Articolo metodologico

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

DOI:

10.3791/56277

⸱

24 settembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science, King's College London, 3HICoE Centre for Drug Research, Universiti Sains Malaysia

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo protocollo presenta una procedura ottimizzata per la purificazione e la coltivazione di pBECs e di stabilire in vitro barriera ematomeningea (BBB) modelli basati su pBECs in mono-cultura (MC), MC con medium condizionato di astrociti (ACM), e senza contatto co-coltura (NCC) con i astrocytes di suino o ratto origine. pBECs è stato isolato e coltivato da frammenti di vasi capillari dalle cortecce cerebrali di suini domestici 5-6 mesi di età. Questi frammenti sono stati purificati dal rimozione accurata di meningi, isolamento e omogeneizzazione della materia grigia, filtrazione, digestione enzimatica e centrifugazione. Per ridurre ulteriormente le cellule contaminanti, i frammenti capillari sono stati coltivati con contenenti con puromicina medio. Quando 60-95% confluenti, pBECs crescente dai frammenti capillari sono state attraversate per filtro a membrana permeabile inserisce e stabilita nei modelli. Per aumentare la tenuta di barriera e il fenotipo caratteristico BBB di pBECs, le cellule sono state trattate con i seguenti fattori di differenziazione: membrana permeante 8-CPT-cAMP (cAMP qui abbreviato), idrocortisone e un inibitore della fosfodiesterasi, RO-20-1724 (RO). La procedura è stata effettuata in un periodo di 9-11 giorni, e quando si stabilisce il modello di NCC, gli astrociti sono stati coltivati 2-8 settimane in anticipo. L'aderenza alle procedure descritte nel protocollo ha permesso la creazione di strati endoteliali con permeabilità paracellulare molto limitato, con il servizio NCC Mostra una resistenza elettrica media transendoteliale (TEER) 1249 ± 80 Ω cm di modello 2e permeabilità paracellulare (Papp) per Lucifero giallo di 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sec-1 (media ± SEM, n = 55). Ulteriore valutazione di questo fenotipo pBEC ha mostrato buona espressione della stretta proteine giunzionali claudin 5, ZO-1, occludina e adherens giunzione proteina p120 catenina. Il modello presentato può essere utilizzato per una serie di studi della BBB nella salute e nella malattia e, con la permeabilità paracellulare altamente restrittive, questo modello è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struttura cellulare e la funzione della barriera sangue - cervello

All'interfaccia del sistema nervoso centrale e circolatorio (CNS), la BBB agisce come un sito di regolamentazione chiave per controllo omeostatico del microambiente CNS, che è essenziale per la funzione adeguata e la protezione del sistema nervoso. Il sito della BBB è le cellule endoteliali che allineano il lume del vaso sanguigno. Nei capillari del cervello, le cellule endoteliali formano complesse giunzioni intercellulari strette e modelli di espressione fortemente polarizzata di particolare afflusso e deflusso trasportatori garantiscono un trasporto molecolare altamente specifico tra il sangue e il cervello 1. I componenti strutturali dei complessi stretta della giunzione includono le proteine dalla famiglia occludin e claudin, zonula occludens (ZO) proteine, cingulin e associati di molecole di adesione giunzionale (marmellate). 5 Claudin è particolarmente importante nella restrizione giunzionale paracellulare. Induzione e il mantenimento di questo caratteristico fenotipo endoteliale BBB coinvolgono interazioni dinamiche con le cellule circostanti, compreso i periciti, astrociti, neuroni e le membrane dello scantinato, che insieme con cervello endothelial cellule forma il neurovascular unità (NVU)2,3. I meccanismi coinvolti in queste interazioni non sono ancora completamente chiari, ma includono scambio di segnali chimici fra le cellule, che consente la modulazione della permeabilità BBB a breve termine e induce a lungo termine BBB caratteristiche4. Astrociti soprattutto sono conosciuti per contribuire al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello e sono una fonte di fattori regolatori quali neurotrophic glial-derivato fattore (che interessano cAMP intracellulare)5, fattore di crescita di base del fibroblasto6, idrocortisone7e per la β (TGF-β) di fattore di crescita trasformante8. L'effetto di TGF-β, tuttavia, è stato dibattuto9.

Da In Vivo In Vitro BBB

In vivo gli studi continuano a fornire preziose informazioni sulla biologia BBB. Tuttavia, modelli di coltura cellulare possono fornire ulteriori approfondimenti e costituiscono strumenti utili per comprendere gli aspetti molecolari e funzionali dettagliati della BBB in salute e malattia. Anche se le complesse interazioni tra i tipi di cella e costituenti della BBB sono difficili da raggiungere completamente in modelli in vitro , c'è stato, dal prima purificazione delle cellule endoteliali cerebrali e l'applicazione di questi in mono-culture 10 , 11 , 12, ampio sviluppo delle procedure di purificazione e le condizioni di crescita della BBB cellulari modelli di cultura, con conseguente maggiore somiglianza con la barriera in vivo . I modelli BBB comunemente usate in vitro sono basati su cellule primarie di origine roditore, suina e bovina e su linee cellulari immortalizzate. Ogni modello presenta diversi vantaggi e svantaggi. Per la scelta di modello e confronto, marcatori di convalida come espressione di enzimi BBB, trasportatori, recettori e proteine strutturali vengono utilizzati per creare panoramiche del corrente affermati modelli1.

