Qui descriviamo un metodo comune per indurre la lesione cronica del fegato nei topi di alimentazione di una dieta di colina-carenti ed etionina-completati (CDE). Dimostriamo che la sorveglianza sanitaria, aspersione epatica, isolamento e conservazione. Un corso di sei settimane di tempo può informare circa il disturbo al fegato, pathohistology, fibrosi, infiammatoria e risposte delle cellule progenitrici del fegato.
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Articolo metodologico
La murino colina-carenti, etionina-completati (CDE) dieta modello della lesione epatica cronica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattie croniche del fegato, come epatite virale, malattie epatiche alcoliche o analcoliche steatosi epatica, sono caratterizzate da infiammazione continua, progressiva distruzione e rigenerazione della cellula progenitore parenchima epatico, fegato proliferazione e fibrosi. Lo stadio terminale di ogni malattia cronica del fegato è la cirrosi, un fattore di rischio importante per lo sviluppo di carcinoma epatocellulare. Per studiare i processi che regolano la progressione, istituzione e l'inizio di malattia, parecchi modelli animali sono utilizzati nei laboratori. Qui descriviamo un corso di sei settimane di tempo di colina-carenti ed etionina-completati (CDE) modello del topo, che coinvolge sei - settimana-vecchio topo C57BL/6J maschio di alimentazione con colina-carente chow e 0,15% DL-etionina-completati di acqua potabile. Monitoraggio della salute degli animali e una curva di perdita di peso corpo tipici sono spiegati. Il protocollo dimostra l'esame lordo di una collezione di fegato e del sangue di CDE-trattati dalla puntura cardiaca per le analisi successive del siero. Successivamente, la tecnica di aspersione del fegato e la raccolta di diversi lobi epatici per valutazioni standard sono indicati, tra cui l'istologia del fegato valutazioni di ematossilina ed eosina o Sirius Red stainings, immunofluorescente rilevamento delle popolazioni delle cellule epatiche così come transcriptome analisi del microambiente del fegato. Questo modello di mouse è adatto per studiare infiammatoria, fibrogenici e cellula del progenitor del fegato dinamica indotta attraverso l'affezione epatica cronica e può essere utilizzato per verificare potenziali agenti terapeutici che possono modulare questi processi.
Introduzione
Il fegato è il più grande organo ghiandolare metabolico del corpo ed ha molte funzioni complesse. Ruoli chiave per il fegato includono la digestione, metabolismo, disintossicazione, deposito di nutrienti essenziali, produzione di componenti proteiche del plasma sanguigno e immunità mediata attraverso residenti macrofagi o cellule di Kupffer. Il fegato ha una grande capacità di rigenerare anche se fino al 70-90% della sua massa totale è perduto. In caso di lesioni epatiche acute, come visto in seguito epatectomia parziale o avvelenamento dell'acetaminofene, gli epatociti sani rimanenti proliferano per riparare il danno in un processo altamente coordinata1. Tuttavia, quando gli epatociti sono cronicamente feriti a causa di infezione virale a lungo termine, alcoliche o analcoliche steatosi epatica, il microambiente infiammatorio innesca l'attivazione delle cellule stellate epatiche fibrosi-guida e la proliferazione delle cellule del progenitor del fegato (LPCs) con la capacità di differenziarsi in colangiociti o epatociti2,3,4,5. L'origine precisa, fato differenziativo di LPCs, loro contributo alla rigenerazione del fegato e nell'epatocarcinogenesi sono stati argomenti di dibattito intenso e molto probabilmente dipendono dalla gravità del pregiudizio e contesto2. L'ordine dei primi eventi di rigenerazione-collegata è discussa anche discutibile, con alcuni ricercatori che indica che l'attivazione delle cellule stellate epatiche e rimodellamento della matrice è essenziale per la generazione di una LPC-favorendo nicchia6, mentre gli altri relazione che sono richiesti a grilletto fibrogenesis7espansione LPC e la cosiddetta reazione duttulare. Ci sono numerosi modelli animali per studiare aspetti specifici della lesione e la rigenerazione, nel tentativo di comprendere tutti i fattori di fondo che regolano la progressione della malattia e, infine, sviluppare nuove strategie di trattamento per pazienti8.
