Wisconsin istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) ha approvato tutti i protocolli descritti in questa carta e tutte le procedure sono conforme ai National Institutes of Health (NIH) ufficio di laboratorio Animal Welfare (OLAW) regolamenti.

1. preparazione di soluzioni e vaso camera

  1. Prima di svolgere una serie di esperimenti, preparare 2 L di 20x concentrata soluzione madre sale composto da 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11,52 Co.GE MgSO4. 7H2O; e 9,4 g/L CaCl2. 2H2O. Anche preparare 2 L di 20x stock tampone concentrato composto da 80,8 g/L di NaHCO3 e 0,4 g/L EDTA e 2L di 20x concentrata Ca2 +-soluzione gratuita di stock composto da 281,6 g/L NaCl; 14 g/L KCl e 11,52 Co.GE MgSO4. 7H2O.
    Nota: 20 X soluzioni di riserva può essere conservato in frigorifero fino all'uso.
  2. Il giorno dell'esperimento, preparare 2 L di soluzione salina fisiologica (PSS) da 20 x concentrate soluzioni di riserva come segue: aggiungere 100 mL di 20x stock sale a 1.800 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer 2L o Becher su una piastra di agitazione motorizzata. Aggiungere 100 mL di 20 scorte x mentre vengono continuamente la soluzione con una miscela di gas contenente 21% O2, 5% CO2, equilibrio, N2e mescolare con una barra di agitazione magnetica. Lentamente aggiungere 0,28 g NaH2PO4 durante il monitoraggio del pH; regolare se necessario a pH 7.4 con l'aggiunta di gocce di HCl N 6 o 6,5 N NaOH soluzione da una pipetta Pasteur. Dopo il PSS viene preparata e viene regolato il pH, aggiungere 1,98 g di glucosio al PSS.
    Nota: È importante aggiungere lentamente il NaH2PO4 Ultima durante il monitoraggio del pH del PSS, perché l'aggiunta di NaH2PO4 per una soluzione alcalina (pH > 7,4) potrebbe formare un precipitato di fosfato di calcio, come indicato dal aspetto di una soluzione nuvolosa o un precipitato bianco nella parte inferiore del contenitore.
    Nota: La composizione finale del PSS è 119 mM/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg2così4; 1.6 mM/L CaCl2; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0,03 mM/L EDTA; e glucosio 5,5 mM/L. Anche se la composizione del PSS possa differire tra laboratori, questa ricetta è molto adatta per mantenere il tono vascolare, la funzione endoteliale e risposte agli agenti vasoattivi nelle arterie di resistenza isolata.
  3. Per determinare il diametro massimo e per valutare il tono attivo nell'arteria producendo dilatazione massima della nave, preparare 500 mL di Ca2 +-gratis PSS aggiungere 25 mL di 20 X Ca2 +-gratis stock sale a 450 mL di acqua deionizzata , seguita da 25 mL di 20x scorte regolatrici in un matraccio di Erlenmeyer o Becher simile al punto 1.2. su indicato. Aggiungere alla soluzione 0,07 g di NaH2PO4 mentre monitorando e regolando il pH della soluzione. Il Ca2 +-PSS gratuito viene aggiunto alla sezione del serbatoio e la nave PSS alla fine dell'esperimento per evitare di esaurire il Ca2 + i depositi intracellulari che potrebbero influenzare le risposte di nave in PSS normale. Perché il Ca2 +-soluzione gratuita è aggiunto alla fine dell'esperimento per produrre il massimo rilassamento delle arterie, non c'è nessuna necessità di aggiungere glucosio al PSS.
    Nota: Quando completato, la composizione finale del Ca2 +-libero PSS è 120,6 mM/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg2così4; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0 mM/L CaCl2; e 0,03 mM/L EDTA.
    Nota: Per molti studi che richiedono massima dilatazione dell'arteria, uno stampo di voce del calcio come verapamil (1 µM) e/o un donatore dell'ossido nitrico come nitroprusside del sodio (10 µM) può essere aggiunto alla soluzione, oltre a rimuovere Ca2 + da PSS.