Obiettivo del protocollo

Una caratteristica importante della BBB è barriera strettezza e alto TEER, ancora un gran numero di modelli disponibili non riflettono bene i livelli in vivo . Integrando il contributo di sviluppo e ottimizzazione da parecchi laboratori, l'obiettivo di questo protocollo è di presente un metodo per stabilire un alto TEER in vitro BBB modello basato su pBECs primario in MC con o senza ACM o in NCC con primario astrociti di ratto o di origine suina. Le procedure applicate e istituzione del modello includono gli sforzi per eliminare le cellule contaminanti e per migliorare la differenziazione delle pBECs in un fenotipo BBB. Questo lavoro ha provocato l'istituzione di modelli TEER ad elevate affidabilità, con permeabilità paracellulare basso e buona espressione funzionale di proteine giunzionali stretti chiave, trasportatori e recettori. Tuttavia, come gli astrociti sono un fattore che contribuisce al fenotipo endoteliale delle cellule del cervello, le tre diverse condizioni di cultura rappresentano tre diversi fenotipi delle cellule endoteliali cerebrali. Il modello di NCC è utile soprattutto per gli studi di alcuni meccanismi specializzati coinvolti nella scoperta della droga, gli studi sui trasporti e traffico intracellulare, oltre che per studio delle interazioni cellula-cellula, dove si trova la massima espressione delle caratteristiche BBB vantaggioso.

Origine e storia del protocollo

Il modello pBEC qui descritto si basa sul modello porcino sviluppato presso i laboratori di Eisai (Londra) da Dr. Louise Morgan e colleghi, che è basato su un successo precedenti cervello bovino delle cellule endoteliali modello13. Il metodo originale di preparazione delle cellule è una filtrazione di due fasi utilizzando nylon mesh per catturare i microvasi, seguiti da una fase subculturing per migliorare la purezza. Nello sviluppo del metodo precedente, tenuta ottimale del fenotipo e barriera BBB sono stati raggiunti dalla crescita in mezzo completato, tra cui ACM. Ulteriori modifiche al metodo sono state fatte da R. Skinner nel laboratorio del Prof N. Rothwell in Manchester Regno Unito14,15. Il metodo fu adottato dal laboratorio Abbott, KCL London, dove Patabendige reso significativamente più semplice preparare evitando l'uso di astrociti o ACM ed eliminando le cellule contaminanti quali periciti con con puromicina. Dai primi documenti ha confermato che il modello MC conservato diverse caratteristiche importanti in vivo BBB, tra cui efficace giunzioni strette, sistemi di trasporto di membrana e recettore transcitosi16,17 , 18 , 19 , 20. più tardi S. Yusof nuovamente testato co-coltura del astrocyte e trovato esso migliorato significativamente TEER, quindi questa è la variante preferita attualmente utilizzata nel laboratorio Abbott21. Il modello è stato correttamente trasferiti la Nielsen M. laboratorio a Aarhus, dove ulteriori modifiche sono state introdotte (questo protocollo), tra cui semplificando grigio importa estrazione, utilizzando solo una maglia filtrazione passaggio e un passaggio di rivestimento singolo filtro combinazione di collagene e fibronectina. La procedura applicata per l'isolamento dei astrocytes porcino (questo protocollo) era basata su protocolli sviluppati dal laboratorio T. Moos a Aalborg, descritto da Thomsen et al.22. Il TEER e altre proprietà del modello generato a Londra e Aarhus sono simili, che presta fiducia alla nozione che il modello viene prontamente trasferito tra i laboratori e risponde bene a un'attenta osservazione e la razionalizzazione dei passaggi del metodo. Infatti, S. Yusof ora ha stabilito il modello MC in un paese tropicale (Malesia)23, che ha coinvolto ulteriore adeguamento per le condizioni locali e fonti di tessuto.

Vantaggi rispetto ai metodi alternativi e attualmente stabilito modelli

Rispetto alle cellule endoteliali cerebrali di origine bovina e del roditore, pBECs forniscono il vantaggio di avere un tasso più basso di perdita del fenotipo in vivo BBB dopo isolamento24. Inoltre, sono in grado di formare barriere endoteliali relativamente strette, anche quando coltivate in MC (800 Ω cm2)16 rispetto ai livelli comunemente segnalati per monostrati di linee cellulari quali bEND.5 e bEND.3 (50 Ω cm2) pBECs 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30e cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32e cerebrali primari cellule endoteliali del mouse (100-300 Ω cm2)SS = "xrif" > 33,34,35,36 e ratto (100-300 Ω cm2)37,38. Tuttavia, il TEER ha mostrato dipendenza sulle procedure di purificazione e di cultura. Nella maggior parte dei casi, l'aggiunta di ACM o di co-coltura con i astrocytes Mostra effetti differenziazione le cellule endoteliali e un aumento nella strettezza del endoteliale strati1. Tuttavia, con gli sforzi per ottimizzare le condizioni di coltura, solo i modelli basati su bovini hanno mostrato valori TEER paragonabili ai modelli basati su porcina (medie di 800 Ω cm2 in MC, fino a 2500 Ω cm2 in co-coltura Astrocita)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Come i modelli basati su primario cervello bovino cellule endoteliali hanno dimostrato grandi variazioni, sia tra e all'interno di laboratori14,45,46,47,48, riproducibilità potrebbe essere un problema. Nel modello pBEC segnalato qui, i laboratori che contribuisce hanno raggiunto TEER molto simile e valori di permeabilità paracellulare con bassa variabilità sia tra i laboratori che in. Quindi, dovrebbe essere possibile per altri laboratori di stabilire un modello affidabile con bassa variabilità utilizzando il metodo presentato qui. Oltre a formare strati endoteliali stretti, modelli con pBECs precedentemente sono stati convalidati dall'espressione di proteine di giunzione stretta, funzionale BBB trasportatori, recettori ed enzimi e comprovata idoneità per una gamma di studi15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Inoltre, inediti transcriptome dati sulle co-culture di pBECs mostrano un profilo previsto dei trasportatori BBB e recettori (risultati non pubblicati, Nielsen et al.).

