Method Article

Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto

DOI:

10.3791/56159

⸱

October 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un processo analitico efficiente e conveniente di estrazione del campione e determinazione simultanea di più farmaci, doxorubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e un metabolita DOX cardio-tossici, doxorubicinolo (DOXol), nel biologico campioni da un modello di tumore al seno preclinici trattati con nanoparticelle formulazioni della combinazione sinergica di farmaci.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chemioterapia di combinazione è usata frequentemente nella clinica per il trattamento del cancro; Tuttavia, gli effetti negativi associati al tessuto normale possono limitare il suo beneficio terapeutico. Combinazione della droga basata su nanoparticelle è stata indicata per attenuare i problemi incontrati dalla terapia di combinazione di farmaco libero. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la combinazione di due farmaci anticancro, doxorubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), ha prodotto un effetto sinergico contro entrambi murino e cellule di cancro al seno umano in vitro. DOX e MMC co-caricato polimero-lipidico ibrido nanoparticelle (DMPLN) bypassato varie pompe del trasportatore di efflusso che conferiscono la resistenza del multidrug e migliorato l'efficacia dimostrata in modelli di tumore al seno. Rispetto alle forme di soluzione convenzionale, tale efficacia superiore del DMPLN è stata attribuita alla farmacocinetica sincronizzata di DOX e MMC e droga intracellulare aumentata biodisponibilità all'interno delle cellule del tumore abilitato di nanocarrier PLN.

Per valutare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di co-somministrato DOX e MMC sia soluzione gratuita e forme delle nanoparticelle, un metodo di analisi della multi-droga semplice ed efficiente utilizzando inverso-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) è stato sviluppato. Contrariamente ai metodi precedentemente segnalati che analizzate DOX o MMC singolarmente nel plasma, questo nuovo metodo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente DOX, MMC e un metabolita tossico cardio DOX, doxorubicinolo (DOXol), in varie matrici biologiche ( ad esempio, sangue intero, il tumore al seno e cuore). Una doppia sonda fluorescente e ultravioletti assorbente 4-methylumbelliferone (4-MU) è stato utilizzato come standard interno (I.S.) per il rilevamento di uno stadio di analisi multipla di droga con lunghezze d'onda differenti di rilevazione. Questo metodo è stato applicato con successo per determinare le concentrazioni di DOX e MMC consegnato da approcci di nanoparticelle e la soluzione nel sangue intero e vari tessuti in un modello murino ortotopico seno tumore. Il metodo analitico presentato è un utile strumento per l'analisi pre-clinica di recapito basata su nanoparticelle di combinazioni di farmaci.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La chemioterapia è una modalità di trattamento primario per molti cancri ma spesso è associato con gli effetti contrari severi ed efficacia limitata a causa della resistenza ai farmaci e altri fattori1,2,3. Per migliorare il risultato della chemioterapia, regimi di combinazione della droga sono stati applicati nella clinica sulla base di considerazioni come tossicità non sovrapposte, diversi meccanismi d'azione dei farmaci e non-Croce farmaco resistenza4,5 , 6. negli studi clinici, u....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'animale cura Comitato di salute rete universitaria presso l'Ontario Cancer Institute e svolte secondo il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali.