  4. Mantenere il pH del PSS, PO2e PCO2di equilibrare continuamente il PSS che fluisce nella camera di vaso in un bagno di organo standard utilizzato per studiare gli anelli aortici isolati, muscolatura liscia intestinale o in altri tessuti (Figura 1). Utilizzare del fluoropolymer sintetico di tetrafluoroetilene tubi per collegare il serbatoio di gas al bagno dell'organo, perché questo tipo di tubo è impermeabile, a differenza di molte altre forme di tubi, per esempio, lattice gas.
  5. Posto una pietra piccola aria collegato alla miscela di gas di equilibrazione nella camera di nave per aiutare a mantenere la composizione del gas PSS.
    Nota: Risposte di nave ai cambiamenti in PO2 possono essere testate da equilibrare il PSS nella camera di nave e luminal perfusato con miscele di gas contenenti diverse percentuali di O2, ad esempio, 21% O2, 10% O2, 5% O2 e 0% O2, con 5% CO2 ed equilibrio N233,34,35. Per più grandi arterie con pareti più spesse, dove la diffusione dell'ossigeno nel centro della parete del vaso può essere una limitazione, una percentuale maggiore di ossigeno, per esempio, 95% O2 può essere utilizzata.
  6. Monitorare la temperatura nella camera di nave da vicino, come singole camere possono variare nelle loro caratteristiche di trasferimento di calore.
    Nota: Molti alloggiamenti di nave preparati commercialmente utilizzati per lo studio delle arterie di resistenza cannulate utilizzano una pompa peristaltica per consegnare PSS ossigenato da un serbatoio di gas equilibrati e fornire un controllo molto preciso della temperatura del bagno e l'ossigenazione del il PSS.
  7. Posizionare il PSS in una grande bottiglia di Mariotte (2 L), con tappo e tubo di vetro centrale per servire come un serbatoio per trasportare continuamente PSS nel bagno di organo che riscalda e gas-equilibra il PSS che fluisce nella camera di nave (Figura 1A).
  8. Luogo l'apertura del tubo centrale in vetro in bottiglia Mariotte allo stesso livello come il top del PSS in un bagno d'organo per mantenere una testa di pressione idrostatica costante per la consegna di PSS nel bagno di organo. Tubazione del polietilene uso collegato ad un vetro a forma di J o tubo di plastica per consegnare il PSS dalla bottiglia Mariotte nel bagno di organo.
  9. Per aspersione luminal (Figura 1A), usare tubi in polietilene per collegare la pipetta di afflusso ad un serbatoio PSS composto da una siringa da 60 cc plastica elevato a una posizione che mantiene la pressione di afflusso desiderato (solitamente 80 mmHg per gli studi del ratto cerebrale trasduttore di arterie), come misurato con una pressione collegato al sistema tramite un rubinetto di arresto.
  10. Collegare la pipetta di deflusso di un tubo di polietilene per consentire la PSS di fluire attraverso il vaso in risposta ad un gradiente di pressione e collegare la linea di deflusso di un serbatoio simile al serbatoio di afflusso. Utilizzare un simile collegamento del trasduttore di pressione e rubinetto per misurare la pressione di uscita.
    Nota: Le procedure per l'impostazione di pressione transmurale e controllo del flusso attraverso il vaso sono descritti nella sezione 2, di sotto.
  11. Alla fine dell'esperimento, sciacquare accuratamente la camera, linee di alimentazione e sistemi di serbatoio con acqua distillata. A intervalli frequenti, sostituire le righe della tubazione e consegna, pulire o sostituire il rubinetto di arresto del sistema e sottoporre periodicamente eventuali serbatoi PSS di vetro a un lavaggio acido per prevenire la crescita di batteri e altri microrganismi che causano la contaminazione e influisce sulla reattività di nave.