Il modello BBB porcina basato presenta un ulteriore vantaggio come il genoma, anatomia, fisiologia, e progressione di malattia del maiale riflettono la biologia umana ad un grado più elevato rispetto ad altri modelli stabiliti dispone di60, che sono favorevoli per il industria farmaceutica. Come suini cervelli sono un comune sottoprodotto dell'industria della carne, essi costituiscono una fonte facilmente accessibile del cervello cellule endoteliali, riducendo al minimo il numero di animali necessari per gli esperimenti e fornendo una resa alta purificazione da un cervello porcino. Sebbene la purificazione e la coltivazione di cellule primarie è un po' laborioso e richiede competenze di normalizzazione nella creazione del modello, cellule primarie generare i modelli BBB più affidabili. Linee cellulari immortalizzate non possono essere un sostituto, come proprietà importanti come tenuta di barriera, profili di espressione del trasportatore e regolamento microambiente non riflettono i risultati sperimentali in vivo61, 62. in vitro modelli offrono il vantaggio di vivere-cella delle immagini con risoluzione superiore, rendendo possibile la visualizzazione di processi intracellulari consentendo un approccio di vicinanza alle cellule campionate o osservati, utilizzando obiettivi con ingrandimento maggiore e migliore qualità ottica63. Questo non è il caso per l'uso di microscopia del due-fotone in animali vivi. Inoltre, in vitro modelli offrono la possibilità a transfect cellule, permettendo la visualizzazione di proteine e di indagine dei loro traffici.

Applicazioni del modello

La funzione della BBB non è fisso e può essere modulata in modo dinamico in fisiologia e la patologia. In molte malattie neurologiche, compreso neurodegenerative, infiammatorie e infettive, rottura e aumento della permeabilità della BBB è osservato64,65,66,67 . Al fine di ridurre e prevenire la progressione della malattia e conseguenti danni, identificazione e caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base della modulazione della BBB sono di grande importanza. In questo contesto, affidabile in vitro modelli sono molto richiesti dall'industria farmaceutica e inoltre svolgono i ruoli importanti nel predire la permeabilità BBB di droghe al sistema nervoso centrale. Qualsiasi modello in vitro che serve come uno schermo di permeabilità dovrebbe visualizzare una via paracellulare restrittive, una cellula fisiologicamente realistica architettura ed espressione funzionale del trasportatore meccanismi68. Dimostrato in precedenti studi16,17,57e di permeabilità paracellulare ed espressione delle proteine TJ e AJ qui, il modello presentato soddisfa tutti questi criteri ed è adatto per una gamma di BBB studi in entrambi normale fisiologia e nella patologia. I punti di forza del metodo di purificazione e coltivazione presentato includono una combinazione di semplicità e riproducibilità e la capacità di includere astrocytic influenza con un robusto e affidabile alto TEER in vitro BBB modello risultante. Per questo scopo, gli astrociti di porcino e ratto origine hanno dimostrato di aumentare il fenotipo BBB di pBECs in un modo simile22.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

suini cervelli sono stati ottenuti come sottoprodotti dell'industria alimentare danese. Macelli danesi sono sotto stretta sorveglianza e l'osservazione dal Ministero danese dell'ambiente e cibo.

ratti utilizzati per l'isolamento degli astrociti sono stati allevati e stabulati in gruppo nella struttura animale locale ad una temperatura ambiente di 22 ° C - 23 ° C e su un ciclo di buio/luce 12/12 h sotto controllo del veterinario e secondo danese regolamenti per gli animali da laboratorio. I ratti sono stati eutanasizzati prima sono stati sacrificati conformemente alle linee guida internazionali sull'uso etico degli animali (direttiva del Consiglio delle Comunità europee del 24 novembre 1986; 86/609/CEE) e linee guida danese. Senza esperimenti in vivo su animali o materiale umano sono stati utilizzati in questi esperimenti.

Nota: segue il protocollo principale pBEC che descrive la purificazione (passaggio 1), coltivazione (passaggio 2) e (passaggio 3) TEER misurazioni. Per l'installazione di un NCC con gli astrociti, viene presentato un protcol alternativo (passaggio 4) che descrive la purificazione e la coltivazione di ratto e astrociti porcini.

