Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

Summary

Descriviamo una procedura sperimentale per la misura di attività neuronale attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-GCaMP6s topi transgenici utilizzando 2 fotoni (2P) microscopia in vivo.

Abstract

Il cervello dei mammiferi esibisce simmetria contrassegnato lungo il piano sagittale. Tuttavia, la descrizione dettagliata delle dinamiche neurali nelle regioni simmetriche del cervello negli animali mammiferi adulti rimane evasiva. In questo studio, descriviamo una procedura sperimentale per la misurazione dinamica del calcio attraverso finestre ottiche dual sopra bilaterale corticies somatosensoriale primaria (S1) in Thy1-topi transgenici GCaMP6s usando la microscopia (2P) 2-fotone. Questo metodo consente registrazioni e quantificazioni dell’attività neurale in regioni del cervello del mouse bilaterale uno alla volta nello stesso esperimento per un prolungato periodo in vivo. I principali aspetti di questo metodo, che può essere completato entro un’ora, includono procedure di chirurgia mini-invasiva per la creazione di finestre ottiche dual e l’uso di formazione immagine 2P. Anche se abbiamo solo dimostrare la tecnica in zona S1, il metodo può essere applicato ad altre regioni del cervello vivente facilitando la delucidazione di complessità strutturale e funzionale delle reti neurali del cervello.

Introduction

Calcio e dal suo regolamento sono essenziali nella mediazione di molteplici processi fisiologici. Dinamica del calcio di monitoraggio è utile per comprendere la funzione normale del cervello come pure stati patologici del cervello disturbi ^{1,2,3,4,5,6 ,7,8}. Formazione immagine di fluorescenza di GCaMP6s è un potente strumento per quantificare i numeri di spike, tempismo, e frequenza, come pure i livelli di sinaptica in ingresso sia in vitro che in vivo ^9,10,11.

Il cervello dei mammiferi esibisce simmetria contrassegnato lungo il piano sagittale. Anche se recenti ricerche neurologiche ha fatto luce sul rimodellamento corticale e attività neuronale innescati traumatica del cervello o del midollo spinale lesioni ^6,7, i ruoli che il tessuto intatto di simmetricamente regioni corrispondenti giocare nel recupero sono ancora oscuri.

In questo studio, descriviamo le procedure sperimentali per la creazione di finestre ottiche simmetriche bilaterali per l’imaging in vivo . Utilizzando queste finestre ottiche, descriviamo la misurazione della dinamica del calcio da corteccia somatosensoriale primaria (S1) in topi transgenici GCaMP6s usando la microscopia 2P. Nella sezione risultati, vi mostriamo anche in vivo morfologia dentritica in diversi momenti della regione S1 nei topi transgenici EGFP usando la formazione immagine 2P. Il metodo di osservazione per quanto riguarda le dinamiche di rete nelle aree S1 bilaterale è ma un esempio iniziale di windows cranica aperta come dual aiuterà neuroscienziati per sondare elaborazione nel cervello dei mammiferi adulto in normale dell’informazione locale e simmetriche condizioni o nella malattia di diversa modelli in vivo.

Protocol

Tutte le procedure di gestione degli animali e chirurgica sono state effettuate come approvato sotto la guida per la cura e uso di animali da laboratorio (Consiglio nazionale delle ricerche) e gli orientamenti della Indiana University School di medicina istituzionali cura degli animali e dell’uso Comitato. Illustrazione schematica del setup imaging 2-fotone è illustrato nella Figura 1.