2. cannulate arteria preparazione

  1. Anestetizzare un ratto Sprague-Dawley con 5% isoflurane e mantenere l'anestesia utilizzando 1,5-2,5% grado medico ossigeno36. In alternativa, somministrare un'iniezione intramuscolare contenenti ketamina (75,0 mg/kg), acepromazina (2,5 mg/kg) e xilazina (10,0 mg/kg); un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50-60 mg/kg); o qualsiasi altro metodo approvato di anestesia, dipendendo da protocolli e/o preferenze di investigatore.
  2. Decapitare il ratto sotto anestesia profonda e rimuovere il cervello per gli studi delle arterie cerebrali resistenza.
  3. Dopo la rimozione del cervello, accuratamente isolare l'arteria cerebrale media (MCA) (o altre arterie di interesse, ad esempio, dell'arteria basilare o dell'arteria cerebrale posteriore)37,38. Per isolare l'importi compensativi monetari, posizionare il cervello supina in una capsula di Petri vetro riempito con PSS ghiacciata (Figura 2).
  4. Utilizzare Allerød forbici e una pinzetta punta fine Dumont #5 per asportare la MCA dal cervello.  Pulire qualsiasi tessuto cerebrale residua da MCA usando il forcipe e trasferimento dell'arteria in una camera a temperatura controllata vaso contenente PSS come descritto in precedenza. 33 , 34  .
  5. Per trasferire l'arteria alla camera di nave, premere delicatamente il vaso asportato da ACA o segmento dell'arteria comunicante posteriore e attentamente posizionarlo nella camera.
    Nota: Oltre alla MCA, il sistema cannulate nave è adatto per un'ampia varietà di preparazioni dei piccoli vasi, compreso il muscolo scheletrico resistenza arterie33,39,40, le arterie mesenteriche resistenza 38 , 41 , 42e grande (primo ordine) arteriole del muscolo cremastere43, nonché arteriole coronarie umane e arteriole umane ottenute da tessuto adiposo sottocutaneo durante la biopsia gluteal44,45, 46,47.
  6. Collegare l'arteria per la micropipetta afflusso tirandola verso la base di pipetta fino a quando la punta avanza nel lumen del MCA. Fissare l'arteria sulla pipetta di afflusso legando un ciclo preparato da una fibra di singolo filo precedentemente preso in giro da 10-0 suturare intorno all'arteria (Figura 1B). Fissare l'estremità opposta del MCA per la pipetta di deflusso stringendo un secondo anello di sutura intorno al vaso (Figura 1B).
    Nota: Posizionare i loop di sutura sulle Micropipette prima del montaggio della nave e posizionarle vicino al punto finale di allegato, consentendo loro di essere facilmente scivolato sopra l'arteria e rapidamente fissata quando la nave è in posizione, che riduce al minimo il rischio dei arteria scivolare le pipette.
    Nota: Micropipette sono preparate da tubazione capillare di vetro borosilicato (diametro esterno 2 mm; diametro interno di 1 mm e 10 cm di lunghezza) con l'estrattore micropipetta verticale. Prima di fissare l'arteria, corrispondere i diametri di punta delle micropipette quanto più possibile per evitare disallineamenti di afflusso e deflusso di resistenza del sistema di perfusione.
  7. Dopo l'arteria è saldamente legato alle micropipette, usate il micrometro collegato al titolare della pipetta di afflusso per allungare l'arteria alla sua lunghezza in situ .
  8. Fissare tutti i rami laterali con singoli fili presi in giro da 10-0 suturare al fine di mantenere costante la pressione nell'arteria.
  9. Verificare l'assenza di perdite facendo in modo che la pressione intraluminale (transmurale) rimane costante dopo aver chiuso temporaneamente la pipetta di afflusso. Legare i rami o individuare i fori nel vaso se la pressione scende. Ripristinare la perfusione dopo aver verificato che la pressione transmurale rimane costante.
    Nota: Inserimento di una canula di arterie di resistenza isolata richiede pratica e destrezza manuale. Le principali precauzioni da osservare per evitare di rompere le pipette e per assicurarsi che l'arteria non sfilare le pipette. È importante essere gentile con le arterie isolate durante tutta la procedura, come trauma alla nave può danneggiare l'endotelio e/o interferire con la normale funzione del muscolo liscio vascolare.