1. purificazione di capillari cerebrali suina

  1. raccogliere cervelli di 8-10 da 5-6-month-old suini domestici (ad es. da un macello nelle vicinanze) e trasportarli sul ghiaccio al laboratorio. Si consiglia di iniziare la procedura di purificazione seguente all'interno di 2-3 h di terminazione dell'animale.
  2. Posizionare i cervelli in un flussometro sterile e lavarli delicatamente con 1 L di PBS in un becher immesso sul ghiaccio.
  3. Attentamente rimuovere meningi da un cervello alla volta usando il forcipe ammenda-punta e trasferire i cervelli di meningi-libera un altro becher da 1 litro con PBS posizionato su ghiaccio. Estendere il tempo impiegato può complicare la rimozione. Il tempo approssimativo per ogni cervello dovrebbe essere 10-15 min.
  4. Usando un bisturi, raschiare la materia grigia da un cervello alla volta e trasferire il materiale isolato di Petri (8,8 cm 2) contenente 20 mL di miscela di nutrienti DMEM F-12 (DMEM/F-12) posizionato su ghiaccio. Isolare come materia molto grigia come possibile senza ritirare materiale di materia bianca. Per frammentazione iniziale, eseguita il materiale di materia grigia attraverso una siringa da 50 mL senza ago. Continuare per tutti i cervelli e la piscina il materiale raccolto materia grigia. Estendere il tempo impiegato può complicare la rimozione. Il tempo approssimativo per ogni cervello dovrebbe essere 10-15 min.
  5. Trasferire il materiale isolato di materia grigia nella provetta di smerigliatrice di un omogeneizzatore del tessuto mano in un rapporto di 50/50 con DMEM/F-12 media. Omogeneizzare il materiale facendo 8 su e giù colpi con un pestello sciolto, seguito da 8 su e giù colpi con un pestello stretto. Continuare fino a quando tutti isolato materiale ha stato omogeneizzato, quindi trasferire l'omogeneizzato per una bottiglia da 500 mL e diluire con DMEM/F-12 al volume totale di circa 450 mL.
  6. Filtrare l'omogeneizzato utilizzando una bottiglia da 500 mL blu-tappo con portafiltro e 140 µm-maglia del filtro e isolare i capillari eseguendo il tessuto attraverso il filtro. Utilizzare un filtro per 50 mL di omogenato e lavare dopo ogni filtro con DMEM/F-12.
  7. Posto il capillare contenente filtri in capsule di Petri con una soluzione di digestione della tripsina/EDTA (2,5% tripsina, 0,1 nM EDTA in PBS), collagenasi CLS2 (2.000 U/mL) e dnasi 1 (3.400 U/mL) in DMEM/F-12. Utilizzare 1 capsula di Petri (8,8 cm 2, 20 mL di soluzione) per ogni 3 filtro meshes.
  8. Inserire le piastre di Petri a 37 ° C per 1 h su agitatore orbitale a 180 giri/min o mescolate delicatamente ogni 10 min. Dopo 1 h, lavare i capillari dai filtri con sospensione da di Petri utilizzando una pipetta da 1 mL.
  9. Dividere la sospensione da 3 piatti in 2 tubi da 50 mL e fermare la digestione aggiungendo 10ml DMEM/F-12 ad ogni provetta da 50 mL.
  10. Centrifuga le sospensioni di cellule a 250 x g, 4 ° C per 5 min, aspirare i sovranatante e risospendere ogni pellet in 10 mL di DMEM/F-12. Aggiungere altri 20 mL di DMEM/F12 in ogni provetta. Ripetere due volte questa centrifuga.
  11. Let i tubi raffreddare in ghiaccio per 5 minuti e trasferire le soluzioni a 2 nuove provette da 50 mL.
  12. Centrifugare le sospensioni di cellule a 250 x g, 4 ° C per 5 minuti e Risospendere ciascun pellet in 8-10 mL (circa 1 mL/cervello utilizzato) di congelamento soluzione composta da 10% DMSO in FBS.
  13. Trasferire la sospensione cellulare cryovials, usando 1 mL / cryovial. In media, una purificazione provoca 1 fiala al cervello utilizzato, fornendo in media le cellule endoteliali per 12-16 inserti. Posizionare le fiale in una casella di congelamento a-80 ° C per almeno 4 ore fino a notte. In seguito, memorizzare le cryovials in un cryotank con azoto liquido.
    Attenzione: Azoto liquido ha temperature estremamente basse. Si prega di indossare una protezione appropriata.