Il modello dietetico (CDE) colina-carenti ed etionina-completato è stato originariamente sviluppato per l'uso in ratti e successivamente modificato per induzione di lesione cronica del fegato in topi9,10. La carenza dietetica di colina provoca montaggio alterato e secrezione di lipoproteine a bassa densità molto. Combinato con l'epatocarcinogeno DL-etionina, questo regime conduce ad eccessivo grasso epatico caricamento, continua infiammazione, fibrosi periportal, LPC risposta e a lungo termine al carcinoma epatocellulare sviluppo,11,12 . Tuttavia, cosa importante, ceppi murini diversi presentano modelli distintivi di infiammatorio, fibrogenici e LPC risposta dinamica13. Questo protocollo descrive la razza del topo di disturbo al fegato cronico induzione in topi C57BL/6J, il più comunemente usato innato.
Nella ricerca di affezione epatica cronica, analisi tipiche includono valutazioni istologiche di ematossilina ed eosina nonché di Sirius Red macchiatura per visualizzare deposizioni di collagene, immunohistochemical o immunofluorescente rilevamento delle popolazioni di cellule epatiche, e analisi trascrittomica del microambiente del fegato che orchestra i cambiamenti cellulari indotti attraverso il complesso fattore di crescita e citochine reti14,15,16,17 , 18.
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Protocollo
1. sperimentazione animale
tutti gli studi sugli animali descritti in questa indagine sono stati approvati dal comitato di etica animale Università di Curtin (numero di omologazione: AEC_2014_28) prima dell'inizio della esperimenti ed eseguiti in conformità con il codice australiano per la cura e l'uso di animali.
- Animali
- utilizzare topo C57BL/6J maschio vecchio di sei settimane per gli esperimenti.
- Disegno sperimentale
- seguito arrivo presso l'impianto di animale, consentire topi acclimatare per quattro giorni prima dell'inizio di qualsiasi esperimenti.
- Mouse della casa sul letto di paglia di grano, che è stato impoverito di gambi e grani visibili e tenere topi su cicli giorno/notte di 12 ore in individualmente ventilato gabbie. Cambio biancheria da letto su giorni tre e sette, poi settimanale da allora in poi.
- Fornire topi con ad libitum accesso alla colina-carente dieta e acqua potabile completata con 0,15% di DL-etionina. Mantenere il DL-etionina-completati acqua a 4° C e sostituire l'acqua potabile ogni secondo giorno per garantire freschezza e incoraggiare a bere. Top-up il chow di colina-carente ogni secondo giorno con un completo cambiamento di chow una volta a settimana.
- Topi osservare a riposo e durante la movimentazione. Monitor segni standard della salute degli animali, tra cui aspetto generale, la postura, l'interazione sociale, toelettatura, cappotto condizione e del peso corporeo.
- Pesare topi al giorno durante le prime due settimane dell'esperimento per garantire eventuali animali che esibiscono più del 20% perdita di peso del corpo sono euthanized per limitare inutili sofferenze. Questo è tipicamente il caso in meno di 5% degli animali. Dopo due settimane, la frequenza di pesatura può essere ridotto a tre volte settimanale (ad esempio, lunedì, mercoledì, venerdì).
- Isolamento e perfusione di fegato
- anestetizzare topi nei punti di tempo indicato (in questo studio, uno, due e sei settimane la dieta CDE) con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite l'iniezione intraperitoneale. Prova il riflesso di ritiro pedale per garantire un'anestesia adeguata.
- Bagnare la pelliccia con etanolo al 70% e fare un'incisione verticale sulla linea mediana della parete addominale fino a diaframma usando le forbici Mayo. La gabbia toracica può essere rimosso per facilitare l'accesso al cuore.
- Raccolta sangue dalla puntura cardiaco lento usando un 25 x 1/2 " dell'ago di parete regolare per evitare il collasso del cuore. Permettere al sangue di coagularsi in un tubo del microcentrifuge a temperatura ambiente per ottenere campioni di siero dopo centrifugazione a 2.000 x g per 10 min. Più tardi, misurare i livelli del siero alanina transaminasi di procedure standard 12.