  10. Misurare il diametro interno dell'arteria utilizzando una configurazione di video microscopia (Figura 1A) composto da una videocamera collegata ad un microscopio per dissezione e collegato ad un micrometro dei video e un monitor televisivo (figure 1B, 1C). Questo consente all'osservatore di misurare diametri vaso manualmente inserendo le linee di riferimento mobile sulla parete interna dell'arteria e, se lo si desidera, sulla parete esterna dell'arteria pure, al fine di misurare lo spessore di parete del vaso.
    Nota: Alcuni micrometri video offrono tracciamento automatico delle dimensioni del vaso.
    Nota: Calibrare il micrometro dei video con un micrometro per microscopio e l'afflusso e deflusso trasduttori di pressione con un manometro di mercurio (0 mmHg, 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg e 200 mmHg) fra gli esperimenti al fine di assicurare misurazioni accurate della pressione del serbatoio diametro e intraluminal.
    Nota: La pressione transmurale di controllo standard per gli esperimenti del ratto MCA è 80 mmHg. Calibrazione per i livelli superiori e inferiori di pressione assicura precisione per studi di risposte myogenic ai cambiamenti in transmurale curve di pressione-diametro per pressione e passivo in arterie dilatate al massimo.
  11. Regolare l'altezza dei serbatoi di afflusso e deflusso di mantenere la pressione transmurale desiderata a livello costante. Alzare il serbatoio di afflusso da una piccola quantità (< 5 mmHg) ed abbassare il serbatoio di deflusso della stessa quantità mantiene la pressione transmurale media e crea flusso di perfusione in vaso lumen6.
    Nota: Il serbatoio di afflusso di alzare ed abbassare il serbatoio di deflusso di uguali quantità mantiene la stessa transmurale media pressione nell'arteria di distensione, ma genera un gradiente di pressione idrostatica che provoca il flusso e shear stress nel vaso, consentendo la investigatore per valutare endotelio-dipendente risposte ai cambiamenti nella sollecitazione di taglio intraluminal in differenti gruppi sperimentali48.
  12. Per valutare le risposte myogenic e nave le risposte agli stimoli vasodilatatori, assicurarsi che l'arteria presenta un livello adatto di tono attivo (circa 40%) prima dell'esperimento. Scartare qualsiasi arterie carente tono attivo a riposo con l'eccezione di navi, per esempio, piccole arterie mesenteriche che non manifestano normalmente tono di riposo attivo.
    Nota: Per le navi che non manifestano normalmente tono spontaneo, pre-restringono le arterie di un importo equivalente utilizzando un agonista di vasocostrittori quali noradrenalina o fenilefrina. Un buon approccio alla scelta della dose dell'agonista utilizzato pre-costrizione dell'arteria è di utilizzare una dose di50 CE dell'agente vasocostrittore, per esempio, norepinefrina41,42. Tuttavia, gli agenti farmacologici vasocostrittore non dovrebbero applicarsi alle arterie che esibiscono spontanea tono attivo in condizioni di riposo.
  13. Testare la reattività di endotelio-dipendente dell'arteria cannulate resistenza da misurare diametri vaso durante l'aggiunta di aumento delle concentrazioni di ACh (10-10 M-10-5 M) alla camera di nave. Testare la sensibilità di ossido di azoto endotelio-indipendente del muscolo liscio vascolare di misurare diametri vaso durante l'aggiunta di aumento delle concentrazioni (10-10 M-10-5 M) della nitroprusside del sodio del donatore di ossido nitrico per la Camera di nave.
    Nota: Sensibilità ai vasocostrittori e altri agonisti vasodilatatore può essere testata in modo simile con l'aggiunta di concentrazioni crescenti di agonista alla camera di nave.