2. Coltivazione di pBECs primaria (8-10 giorni)

  1. Cultura iniziale (3-5 giorni)
    giorno 1
    1. per ottimizzare le condizioni per l'applicazione di pBECs, eseguire il rivestimento di un pallone da T75 aggiungendo una soluzione con finale concentrazioni di collagene IV (150 µ g/mL) e fibronectina (50 µ g/mL) in ddH 2 O al pallone, assicurandosi che la soluzione copre tutta la superficie. Utilizzare 10 mL per ciascuna beuta T75. Incubare a 37 ° C per 2 h.
      Nota: Il rivestimento può essere eseguito appena prima dell'uso, o fino a una settimana prima e conservato con PBS a 4 ° C. Il rivestimento non deve seccare, o non si forma una superficie adatta di attaccamento e la crescita.
    2. Preparare 16 mL di pBEC crescita medio composto da DMEM/F-12 completati con 10% siero plasma-derivato (PDS), penicillina (100 U/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e l'eparina (15 U/mL). Supplemento mezzo con con puromicina (4 µ g/mL) per selezionare per le cellule endoteliali. Essere consapevoli del fatto che il trattamento con puromicina. può essere utilizzato solo per un massimo di 5 giorni.
    3. Aliquota il mezzo preparato in volumi di 6 mL e 10 mL in due provette da 15 mL.
    4. Portare un flaconcino con capillari da azoto liquido (punto 1.13) e scongelare i capillari, mediante l'utilizzo di un bagno di acqua di 37 ° C o aggiungendo 750 µ l del mezzo preparato da parte aliquota di 6 mL. Se lo scongelamento aggiungendo mezzo, Pipettare attentamente su e giù per scongelare e omogeneizzare la sospensione. Quando scongelati, trasferire la sospensione cellulare al medium 6 mL aliquotare.
    5. Per rimuovere il mezzo di congelamento, girare i capillari giù a 250 x g, 4 ° C per 7 min.
    6. Attentamente aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1-2 mL dell'aliquota 10mL. Quando ri-sospeso, trasferire la soluzione in mezzo 10mL aliquota.
    7. Trasferire la sospensione capillare al pallone T75 rivestito e inclinare delicatamente il pallone per garantire un'equa distribuzione su tutta la superficie. Collocare la beuta T75 a 37 ° C, 5% CO 2.
      Giorno 2
    8. Dopo incubazione overnight, preparare 10ml pBEC crescita supplementato con con puromicina (4 µ g/mL) per una boccetta di T75 ed eseguire un cambiamento medio. Essere consapevoli del fatto che tutte le soluzioni a medio applicate alle celle dovrebbero essere pre-riscaldate a 37 ° C prima dell'uso.
      Nota: In alternativa, un cambiamento medio può essere effettuato 4-6 h post-placcatura quando capillari dovrebbero avere allegata alla superficie. Incubare le cellule fino alla confluenza del 60-95% è raggiunto, solitamente 3-5 giorni dallo scongelamento. Fare non allocellule w per raggiungere la confluenza di 100% per evitare l'inibizione del contatto che può arrestare ulteriormente la crescita delle cellule.
      Giorno 4-6
    9. Quando il confluency di desiderato è raggiunto, passaggio le cellule endoteliali per inserti di membrana permeabile (Vedi sezione 2.2). Se il confluency di desiderata non viene raggiunta il giorno 4, cambiamento di mezzo viene eseguita. Al più tardi il giorno 6, cellule dovrebbero essere attraversate verso gli inserti di membrana permeabile. Se il confluency di richiesta non è raggiunto da giorno 6, le cellule non sono adatte per uso sperimentale.
      Nota: preparazione degli astrociti per NCC: quando si configura il modello di co-coltura, 2 - 8 settimana-vecchio astrociti in coltura (Vedi sezione 4) dovrebbero essere preparati per il modello di co-coltura eseguendo un cambiamento medio del giorno precedente passaggio le cellule endoteliali a inserti. Per ogni Astrocita preparare bene, 1500 µ l di astrociti crescita terreno costituito da DMEM basso glucosio completato con 10% FBS, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL) e quindi eseguire il cambiamento medio.
  2. Crescita di pBECs sulla permeabile membrana (5 giorni) consente di inserire
    giorno 4-6
    1. membrana permeabile Prepare inserti (12-pozzetti con inserti di 2 della superficie di 1,12 cm, 0,4 µm pori) per semina di pBEC da rivestimento con collagene IV (500 µ g/mL) e fibronectina (100 µ g/mL) in ddH 2 O. uso circa 300 µ l per ogni inserire e assicurarsi che la soluzione copre l'intera superficie crescente. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per un minimo di 2 h.
    2. Preparare 30 mL di mezzo di sviluppo pBEC (per composizione media, fare riferimento alla sezione 2.1.2) senza con puromicina.
    3. Aspirare delicatamente lavare due volte con 5 mL di PBS sterile a temperatura ambiente e medium da pBEC cultura nel matraccio T75.
    4. Tripsinizzano le cellule con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA (2,5% tripsina, 0,1 nM EDTA in PBS) per il T75 e posizionare il pallone a 37 ° C, 5% CO 2 per 5-7 min.
    5. Per staccare le cellule endoteliali cerebrali, picchiettare delicatamente il lato della muffola T75 con i polpastrelli, lasciando alla fine i periciti superstiti e più forte-fissaggio sulla superficie del pallone. Individuare visivamente distaccamento sotto un microscopio. Quando si osserva un distacco di 80%, fermare trypsinization aggiungendo 5 mL di terreno.
    6. Trasferire la soluzione di cella in una provetta da 15 mL utilizzando una pipetta da 10 mL e spin giù le cellule endoteliali cerebrali mediante centrifugazione a 250 x g, 4 ° C per 7 minuti.
    7. Attentamente rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1mL di terreno. Quando sospesa, aggiungere altri 2 mL di medium per portare il volume totale a 3 mL
    8. contare il numero di celle manualmente mediante uso di una cella conteggio camera o una cella automatica sistema di conteggio. Preparare una soluzione di cella di 2,2 x 10 medio di cellule/mL 5, risultante in una densità di semina finale di 1.1 x 10 5 cellule/inserto.
    9. Rimuovere la soluzione di rivestimento dagli inserti membrana permeabile e trasferire 500 µ l di sospensione cellulare ogni inserto. Su uno degli inserti, aggiungere mezzo unico e utilizzare questo inserto come un ' solo filtro ' controllo per le misure di TEER.
    10. Stabilire le cellule endoteliali in MC, MC con ACM, o in NCC con i astrocytes nel modo seguente:
      1. per MC: aggiungere 1500 µ l di pBEC crescita medio/ACM per pozzetto della piastra 12-pozzetti sotto gli inserti di membrana permeabile. Mettere gli inserti di membrana permeabile a 37 ° C, 5% CO 2 e incubare per 2 giorni.
      2. Per NCC: trasferimento inserisce nei pozzetti con i astrocytes rinfrescato con mezzo di crescita Astrocita il giorno prima. Mettere gli inserti di membrana permeabile a 37 ° C, 5% CO 2 e incubare per 2 giorni.
        Nota: Essere consapevoli dell'uso dei diversi tipi di media nei pozzetti fondo dei tre modelli.
        Giorno 6-8
    11. Il giorno 2, cambiare il supporto sugli inserti membrana permeabile con pBECs. Preparare 500 µ l di terreno di coltura per inserto pBEC ed eseguire attentamente il cambiamento per ridurre al minimo la rottura dello strato delle cellule. Incubare le cellule per due giorni. Essere consapevoli del fatto che il cambiamento di media viene eseguito sugli inserti solo e non sul fondo.
  3. Stimolazione con fattori di differenziazione (1-2 giorni)
    giorno 8-10
    1. per ciascuno dei diversi modelli, mezzi di stimolazione devono essere preparato come segue:
      1. per MC: per ogni inserire e preparare bene, 500 µ l di terreno di crescita pBEC contenenti cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
        MC: Preparare inoltre 1500 µ l di terreno di crescita pBEC contenente cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
        MC con ACM: scongelare 1500 µ l di ACM e integrarla con cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
      2. Per NCC: per ogni inserimento, preparare 500 µ l di terreno di crescita pBEC contenenti cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM). Per ogni bene di astrociti, preparare 1500 µ l di DMEM/F-12 completati con penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL), eparina (15 U/mL), accampamento (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM).
    2. Per ciascuno dei diversi modelli, esecuzione media exchange come segue:
      1. per MC: attentamente aspirare medio da pozzi e inserti e aggiungere il supporto di differenziazione per entrambi i comparti, con 500 µ l per ogni inserto e 1500 µ l per pozzetto. Essere consapevoli del fatto che rottura su entrambi i lati dell'inserto possa influenzare e alterare lo strato delle cellule.
      2. Per NCC: attentamente aspirare medio da pozzi e aggiungere mezzo di differenziazione 750 µ l per pozzetto. Attentamente aspirare medio da inserti e aggiungere 500 µ l di terreno di differenziazione per inserto. Quindi aggiungere il rimanente mezzo di differenziazione di 750 µ l per ogni Astrocita ben.
    3. Per tutti i modelli: mettere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 e incubare con mezzo di differenziazione fino al giorno successivo.
      Nota: Tenere presente che per il servizio NCC con gli astrociti, gli astrociti sono da questo punto tenuto in medium senza siero.