1. preparare l’animale per l’Imaging

1. Posizionare la garza sterile, tamponi di cotone e strumenti chirurgici sterilizzati nell’autoclave nell’area di chirurgia (tabella 1). Accendere un Micro Bead sterilizzatore per intersurgery sterilizzazione degli strumenti chirurgici.
2. Anestetizzare il mouse (maschio o femmina, 1,5-2,5 mesi, 20 – 25 g) tramite l’iniezione intraperitoneale (i.p.) di una miscela di ketamina (17,2 mg/mL), xilazina (0,475 mg/mL) e acepromazina (0,238 mg/mL) (peso corporeo di 6 µ l/g). Attendere che la corretta profondità di anestesia è raggiunto quando l’animale cessa di rispondere ad uno stimolo di pizzico di punta e non ha nessun riflesso corneale. Durante l’intervento chirurgico, dare una dose di richiamo di 1/3 della dose originale dell’anestetico cocktail come necessario per mantenere lo stato originale di anestetico.
3. Iniettare la buprenorfina per via sottocutanea (s.c.; 0.05-0.10 mg/kg) come agente analgesico prima della chirurgia. Applicare unguento protettivo per gli occhi dell’animale per evitare la formazione di cataratta e di essiccazione cornea.
4. Posizionare un topo transgenico GCaMP6s su un rilievo di riscaldamento per prevenire l’ipotermia e coprirlo con un telo chirurgico sterile. Stabilizzare la testa dell’animale con un adattatore di Holding di testa per i topi.
5. Radersi la testa sopra la maggior parte del cuoio capelluto con una lama di rasoio doppio taglio. Pulire l’area chirurgica con un tampone di alcool sterile preparazione seguito da soluzione povidone-iodio.

2. cronica cranica finestra preparazione

1. Fare un taglio rettangolare del cuoio capelluto (2 x 3 mm) con un paio di forbici su un lato (a destra) del cranio. Spingere la pelle da parte con un batuffolo di cotone per creare un’area di esposizione di > 3 mm di diametro (Figura 3A). Rimuovere il tessuto connettivo attaccato al cranio raschiando delicatamente il cranio con una lama smussata microsurgical (bisturi lama n. 10; Figura 3).
2. Delimitare la zona S1 delicatamente disegnando un cerchio (3 mm di diametro, centro coordinamento:-1,50 mm dal bregma e 2,5 mm dalla linea mediana) sul cranio usando uno studio dentistico trapano (Figura 2B).
3. Eseguire la stessa procedura sul cranio sinistro (Figura 2B).
4. Applicare un sottile strato di colla del cianoacrilato Super fino all’osso per fornire una base per applicazione di cemento dentale.
5. Sotto un microscopio per dissezione, sottile giù una scanalatura circolare nel cranio intorno alla zona S1 utilizzando un microdrill ad alta velocità (Figura 3D). Lo scopo è quello di creare un bordo liscio per il posizionamento della finestra ottica su di esso.
6. Applicare ripetutamente cerebrospinale artificiale (ACSF, temperatura ambiente) al cranio periodicamente durante il processo di diradamento per facilitare la foratura e dissipare il calore. Eseguire la foratura a intermittenza per evitare il surriscaldamento indotto da attrito. Succhiare via i detriti dell’osso con una linea del vuoto di casa o una pompa a vuoto.
7. Dopo circa 2/3 di profondità dell’osso è forata, lentamente e con attenzione sottile osso restante 1/3 fino a quando un pezzo circolare del cranio (lembo osseo) è completamente esente da cranio circostante.
8. Lentamente e con attenzione rimuovere il lembo osseo circolare con un paio di n. 5/45 forcipe ed esporre la dura madre (Figura 2; Figura 3E).
9. La regione del cervello esposto. mantenere umido con ACSF (Figura 3E). Evitare danni ai vasi sanguigni pial, poiché l’emorragia sarà alterare il flusso sanguigno cerebrale, accelerare il gonfiamento del cervello e severamente degradare la qualità delle immagini.
10. Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro (controlaterale) del cranio.
11. Per il montaggio la finestra ottica, uso ottico adesivo colla e cura tra coprioggetto strati uno alla volta. Se necessario, riscaldare la finestra ottica (50 ° C per 12 h) in un’incubatrice per migliorare l’incollaggio. La finestra ottica contiene 2 porzioni: la parte superiore contiene un singolo vetro coperchio rotondo con un diametro di 5 mm e la parte inferiore contiene 1 – 3 vetri di coperchio rotondi con un diametro di 3 mm (Figura 2D).
12. Memorizzare la finestra ottica in etanolo (70%, vol/vol) e sciacquarlo con soluzione salina sterile prima dell’uso. Prima dell’installazione di finestra ottica, controllare la finestra ottica per imperfezioni, tra cui una non corretta quantità di adesivo o imprecise allineate sotto uno stereoscopio.
13. Installare la finestra ottica sopra la regione di craniotomia (Figura 2D). La parte superiore della finestra ottica poggia sul cranio e la parte inferiore della finestra ottica si inserisce all’interno dell’apertura craniotomized e poggia su dura in presenza di CSF (Figura 2D, E).
14. Sigillare la parte superiore del bordo finestra ottica al cranio con la colla Super cianoacrilato (Figura 2F; Figura 3F).
15. Quando il cianoacrilato Super colla si è asciugata, applicare il cemento dentale nero (Dentsply) per coprire il bordo di vetro. Applicare il cemento dentale per tutte le esposte del cranio e della ferita di margini di bloccare la luce (Figura 2-H; Figura 3B).
16. Eseguire la stessa procedura sul lato sinistro.
17. Permettere all’animale di recuperare il termoforo e tornare l’animale alla sua gabbia a casa per il recupero sotto adeguata sorveglianza. Fornire cibo umido per facilitare la masticazione e idratazione. Per ridurre il dolore, amministrare buprenorfina s.c. (0.05 – 2,0 mg/kg) ogni postinjury di 8 – 12 h per 2 giorni. Consentire il mouse per recuperare per altri 7-10 giorni prima di formazione immagine.