    Nota: Oltre agli agenti vasoattivi, varie droghe, gli inibitori e altri agenti farmacologici possono essere aggiunto al bagno del tessuto e/o al perfusato luminal. Cambiamenti nel PO2 (così come PCO2 e pH) possono essere selettivamente somministrati a lato endoteliale o lato extra-luminal dell'arteria di equilibrazione separata del perfusato luminal con una pietra di aria collegata ad una miscela di gas calibrato diversi dalla miscela utilizzata per equilibrare il PSS nel tessuto bagno33,34,49. Le risposte myogenic ai cambiamenti nella pressione transmurale possono essere studiate chiudendo la pipetta di deflusso e innalzamento (o abbassamento) l'altezza del serbatoio PSS collegato all'afflusso pipetta49,50,51 a aumentare o ridurre la pressione intraluminal.
  14. Per testare il ruolo dell'endotelio nella mediazione della nave risposta a stimoli specifici, rimuovere l'endotelio vascolare e confrontare le risposte di nave a quegli stimoli in presenza o assenza dell'endotelio. Per rimuovere l'endotelio, attentamente slegare l'arteria dalla pipetta deflusso e lentamente irrorare il lume dell'arteria con un bolo di aria (0,5-1,0 mL). Dopo perfusione aria, ripristinare l'aspersione PSS per deselezionare i detriti cellulari prima di ri-legare la nave per il deflusso pipetta43.
    Nota: Seguendo la procedura di decumulazione endoteliale, è importante verificare che l'endotelio è rimosso dai test risposte vascolari ad un agonista (solitamente ACh) conosciuta per produrre vasodilatazione endotelio-dipendente in quel tipo di nave. Tuttavia, in determinate circostanze patologiche, dipendente dall'endotelio vasocostrittori vengono rilasciati, nel qual caso, è importante verificare che la risposta di constrictor è eliminata dopo rimozione endoteliale.
  15. Alla fine dell'esperimento, è necessario determinare il diametro massimo dell'arteria con l'aggiunta di Ca2 +-gratis PSS al perfusato e superfusate. Calcolare il tono riposo attivo (%) come (Dmax-D (resto) /Dmax) x 100, dove Dmax è il diametro massimo in presenza di Ca2 +-libera soluzione e Dresto è il diametro di controllo che riposa.
    Nota: Misure di diametro delle arterie al massimo rilassate in differenti gruppi sperimentali sono preziose in confronto di tono di riposo attivo, rimodellamento strutturale (vale a dire, cambiamenti di diametro di lumen e spessore di parete) e proprietà meccaniche passive (rapporti di sforzo-deformazione calcolata da diametri passivi a diversi livelli di pressione transmurale).

3. valutazione delle risposte del flusso sanguigno cerebrale con LDF

  1. Anestetizzare l'animale con 5% isoflurane e fissare il ratto in un apparato stereotassiche9,10.
  2. Mantenere l'animale in anestesia costante durante il monitoraggio di frequenza di respirazione, end tidal CO2e profondità dell'anestesia con un pizzico di punta36.
  3. Con attenzione sottile il cranio alla traslucenza utilizzando un trapano odontoiatrico a bassa velocità e olio minerale per fornire accoppiamento ottico10. Cautela per evitare di generare calore eccessivo e per evitare la penetrazione dell'osso.
    Nota: Assottigliamento del cranio consente la luce laser per raggiungere il tessuto sottostante e per essere riflessa verso la sonda per misurare lo spostamento Doppler, la cui entità è determinata dal numero di particelle in movimento (cioè, globuli rossi) e la loro velocità.
  4. Fissare la sonda LDF in un micromanipolatore e posizionarla direttamente sopra la zona assottigliata del cranio. Durante l'esperimento, è molto importante impedire il movimento della sonda LDF o preparato stesso, come il LDF è progettato per misurare il flusso in una zona limitata del tessuto ed è estremamente sensibile agli artefatti di movimento.
    Nota: Qualsiasi movimento della sonda dalla sua posizione iniziale fornirà una stima del flusso sanguigno in una zona diversa del tessuto, precludendo i confronti. Mentre LDF non fornisce valori assoluti per flussi e non è adatto per il confronto tra soggetti, è un ottimo modo per non invadente valutare i cambiamenti in perfusione tissutale in risposta a interventi sperimentali nei singoli soggetti; e relativi cambiamenti nel segnale LDF dai valori di controllo possono essere una media e rispetto ai cambiamenti nel segnale LDF dal controllo in altri gruppi sperimentali.