3. TEER misure

  1. il giorno dopo stimolando le cellule con mezzo di differenziazione, preparare il sistema di alloggiamento di misurazione del tessuto resistenza per misurazioni TEER risciacquando la camera due volte con ddH 2 O, una volta con 70% EtOH per 5 min e 2 volte di più con ddH 2 O.
  2. Aggiungere 4 mL di DMEM/F-12 per camera di misura della resistenza del tessuto, collegarlo al sistema e calibrare per circa 30 min secondo le seguenti impostazioni: R = 0, Test R = 1000, modalità = R.
  3. Eseguire le misurazioni TEER posizionando accuratamente gli inserti nella camera di misurazione della resistenza del tessuto. Per ogni inserimento, effettuare misurazioni in triplice copia e calcolare la media Ω cm 2.
    Nota: Per il modello di co-coltura, valori TEER si prevedono di raggiungere > 500 Ω cm 2. Se il livello appropriato di TEER non viene raggiunto il primo giorno di misurazione TEER, aggiungere nuovi fattori di differenziazione (cAMP (250 µM), idrocortisone (550 nM) e RO (17,5 µM)) e misurare TEER nuovamente il giorno seguente. Quando vengono raggiunti livelli appropriati, il modello dovrebbe essere pronto per l'esperimento pianificato. Essere consapevoli del fatto che le cellule devono riposare per almeno 3 ore prima di eseguire l'esperimento per recuperare dopo le misure TEER. Dopo stimolazione, TEER valori in generale rimangono accettabili per 24-48 h dopo stimolazione.
    Nota: Un metodo alternativo e più veloce utilizzando la coppia di elettrodi STX - 100C rigida anche record alta TEER in questo modello 81. Il ele STX2 flessibilectrode coppia dà meno affidabile letture.