3. due-fotone imaging

1. Il giorno dell’esperimento, anestetizzare l’animale con ketamina e xilazina (dosi e mantenimento dell’anestesia come descritto sopra). Pulire la finestra cranica con etanolo al 75% (vol/vol).
2. Posizionare il mouse sotto un imaging set-up che consiste di un microscopio di P 2 e l’adattatore di testa Holding, che riposa su un rilievo di riscaldamento con la sua testa immobilizzata attraverso le sbarre di orecchio attaccati a un titolare di testa del mouse.
3. Un lato della finestra ottica dell’immagine alla volta. Per minimizzare le aberrazioni ottiche, assicurarsi che la finestra ottica e cranio giusto sono orientati perpendicolarmente all’asse ottico del microscopio.
4. Prendere un’immagine iniziale della finestra cranica con illuminazione in campo chiaro con un ingrandimento 4x come una mappa di riferimento per la registrazione con angiografie di maggiore ingrandimento 2P (Figura 4A1).
5. Ingrandire l’area di interesse utilizzando ingrandimento 10x (Figura 4A2).
6. Selezionare un’area di interesse in zona S1 in strati corticali I o II (fino a 150 µm sotto la superficie pial). Se si desidera maggiore ingrandimento, utilizzare un obiettivo X 20.
7. Ricerca di un campo di vista con più neuroni. Acquisire immagini utilizzando un microscopio di 2P (Figura 4B). Determinare il tempo di esposizione e livello luce di eccitazione (≈910 nm) basato sulla profondità e livello di espressione di GCaMP6s, con i segnali più deboli che richiedono tempi di esposizione più lunghi e concordemente meno risoluzione temporale. Generalmente utilizziamo ~ 4 µs per tempi di esposizione di pixel. Acquisire immagini a frame rate di 3 – 5 Hz con una risoluzione di 512 × 512 pixel.
8. Iniziare a registrare la serie temporale. Memorizzare le coordinate di ogni regione di interesse (ROI) relativo il pattern vascolare o ai punti fiduciali in immagini di ingrandimento basso. Immagine il ROI stesso nel tempo. Eseguire la stessa procedura per osservare la dinamica del calcio della zona S1 sull’emisfero sinistro. Calcolare le modifiche in fluorescenza da ogni ROI.
9. Acquisire le immagini singolarmente o in un filmato time-lapse (Figura 41-C3, D, E).
10. Studio corticale sangue flusso dynamics in vivo da imaging coloranti fluorescenti destrano iniettati nella vena della coda dei roditori con microscopia di 2P. Utilizzare vasculatures come punti di riferimento per riconoscere e immagine la stessa ROI in sessioni di formazione immagine per lunghi periodi.

