Articolo metodologico

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

DOI:

10.3791/56277

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24 settembre 2017

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1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Abstract

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L'obiettivo di questo protocollo presenta una procedura ottimizzata per la purificazione e la coltivazione di pBECs e di stabilire in vitro barriera ematomeningea (BBB) modelli basati su pBECs in mono-cultura (MC), MC con medium condizionato di astrociti (ACM), e senza contatto co-coltura (NCC) con i astrocytes di suino o ratto origine. pBECs è stato isolato e coltivato da frammenti di vasi capillari dalle cortecce cerebrali di suini domestici 5-6 mesi di età. Questi frammenti sono stati purificati dal rimozione accurata di meningi, isolamento e omogeneizzazione della materia grigia, filtrazione, digestione enzimatica e centrifugazione. Per ridurre ulteriormente le cellule contaminanti, i frammenti capillari sono stati coltivati con contenenti con puromicina medio. Quando 60-95% confluenti, pBECs crescente dai frammenti capillari sono state attraversate per filtro a membrana permeabile inserisce e stabilita nei modelli. Per aumentare la tenuta di barriera e il fenotipo caratteristico BBB di pBECs, le cellule sono state trattate con i seguenti fattori di differenziazione: membrana permeante 8-CPT-cAMP (cAMP qui abbreviato), idrocortisone e un inibitore della fosfodiesterasi, RO-20-1724 (RO). La procedura è stata effettuata in un periodo di 9-11 giorni, e quando si stabilisce il modello di NCC, gli astrociti sono stati coltivati 2-8 settimane in anticipo. L'aderenza alle procedure descritte nel protocollo ha permesso la creazione di strati endoteliali con permeabilità paracellulare molto limitato, con il servizio NCC Mostra una resistenza elettrica media transendoteliale (TEER) 1249 ± 80 Ω cm di modello 2e permeabilità paracellulare (Papp) per Lucifero giallo di 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sec-1 (media ± SEM, n = 55). Ulteriore valutazione di questo fenotipo pBEC ha mostrato buona espressione della stretta proteine giunzionali claudin 5, ZO-1, occludina e adherens giunzione proteina p120 catenina. Il modello presentato può essere utilizzato per una serie di studi della BBB nella salute e nella malattia e, con la permeabilità paracellulare altamente restrittive, questo modello è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare.

Introduzione

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Struttura cellulare e la funzione della barriera sangue - cervello

All'interfaccia del sistema nervoso centrale e circolatorio (CNS), la BBB agisce come un sito di regolamentazione chiave per controllo omeostatico del microambiente CNS, che è essenziale per la funzione adeguata e la protezione del sistema nervoso. Il sito della BBB è le cellule endoteliali che allineano il lume del vaso sanguigno. Nei capillari del cervello, le cellule endoteliali formano complesse giunzioni intercellulari strette e modelli di espressione fortemente polarizzata di particolare afflusso e deflusso trasportatori garantiscono un trasporto molecolare altamente spec....

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Protocollo

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suini cervelli sono stati ottenuti come sottoprodotti dell'industria alimentare danese. Macelli danesi sono sotto stretta sorveglianza e l'osservazione dal Ministero danese dell'ambiente e cibo.

ratti utilizzati per l'isolamento degli astrociti sono stati allevati e stabulati in gruppo nella struttura animale locale ad una temperatura ambiente di 22 ° C - 23 ° C e su un ciclo di buio/luce 12/12 h sotto controllo del veterinario e secondo danese regolamenti per gli animali da laboratorio. I ratti sono stati eutanasizzati prima sono stati sacrificati conformemente alle linee guida internazionali sull'uso etico degli animali (direttiva del C....

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Risultati

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Stabilimento di BBB In Vitro modelli

Nel metodo presentato, ottimizzato, la coltivazione di pBECs e l'istituzione del sistema di inserimento membrana permeabile con MC o senza ACM o NCC con i astrocytes (Figura 1) è stati effettuati per un periodo di 9-11 giorni (Figura 2). Per la selezione delle cellule endoteliali, una cultura iniziale di frammenti capillare pur.......

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Discussione

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Purificazione e la proliferazione di pBEC

Durante la procedura di purificazione, fasi critiche includono la rimozione rapida ed efficace dei meninges e separazione della sostanza bianca e grigia, che è importante per la resa di purificazione e la purezza e per la corretta creazione del modello. Per il presentato in vitro BBB modello utilizzando pBECs, abbiamo migliorato e semplificato di una procedura di purificazione basata su meccanica omogeneizzazione della materia grigia isolato, fil.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Gli autori vorrebbero riconoscere, Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen per assistenza tecnica, e la Fondazione di Lundbeck concedere numero R155-2013-14113.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
FibronectinaSigma-AldrichF1141
Collagene IVSigma-AldrichC5533
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP1524
DMEM / F-12LonzaBE12-719F
DMEM / Basso glucosioSigma-AldrichD6046
Penicillina / StreptomicinaGibco Invitrogen15140
Siero plasmaderivato (PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
Siero fetale bovino (FBS)Gibco Invitrogen10-270-106
Tripsina/EDTAGibco Invitrogen15090-046
EparinaSigma-AldrichH3393
PuromicinaSigma-AldrichP8833
IdrocortisoneSigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
Gentamicina solfatoLonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296Miscelare la soluzione al 70 % dalla EtOH
DNAsi alSigma-AldrichD4513
Collagenasi CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2OElga System
T75Thermo Scientific156499
Inserti Costar Transwell (inserti a membrana permeabili alle cellule)Piastra CostarCLS3401a 12 pozzetti, diametro 12 mm, 0,4 μ m membrana in policarbonato
provette da centrifuga da 15 mlCellstar188271
provette da centrifuga da 50 mlCellstar227261
piastre PetriThermo Scientific150350
Fiale CryoThermo Scientific377224
flacone da 500 mlThermo Scientific159910/159920
bisturiSwann-MortenREF0211Tipo 24
Omogeneizzatore tissutaleSigmaD9188
140 μ m filtriMERCKNY4H04700
40 μ m filtersCorning431750
Sistema di camere EndOhmWorld Precision InstrumentsENDOHM-12EndOhm per tazze di coltura da 12 mm
Sistema di elettrodi EVOM2World Precision Instruments300523+STX100Ccon coppia di elettrodi rigidi STX-100C
Ago lungoSigmaCollegare a una siringa
Pinze curve a punta fineKLS Martin12-409-12-07
Pinza a punta largaVWR82027-390
PortafiltroMERCK MiliporeSwinnex-47
Siringa da 50 mlBraun4617509F
Siringa da 10 mlTerumoSSt20ESI
Anticorpo anti-occludinaAbcamab317211:100
Anti-p120 Laboratoridi trasduzionecatenina 610133 1:200
Anticorpo anti-ZO-1Invitrogen61-7300Anticorpo
anti-Claudina 5Sigma-AldrichSAB45029811:100
IgG anti-coniglio d'asino coniugato con farina Alexa 568Thermo ScientificA100421:500
IgG anti-topo d'asino coniugato con farina Alexa 488Thermo ScientificA212021:500
SaccarosioPerkin ElmerNEC100X250UC0,15µ l/ml conc di lavorazione finale
Lucifero GialloSigmaL014410 µ g/ml conc di lavoro finale
96 % 1 Realizzato con palloni Camera Sistema di misurazione TEER World Precision Instruments BD Anticorpo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E.

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Isolamento di frammenti capillaridigestione enzimaticaselezione con puromicinainserti a membrana permeabilefattori di differenziamentoresistenza elettrica transendotelialepermeabilit paracellulareco coltura senza contatto

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