    Nota: LDF è un approccio conveniente per avere comprensione di fattori che regolano il flusso di sangue a livello del letto vascolare intero in differenti gruppi sperimentali8,9,10. Valutazione della perfusione tissutale con LDF fornisce un approccio pratico per assimilare la conoscenza acquisita con studi vaso isolato in una prospettiva di tutto il letto. Il blocco delle differenze regionali nei meccanismi di controllo vascolare tra arterie della resistenza e la microcircolazione, misurazioni ottenute con LDF forniscono una buona indicazione di controllo di flusso di sangue del tessuto che sono generalmente coerente con i risultati ottenuti con preparazioni di arteria cannulate.

4. valutazione di densità del Microvessel del muscolo scheletrico con lectina GS1

  1. Rimuovere il muscolo cremastere da un topo maschio di taglio aperto lo scroto con forbici chirurgiche bene standard e quindi utilizzando una pinza Dumont #5 per afferrare il muscolo.
    Nota: I muscoli sottili (ad esempio, il muscolo cremastere, come pure dell'estensore digitorum longus e tibiale anteriori muscoli che si trovano in ratti maschi e femminili) sono ideali per uso come tutta la monta per gli studi di lectina, sebbene istologico sezioni possono essere utilizzate per i tessuti più spessi.
  2. Rimuovere il muscolo cremastere dal testicolo utilizzando un solo taglio. Inserirlo nella gelida PSS e pin fuori in una capsula di Petri con un rivestimento di elastomero in silicone sul fondo superficie interna. Delicatamente prendere in giro lontano tessuto connettivo usando il forcipe Dumont #5.
  3. Sciacquare i campioni di muscolo con 2 mL di PSS tamponata e poi immergerli in rodamina-etichetta GS1 lectin (PSS 20 µ g/mL) per 50 min in una piastra di coltura delle cellule 12-pozzetti con 2ml/ben avvolto in carta stagnola per escludere la luce.
  4. Rimuovere i tessuti dalla soluzione lectina, sciacquare tre volte in PSS con 5 min "lavare" le incubazioni su un rocker e montarli su vetrini da microscopio. Assicurarsi di incubare i tessuti nel buio e conservare i vetrini al buio per prevenire la perdita di fluorescenza.
    Nota: Se le diapositive non possono essere utilizzate immediatamente, essi possono essere tenuti in frigorifero senza perdita di fluorescenza. Per una conservazione prolungata, le diapositive possono essere tenute in un congelatore per prevenire il deterioramento11.
  5. Valutare la densità del microvessel contando il numero di intersezioni tra i microvasi etichettati con linee di griglia computerizzata sovrapposte l' immagine52, o con una sovrapposizione di Cancella griglia sovrapposta il monitor viene utilizzato per visualizzare le diapositive.