4. elaborazione dei dati

1. Utilizzare ImageJ e origine per analisi di immagine. Importare sequenze di immagini con ImageJ (Figura 5A-B). Per immagini singole (o t-serie film), selezionare un ROI all’interno di un neurone imaged e 2 separati nelle vicinanze di regioni per la misura di sfondo (Figura 5). Acquisire totale intensità con un manager di ROI (Figura 5C).
   Nota: La figura 6 Mostra immagini rappresentative del calcio. Transitori di calcio (verde) e dei vasi sanguigni (rosso) mostrano in diversi momenti in secondi (Figura 6A-D) in un mouse alla 7D dopo l’installazione iniziale della finestra. Viene mostrata anche la z-proiezione di un periodo di registrazione di 3 min per canali rosso e verde (Figura 6E) o canale verde (Figura 6F). Una z-proiezione consente di visualizzare un’immagine compressa di tutte le immagini del film da cui un contorno grezzo e cerchio (che comprende il neurone oggetto di interesse in tutti i frame) è selezionato manualmente così come la selezione di 2 indipendente nelle vicinanze di regioni di sfondo ( Figura 6).
2. Da ogni ROI, calcolare lo sfondo di fluorescenza media FB, FB = (FB1 + FB2) / 2 e le modifiche di fluorescenza del soma (F) espressa come ΔF/F, ΔF/F = (F-FB) / FB.
3. Eseguire l’analisi di picco passo dopo passo utilizzando funzioni di ImageJ tra cui correzione della linea di base, picco individuazione/determinazione, integrazione di picco, picco raccordo o rubriche picco funzioni di analisi.

Representative Results

Discussion

Due-fotone imaging consente la misura simultanea dell’attività di molte cellule ad una risoluzione ragionevole alle fino a circa 800 µm sotto la superficie del cervello. Abbiamo integrato 2P e una tecnica di doppia finestra ottica con codificato geneticamente GCaMP6s per osservare la dinamica del calcio nelle popolazioni di somata neuronali strato V trova > 500 µm di sotto della pia. Con la finestra ottica aperta su ogni lato del cranio, il metodo consente registrazioni di attività neurale tra le regioni del cervello dei mammiferi simmetrica per prolungata e stabile del calcio imaging in vivo. Le prestazioni di chirurgia mini-invasiva per creare finestre ottiche dual cranio aperto e imaging 2P dell’attività neuronale in simmetriche S1 regioni sono aspetti fondamentali di questo metodo.

Esaminando l’attività di rete in regioni bilaterali S1 è che un esempio di come dual windows cranica potrebbe essere usato per sondare elaborazione nel cervello adulto in vivodell’informazione locale e simmetriche. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare l’attività neuronale (ad es. utilizzando Thy1 –GCaMP6s topi) e la plasticità corticale B6. CG-Tg (Thy1– YFP) HJrs/J da tessuto intatto delle corrispondenti regioni simmetriche in recupero dopo deafferentazione a causa di un infortunio di CNS unilaterale. Il metodo è utilizzabile anche per esaminare l’attività corticale in risposta alle strategie di stimolo periferico come optogenetica, stimolazioni elettriche o chimiche. Anche se abbiamo solo dimostrare la tecnica in zona S1, questo approccio potrebbe essere impiegato per indagare sulle attività in altre zone simmetriche del cervello vivente come i neuroni di strato V della corteccia motoria primaria (M1). Osservazioni sulla riorganizzazione delle regioni del cervello possono fornire un substrato neurale per comportamento adattivo di un motore, che svolge un ruolo critico nella postinjury recupero della funzione. Permette anche di misurazione cronica dell’attività simmetrica delle cellule geneticamente identificate durante il comportamento nei topi di testa-fisso.