4. PREPARAZIONE di astrociti per co-coltura NON-CONTACT: Metodo alternativo

  1. Purificazione di astrociti
    1. per ogni ratto cervello utilizzato, cappotto 2 T75 boccette con l'aggiunta di 10 mL di poli-L-lisina (5 µ g/mL) in ddH 2 O a ciascuno T75 boccetta. Incubare le beute a 37 ° C per 30 min.
    2. Isolamento dei astrocytes può essere eseguita come segue:
      1. astrociti di ratto:
        1. decapitare 2 1 - 2 giorno vecchi ratti con un metodo approvato.
        2. Tagliare la pelle di dosso il cranio a partire dal collo verso il naso e tagliare l'osso con un'incisione sagittale.
        3. Apre il cranio con il forcipe curvo, prendere il cervello e metterlo in una provetta da 15 mL (filmato 1) con 11 mL di glucosio basso DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL).
        4. Attentamente rimuovere meningi usando il forcipe ammenda-punta e sospendere il materiale cerebrale utilizzando una pipetta da 1 mL.
      2. Suini astrociti:
        1. ottenere 1 cervello da un maiale domestico di 5-6-month-old.
        2. Attentamente rimuovere meningi dal cervello utilizzando forcipe ammenda-punta e/o mani.
        3. Raccogliere 4 g di grigio importa dal cervello e disporre i pezzi in glucosio basso di 1-2 mL DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL) in una capsula di Petri. Se i pezzi sono grandi, tritare con bisturi o forcipe.
        4. Sospendere il materiale isolato mediante una pipetta da 1 mL, spostarlo in un 15 mL tubo (tubo 1) e riempire con glucosio basso DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL) per un volume totale di 11 mL.
        5. Continuare omogeneizzazione del materiale isolato con un lungo ago collegato a una siringa da 10 mL e sospendere su e giù per 3 volte. Attendere che i pezzi grossi hanno depositato sul fondo del tubo, quindi raccogliere 7ml di mezzo dalla parte superiore del tubo (tubo 1).
        6. Filtrare la sospensione cellulare 7-mL attraverso un filtro di nylon di 40 µm in una nuova provetta 50 mL (filmato 2).
          7. Medio-
        7. aggiungere 7 mL provetta 1 con il cervello. Continuare l'omogeneizzazione e la filtrazione da passaggi 4.1.2.2.5-6 fino a quando il volume della sospensione cellulare filtrata in tubo 2 è di circa 35 mL.
    3. Rimuovere la soluzione di rivestimento dai palloni T75 [passo 4.1.1]. Un rapido lavaggio con 5 mL di PBS dopo incubazione con poli-L-lisina può essere utilizzato per assicurare che le cellule non sono danneggiate da eventuali effetti tossici della soluzione rivestimento.
    4. Dividere e la soluzione di astrociti isolato equamente tra le beute T75 di seme. Incubare le beute a 37 ° C, 5% CO 2 per 3-5 giorni.
  2. Coltura astrociti e preparazione NCC con le cellule endoteliali (3 settimane)
    1. Iniziale cultura
      1. dopo 3-5 giorni di incubazione, è necessario eseguire un cambiamento medio accuratamente aspirando medio e aggiungendo 10 mL di glucosio basso DMEM completato con 10% FBS e gentamicina solfato (125 µ g/mL).
        Nota: Dopo il primo cambiamento medio, medio dovrebbe essere cambiato ogni 5 giorni. Durante le prime 2 settimane, scuotere le beute e lavare le cellule accuratamente con PBS quando si cambia il mezzo. Questo aiuti nella rimozione di contaminanti microglia.
      2. Dopo 3 settimane di coltivazione, tripsinizzano le cellule con l'aggiunta di 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA al fondo di ciascuna beuta T75 e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 5-7 min.
      3. Smettere di trypsinization aggiungendo 5 mL di terreno, trasferire la soluzione di cella a un tubo da 15 mL e centrifugare gli astrociti a x 250 g, 4 ° C per 7 min.
      4. Attentamente rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in congelamento soluzione composta da 10% DMSO in FBS.
      5. Contare il numero di cellule e preparare una soluzione di cella di 4.0 x 10 6 cellule/mL. Congelare le cellule in cryovials aggiungendo 1 mL per flaconcino.
    2. Crescita in permeabile membrana inserire sistema fondo Wells (2-12 settimane)
      1. preparare 12-pozzetti per la crescita dei astrocytes aggiungendo 1 mL di poli-L-lisina (5 µ g/mL) in ddH 2 O in ciascun pozzetto. Posizionare le piastre a 37 ° C per 2 h.
      2. Per ogni piastra 12-pozzetti, preparare 25 mL di terreno di coltura del astrocyte (glucosio basso di DMEM completato con 10% FBS e penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL)).
      3. Portare il flaconcino di astrociti da azoto liquido e scongelare le cellule con l'aggiunta di 750 medio di glucosio basso DMEM µ l. Pipettare attentamente su e giù per scongelare e omogeneizzare la sospensione. Quando scongelati, trasferire la sospensione cellulare in una provetta 15 mL e aggiungere il terreno per un volume totale di 7 mL.
        Attenzione: L'azoto liquido è estremamente bassa temperatura, così indossare protezione personale come guanti.
      4. Per rimuovere il mezzo di congelamento, girare i capillari giù a 250 x g, 4 ° C per 7 min.
      5. Attentamente aspirare il supernatante e risospendere le cellule in medium.
      6. Rimuovere il rivestimento dai pozzetti delle piastre bene 12 e trasferire la sospensione cellulare pozzetti utilizzando 1ml per pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2.
      7. Aggiornare il mezzo ogni terzo giorno e cultura le cellule per un minimo di 2 settimane prima di utilizzare le cellule per la co-cultura con cellule endoteliali. Le cellule possono essere utilizzate per la co-cultura per fino a 12 settimane dopo lo scongelamento, con l'età ottima essendo 2-8 settimane.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stabilimento di BBB In Vitro modelli