    Nota: GS1 lectina approcci sono stati utilizzati per dimostrare: indotta da sale microvascolare rarefazione53, l'effetto protettivo di prevenire sale indotta soppressione dell'angiotensina II nel ripristino di densità del microvessel in animali alimentati sale17 ,53,54; il ruolo di NRF2 che mediano l'effetto protettivo di infusione dose bassa dell'angiotensina II per impedire la rarefazione del microvessel in ratti sale-federazione17; e anche per valutare il ruolo di angiotensina II nel mantenere risposte angiogeniche alla stimolazione muscolare cronica in sale fed ratti54,55. Uno dei vantaggi della tecnica di lectin del GS1 è che può essere utilizzato per valutare la densità del microvessel negli stessi animali utilizzati per studi di arterie di resistenza cannulate o LDF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro la microscopia del arterie della resistenza cannulate permette per lo studio dei fattori che influenzano il tono attivo nelle arterie di piccola resistenza (e più grande arteriole) alle pressioni di transmurale normale in vivo e in assenza di cellule parenchimatiche influenze. Oltre a valutare la reattività dei vasi ai vari stimoli vasodilatatori e vasocostrittori e risposte myogenic all'elevazione di pressione transmurale in normale PSS, il Ca2 +-PSS...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come indicato nell'introduzione, questo articolo descrive l'uso di microscopia di televisione e dell'arteria resistenza isolata si avvicina per valutare la funzione vascolare non solo nei modelli standard del ratto (come impiegato nel video), ma anche in altamente specializzata geneticamente ceppi di ratti ingegnerizzati, che mostrano il romanzo e le intuizioni potente che possono essere acquisite utilizzando questi approcci. L'utilizzo di queste potenti tecniche per valutare il tono attivo e passivo proprietà meccaniche...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori esprimono loro sincero grazie a Katie Fink e Lynn Dondlinger per la loro preziosa assistenza nella preparazione di questo manoscritto.

Supporto di Grant: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; e n #R01-HL128242.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SS RatMedical College of WisconsinSS/JHsd/Mcwi ceppoContatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-Chr 5BN/Mcwi ceppoContatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-Chr 13BNCeppo /McwiContatta il Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Collegio medico del ratto congenicodel WisconsinSS. BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi ceppoContattare il Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Ratto congenicoMedical College of WisconsinSS. BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi ceppoContattare il Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Ratto congenicoMedical College del WisconsinSS. BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi ceppoContatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type LittermatesMedical College of WisconsinSD-Nfe212em1Mcwi ceppoContatta Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.
Chow di ratto ad alto contenuto di sale (4% NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.
Colorado Calibro videoColorado Video, Inc.Modello 308
VideocameraHitachiKPM1AN
MicroscopioOlympus Life ScienceCKX41
Monitor televisivoPanasonic
Stoelting56360
Unità di visualizzazione della pressione sanguignaStoelting50115
Camera arteriosa cannulataSistemi viventi StrumentazioneCH-1Camera a recipiente singolo per uso generale
Regolatore di temperatura persistemi abitativi a camera singola StrumentazioneTC-09S
Tubo di dispersione del gas, miniaturizzato, rettilineoSistemi viventi StrumentazioneGD-MSFornisce l'aerazione nel bagno del vaso
Ossigenatore a scambio di gas,Strumentazione miniaturizzata dei sistemi viventiOXConsente lo scambio di gas con perfusato
Laser-Doppler FlussimetroPerimedPeriFlux 5000 LDPM
GS1 LectinaVector LabsRL-1102
Provette capillari in vetro per micropipetteFredrich Haer Co.27-33-12 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipetta EstrattoreDavid Kopf InstrumentsModello 700C
Materiale di sutura in nylon (10/0)-3 PLYAshaway Line e Twine Manufacturing Co.114-ANM-10Singoli fili di sutura in nylon a 3 strati estratti per l'uso su vasi
Dumont #5 Forcipe-InoxFine Science Tools11254-20
Forbici VannasFine Science Tools15003-08
ProtandimProtandimNRF2 Induttore: Contatta il Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Cloruro di sodioFisher BioreagentsBP358-212
Bicarbonato di sodioFisher ChemicalS233-3
Destrosio (d-glucosio) anidroFisher ChemicalD16-500
Solfato di magnesio (MgSO4-7H2O)Sigma AldrichM1880-500 G
Cloruro di calcio (CaCl2-2 H2O)SigmaC5080-500G
Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)SigmaS0751-500G
Cloruro di potassio (KCl)Fisher ChemicalP217-500G
Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)SigmaED255-500G
113755113756 Trasduttori di pressione WVBM1410

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433(2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10(2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5(2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Isolated Resistance ArteriesVideo MicroscopyVascular Control MechanismsCerebral Resistance ArteriesLaser Doppler FlowmetryFluorescent Lectin LabelingTissue Perfusion AnalysisMicrovessel Density AssessmentVasoactive Stimuli TestingEndothelial Function Evaluation

Related Articles