Tecnicamente, gli investigatori devono prestare particolare attenzione alla qualità e alla consistenza di dual windows cranica. Assottigliato-cranio cranio finestra tecnica ¹² è altamente consigliato per i principianti alla pratica. Le spine sono compartimenti di calcio a causa della loro morfologia e meccanismi locali di afflusso ed estrusione. In questo studio, abbiamo usato B6. Topi di HJrs/J CG-Tg (Thy1– YFP) come un esempio per dimostrare spine dendritiche dynamics in vivo (Figura 4). Un’installazione di finestra aperta-teschio di vetro può causare spina dorsale alto fatturato e risposte gliali reattive dopo chirurgia ¹². Al contrario, con la tecnica del cranio assottigliato finestra spine e dendriti possono essere ben conservati.

Scelte di dimensioni e spessori di finestre ottiche sarà dipendono il campo di vista desiderata, la curvatura del teschio, cranio spessore e il tipo di formazione immagine ¹³. Insufficiente pressione dei vetrini ottico su dura può causare ispessimento del dura, ricrescita del cranio e aumentato il movimento del cervello. Al contrario, una pressione eccessiva dei vetrini ottico può ostacolare il flusso sanguigno corticale.

Per il montaggio di finestra ottica, colla e curare ulteriori strati di vetrini uno alla volta con adesivo ottico e luce UV di lunghezza d’onda. Per contribuire a rafforzare il legame adesivo, calda finestra fabbricata (50 ° C per 12 h) in un’incubatrice. Conservare il coprioggetto finestra ottica in etanolo al 70% (vol/vol) e, prima della chirurgia, sciacquarlo con soluzione salina sterile. La finestra ottica deve essere esaminato per imperfezioni (ad esempio, un importo non corretto di allineamento ottico di adesivo o imprecisa) sotto uno stereoscopio prima dell’uso per evitare il fallimento. Se l’adesivo ottico è troppo sottile, gli spazi d’aria può essere piegati, che può causare aberrazioni ottiche o distacco di vetro di copertura presso l’impianto. Al contrario, troppo adesivo ottico può causare overflow oltre i bordi della finestra cranica.

In breve, qui descriviamo una procedura sperimentale per la misurazione dinamica del calcio o morfologia dentritica attraverso windows cranica dalle regioni corticali somatosensoriali primarie simmetriche 2 in Thy1-GCaMP6s e Thy1topi transgenici – YFP, rispettivamente, usando la microscopia 2P. Questa tecnica può facilitare notevolmente il complesso rapporto strutturale e funzionale delle reti neurali di dissezione.

Materials

C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	Can be any strains made by the genetically-encoded neuronal indicator and effector expressing the green fluorescent calcium indicator, GCaMP, in subsets of excitatory neurons in the cortex.
B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	Can be any strains expressing EGFP in subsets of neurons within specific populations in the cortex; providing a bright, vital Golgi-like stain. 
Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel	Fine Science Tools	11251-30	Can be any brand of choice.
Dumont no. 5SF forceps	Fine Science Tools	11252-00	Can be any brand of choice.
Micro Bead Sterilizer	Southern Labware	B1201	Can be any brand of choice.
Harishige’s SG-4N Head Holding Adaptor	Tritech Research	SG-4N	Can be any brand of choice.
Ideal Micro-Drill Complete Kit	Harvard Apparatus	72-6065	Can be any brand of choice.
Burrs for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 3 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0720	Can be any brand of choice.
Round cover glass, 5 mm	Harvard Biosciences	W4 64-0700	Can be any brand of choice.
Norland optical adhesive	Norland Products	7106	Can be any brand of choice.
Loctite liquid super glue	WB Mason	LOC1647358	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice. Mix 5 parts of white dental cement powder (Grip Cement) with one part of black Tempera powder paint (to shield from light; some users prefer a 10:1 ratio).
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5841	Can be any brand of choice.
Artificial cerebrospinal fluid (ASF)	–	–	The ACSF contains 125 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 26 mM NaHCO<sub>3</sub>, 1.25 mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>, 2 mM CaCl<sub>2</sub>, 1 mM MgCl<sub>2</sub> and 20 mM glucose. Bubble the ACSF with oxygen (95% oxygen, 5% carbon dioxide) and adjust the pH to 7.4. Prepare fresh ACSF solution before every experiment.