1. preparazione del campione biologico

  1. raccogliere il sangue intero, gli organi principali e tumore del seno a intervalli di tempo predeterminati dopo somministrazione endovenosa (i.v.) di droga-contenenti formulazioni (ad es., DMPLN, DOX liposomiale)
    1. iniettare un seno tumore-cuscinetto del mouse i.v. con una formulazione preparata contenenti droga.
    2. Anestetizza....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Due farmaci anticancro, DOX e MMC, come pure il metabolita DOX, DOXol, sono stato rilevato contemporaneamente senza alcuna interferenza biologica nella stessa circostanza HPLC gradiente applicato utilizzando 4-MU come I.S. per rivelatori UV sia la fluorescenza. DOX, MMC, DOXol e 4-MU erano ben separati gli uni dagli altri con tempi di ritenzione di 5,7 min per MMC, 10,4 min per DOXol, 10,9 min 4-MU e 11,1 min per DOX (Figura 2). Ogni droga nel sangue intero e.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rispetto ad altri metodi cromatografici che permettono la rilevazione di una singolo farmaco specie in un momento, il presente protocollo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente tre composti di droga (DOX, MMC e DOXol) nella stessa matrice biologica senza la necessità di cambiare la fase mobile. Questo metodo di preparazione e l'analisi è stato applicato correttamente per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di due sistemi di erogazione del farmaco a base di nanoparticelle (cioè, lipo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari e conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori riconoscono con gratitudine la concessione di attrezzature dalle scienze naturali e ingegneria Research (NSERC) Council of Canada per HPLC, la sovvenzione di funzionamento dalla Canadian Institute of Health Research (CIHR) e canadesi al seno cancro ricerca (CBCR) Alleanza di X.Y. Wu e la borsa di studio di Università di Toronto a chrysantha Zhang e T. Zhang.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Doxorubicina Polymed Theraeutics111023Farmaco antitumorale
Mitomicina CPolymed Theraeutics060814Farmaco antitumorale
Doxorubicinolo (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020Metabolita del sale sodico DOX
4-Methylumbelliferone Sigma-AldrichM1508Standard interno
Acido miristicoSigma-Aldrich544-63-8   Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche
Poliossietilene (100) Spettro stearatoM1402Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche
Poliossietilene (40) StearatoSigma-AldrichP3440Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6Materiali per nanoparticelle ibride polilipidiche
Ultrasonicazione (UP100H)Hielscher, Tecnologia ad ultrasuoniNAPreparazione di nanoparticelle
Bagno d'acqua (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNAPreparazione di nanoparticelle
Doxorubicina liposomiale  (Caelyx)JanssenAcquistato dalla farmacia Princess Margaret HospitalFormulazione di nanoparticelle clinicamente approvata 
Metanolo classificato HPLCCaledon Chemicals6701-7-40Composizione della fase mobile HPLC
2OCaledon Chemicals8801-7-40Composizione della fase mobile HPLC
Acetonitrile classificato HPLC Caledon Chemicals1401-7-40Composizione della fase mobile HPLC
Acido trifluoroaceticoSigma-Aldrich302031Composizione della fase mobile HPLC
0,45 μ m Carta da filtro a membrana in nylonWhatmanWHA7404004HPLC preparazione della fase mobile
Siringhe di plastica da 1 ccBecton, Dickinson and Company2606-309659Iniezione di trattamento
Siringhe di plastica da 5 ccBecton, Dickinson and Company2608-309646Raccolte di tessuti
30G 1/2 aghiBecton, Dickinson and Company305106Iniezione di trattamento
25G 5/8 AghiBecton, Dickinson and Company305122Collezioni di tessuti
Sterile 0,9% Soluzione salinaUniversità di Toronto House Brand1011Perfusione tissutale
13 ml Tubo conico a fondo arrotondato SARSTEDT62.515.006Proliprolene, omogeneizzazione tissutale
Alpha Minimum Essential Medium (MEM) Gibco12571063Terreno cellulare
1 x tampone fosfato Soluzione salinaGibco10010023Omogeneizzazione tissutale
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLOmogeneizzazione tissutale
Acido formicoCaledon Sostanze chimiche1/5/3840Regolare il pH per l'estrazione solvente
Tubi di plastica spruzzati con eparina di sodioBecton, Dickinson and Company367878per raccolta del sangue
 Sartorius CPA225Dmisuratori
pH NA Fisher Scientific13-637-671accumet BASIC
Vortex MixterFisher Scientific02-215-365Vortex di campioni alla velocità desiderata
1,5 ml  Provetta per microcentrifugaFisherbrand2043-05408129Omogeneizzatore Prolyprolene
Model 1000Fisher Scientific08-451-672Centrifuga per omogeneizzazione tissutale
5702REppendorf5702RPreparazione per l'estrazione
Sistema di evaporazione riscaldatoGlas-ColNARicostituzione del campione
Fiale con filettatura a vite HPLCDIKMA5320Iniezione di campioni HPLC
Tappi a vite HPLC con setti in silicone bianco PTFEDIKMA5325Iniezione di campioni HPLC
Inserto in polipropilene HPLC   Agilent Technologies5182-0549Volume massimo 250 μ l, Iniezione di campioni HPLC
Xbridge C18 ColumnWaters Corporation186003117Analisi dei farmaci
Pompa a gradiente Waters CorporationW600Analisi dei farmaci
AutocampionatoreWaters CorporationW2707Analisi dei farmaci Rivelatore
a matrice di fotodiodi Waters CorporationW2998Analisi dei farmaci
Multi & lambda; rivelatore di fluorescenza Waters CorporationW2475Analisi dei farmaci
EMPOWER 2Waters CorporationNASoftware di analisi dei dati
ScienziatoMicromathNAAnalisi farmacocinetica
Femmine Balb/c TopiLaboratory001026Cellule
cancro al seno EMT6/WTFornito dal Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer InstituteNAIn vivo
H Bilancia analitica di Jackson di in vivo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

Related Articles