- Spostare stomaco e intestino tenue al lato ed esporre la vena portale. Tagliare il cuore con le forbici Mayo per consentire fluidi uscire e irrorare il fegato con tamponato fosfato sterile salina (pH = 7,4) di incannulamento vena portale utilizzando un 27 x 1/2 " dell'ago parete regolari. Un fegato uniformemente sbollentato indica successo perfusione di tutti i lobi del fegato.
- Delicatamente staccare il fegato e posizionarlo in una capsula Petri utilizzando pinze e le forbici Mayo. Rimuovere il tessuto in eccesso, non-fegato e cistifellea.
- Conservazione fegato
- dopo il peso totale del fegato è stato registrato, tagliare un piccolo lobo in diversi piccoli pezzi di pochi millimetri quadrati, trasferirli in provette sterili e snap-congelamento in azoto liquido per RNA successivo ed estrazione di proteine, secondo protocolli standard. Snap-congelare questi pezzi di tessuto più presto possibile dopo la raccolta dell'organo per evitare qualsiasi degradazione del tessuto.
- Raccogliere un lobo in 10% formalina neutra tamponata per la successiva elaborazione e inclusione in paraffina, secondo i protocolli standard.
- Inserire un lobo in uno stampo riempito con taglio ottimale temperatura cryomatrix l'incorporamento di resina e snap-congelamento in azoto liquido.
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Risultati
Durante tutto il corso di tempo di sei settimane di lesione epatica cronica indotta da CDE, i parametri sono stati valutati nei giorni 7 (fase di induzione), 14 e 21 (fase di costituzione) e 42 (fase di mantenimento). Rispetto ai topi controllo, topi trattati CDE perso fino al 20% del loro peso corporeo iniziale in una fase di adattamento iniziale e tendono a riacquistare peso nelle fasi di creazione e manutenzione (Figura 1). Il peso corpore...
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Discussione
L'affezione epatica cronica è spesso una malattia silenziosa con maggior parte dei pazienti sono asintomatici ed è uno dei maggiori contributori alla morbilità e mortalità in tutto il mondo. L'alcolismo cronico e l'infezione del virus dell'epatite C sono le principali cause. Lesione epatica cronica è caratterizzata da infiammazione epatica, fibrosi e nei casi più gravi cirrosi, carcinoma e insufficienza epatica in definitiva. Non esiste attualmente una cura disponibile e anche se sono stati compiuti progressi importanti ...
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Dichiarazioni
Non c'è nulla per essere comunicati dagli autori.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) dell'Australia (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Gli autori vorrei ringraziare il personale di Curtin Health Innovation Research Institute per l'assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi maschi C57BL/6J di sei settimane | Centro risorse animali dell'Australia occidentale, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Taglio a Vapore Wheaten Chaff | Mangimi speciali, Glen Forrest, WA, Australia | N/A Acqua | |
| per irrigazione Flacone da 1000ml (Baxter) | Casa chirurgica, Perth, WA, Australia | ||
| Dieta carente di colina, modificata (pellet) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, Nuovo Galles del Sud, Australia | E5139-25G | |
| Iniezione di Ketamil | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, Nuovo Galles del Sud, Australia | N / A | |
| Ilum Xylazil-20 iniezione | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, Nuovo Galles del Sud, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", ago da parete regolare | Terumo Australia Pty Limited, Nuovo Galles del Sud, Australia | NN-2713R | |
| Siringhe Terumo 1ml e 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, Nuovo Galles del Sud, Australia | 1018242, 1018037 | |
| composto OCT Tissue-Tek | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Formalina tamponata neutra | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Etanolo assoluto anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Vetrini Superfrost Plus | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | ||
| Blocco proteico Dako, senza siero | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, Nuovo Galles del Sud, Australia | X090930-2 | |
| Diluente anticorpale Dako | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, Nuovo Galles del Sud, Australia | s0809 | |
| ratto anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, Stati Uniti d'America. | m0701 | 1/200 di diluizione |
| anti-padella per conigliCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, Nuovo Galles del Sud, Australia | Z0622 | 1/300 diluizione |
| Capra anti-coniglio (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 diluizione |
| Capra anti-ratto IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | Diluizione 1/500 |
| Reagente antidissolvenza ProLong Gold con DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Kit per macchie rosse Picrosirius | Polysciences Inc., Warrington, PA, Stati Uniti | ab150681 |
Riferimenti
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