Nel metodo presentato, ottimizzato, la coltivazione di pBECs e l'istituzione del sistema di inserimento membrana permeabile con MC o senza ACM o NCC con i astrocytes (Figura 1) è stati effettuati per un periodo di 9-11 giorni (Figura 2). Per la selezione delle cellule endoteliali, una cultura iniziale di frammenti capillare pur...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Purificazione e la proliferazione di pBEC

Durante la procedura di purificazione, fasi critiche includono la rimozione rapida ed efficace dei meninges e separazione della sostanza bianca e grigia, che è importante per la resa di purificazione e la purezza e per la corretta creazione del modello. Per il presentato in vitro BBB modello utilizzando pBECs, abbiamo migliorato e semplificato di una procedura di purificazione basata su meccanica omogeneizzazione della materia grigia isolato, fil...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori vorrebbero riconoscere, Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen e Niels M. Kristiansen per assistenza tecnica, e la Fondazione di Lundbeck concedere numero R155-2013-14113.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
FibronectinaSigma-AldrichF1141
Collagene IVSigma-AldrichC5533
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP1524
DMEM / F-12LonzaBE12-719F
DMEM / Basso glucosioSigma-AldrichD6046
Penicillina / StreptomicinaGibco Invitrogen15140
Siero plasmaderivato (PDS)First Link UK Ltd.60-00-89
Siero fetale bovino (FBS)Gibco Invitrogen10-270-106
Tripsina/EDTAGibco Invitrogen15090-046
EparinaSigma-AldrichH3393
PuromicinaSigma-AldrichP8833
IdrocortisoneSigma-AldrichH4001
8-CPT-cAMPBiologC010
RO 20-1724Sigma-AldrichB8279
Gentamicina solfatoLonza17-518Z
DMSOSigma-Aldrich34896
PBSSigma-AldrichD8537
EtOHVWR20,824,296Miscelare la soluzione al 70 % dalla EtOH
DNAsi alSigma-AldrichD4513
Collagenasi CLS2Sigma-AldrichC6885
ddH2OElga System
T75Thermo Scientific156499
Inserti Costar Transwell (inserti a membrana permeabili alle cellule)Piastra CostarCLS3401a 12 pozzetti, diametro 12 mm, 0,4 μ m membrana in policarbonato
provette da centrifuga da 15 mlCellstar188271
provette da centrifuga da 50 mlCellstar227261
piastre PetriThermo Scientific150350
Fiale CryoThermo Scientific377224
flacone da 500 mlThermo Scientific159910/159920
bisturiSwann-MortenREF0211Tipo 24
Omogeneizzatore tissutaleSigmaD9188
140 μ m filtriMERCKNY4H04700
40 μ m filtersCorning431750
Sistema di camere EndOhmWorld Precision InstrumentsENDOHM-12EndOhm per tazze di coltura da 12 mm
Sistema di elettrodi EVOM2World Precision Instruments300523+STX100Ccon coppia di elettrodi rigidi STX-100C
Ago lungoSigmaCollegare a una siringa
Pinze curve a punta fineKLS Martin12-409-12-07
Pinza a punta largaVWR82027-390
PortafiltroMERCK MiliporeSwinnex-47
Siringa da 50 mlBraun4617509F
Siringa da 10 mlTerumoSSt20ESI
Anticorpo anti-occludinaAbcamab317211:100
Anti-p120 Laboratoridi trasduzionecatenina 610133 1:200
Anticorpo anti-ZO-1Invitrogen61-7300Anticorpo
anti-Claudina 5Sigma-AldrichSAB45029811:100
IgG anti-coniglio d'asino coniugato con farina Alexa 568Thermo ScientificA100421:500
IgG anti-topo d'asino coniugato con farina Alexa 488Thermo ScientificA212021:500
SaccarosioPerkin ElmerNEC100X250UC0,15µ l/ml conc di lavorazione finale
Lucifero GialloSigmaL014410 µ g/ml conc di lavoro finale
96 % 1 Realizzato con palloni Camera Sistema di misurazione TEER World Precision Instruments BD Anticorpo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 0 (0), 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE - 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D'Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854(2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765(2015).
  23. Liew, K. -F., Hanapi, N. A., Chan, K. -L., Yusof, S. R., Lee, C. -Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233(2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction 'opening': signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, Suppl 1. S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278(2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli,, et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood--brain barrier. AIDS. 15 (4), London, England. 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -Y., Zhu, H. -M., Wu, J. -H., Wen, H., Liu, C. -J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, Clifton, N.J. 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40(2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093(2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Isolamento di frammenti capillaridigestione enzimaticaselezione con puromicinainserti a membrana permeabilefattori di differenziamentoresistenza elettrica transendotelialepermeabilit paracellulareco coltura senza contatto

Articoli correlati