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Articolo metodologico

Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

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DOI:

10.3791/56311

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13 settembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST), IRCCS

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.

Abstract

Il crosstalk tra cellule tumorali e cellule di osso nel microambiente osseo è fondamentale per la comprensione del meccanismo di formazione di metastasi dell'osso. Abbiamo sviluppato un in vitro pienamente umano modello preclinico di un co-coltura delle cellule di cancro al seno e monociti in fase di differenziazione verso gli osteoclasti. Abbiamo ottimizzato un modello di osteoclastogenesi a partire da un campione di sangue periferico raccolto da donatori sani. Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) sono state separate da centrifugazione in gradiente di densità, seminate ad una densità elevata e indotte a differenziarsi con l'aggiunta di due fattori di crescita (GFs): attivatore del ricevitore di fattore-κB nucleare ligando (RANKL) e del macrofago fattore distimolazione (MCSF). Le cellule erano lasciate in coltura per 14 giorni e quindi fisso e analizzate da analisi a valle. In metastasi osteolitiche, uno degli effetti dell'arrivo di cellule di cancro in osso è l'induzione di osteoclastogenesi. Così abbiamo sfidato il nostro modello con co-colture di cellule di cancro al seno per studiare il potere di differenziazione delle cellule tumorali rispetto a GFs. Un modo semplice per studiare l'interazione delle cellule osteoclasti di cancro è quello di eseguire indirette co-colture basate sull'uso del medium condizionato raccolti da colture di cellule di cancro al seno e mescolato con mezzo fresco. Questa miscela viene quindi utilizzata per indurre la differenziazione degli osteoclasti. Abbiamo inoltre ottimizzato un metodo di co-coltura diretta in cui il cancro cellule e monociti in fase di differenziazione il mezzo di condividere e scambiano fattori secreti. Questo è un miglioramento significativo sopra l'originale metodo di co-culture indiretta come i ricercatori possono osservare le interazioni reciproche dei due tipi cellulari ed eseguire analisi a valle per sia le cellule tumorali e gli osteoclasti. Questo metodo permette di studiare l'effetto delle droghe sul microambiente osseo metastatico e di linee cellulari di seme diverso da quelli derivati da cancro al seno. Il modello è utilizzabile anche per lo studio di altre malattie come l'osteoporosi o altre condizioni di osso.

Introduzione

L'osso è un comune sito di metastasi per diversi tipi di tumori primari come il cancro della prostata, del polmone e del seno, con 20-25% dei pazienti che sviluppano metastasi ossee durante il corso della malattia1,2,3. In particolare, il 70% dei pazienti di cancro al seno trasportare prova della metastasi dell'osso alla morte4. Tumore e cellule stromali interazione è essenziale per la progressione del cancro cancro primario sia lesioni secondarie. Nel microambiente osseo, metastasi osteolitiche dell'osso da cancro al seno dipendono l'istituzione di un circolo vizioso patologico che si verificano tra le cellule tumorali, le cellule ossee e il microambiente osseo. Le cellule tumorali interrompono l'equilibrio dell'osso, aumentando il riassorbimento di osso5,6,7.

In condizioni normali e patologiche, gli osteoclasti sono le cellule responsabili del riassorbimento dell'osso, mentre gli osteoblasti, nel depositare nuova matrice, sono responsabili per la formazione di osso nuovo8. Attività degli osteoclasti è regolata da osteoblasti attraverso l'espressione di RANKL, che lega al suo recettore RANK sulla superficie degli pre-osteoclasti, inducendo degli pre-osteoclasti fusione, un processo necessario per la differenziazione in osteoclasti maturi. L'induzione di osteoclastogenesi aumenta il riassorbimento dell'osso. Un gran numero di studi in vivo hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione di osso metastasi formazione9,10,11. Cellule di cancro al seno dal tumore primario e nel microambiente osseo perturbano l'omeostasi dell'osso, promuovendo osteoclastogenesi e dell'osso di riassorbimento8. In questo scenario, tutte le interazioni molecolari che si verificano tra cellule tumorali e gli osteoclasti sono di importanza cruciale. Come già accennato, il meccanismo di formazione di metastasi dell'osso è stato delucidato in modelli di topi in vivo . Tuttavia, oltre alla necessità per l'approvazione di tutti in vivo gli esperimenti sugli animali dal comitato etico, ci sono diversi altri inconvenienti a in vivo esperimenti, compresi i metodi che richiede tempo e costi elevati. Parecchi autori hanno combinato modelli preclinici in vivo e in vitro di osteoclastogenesi utilizzando una linea murina degli pre-osteoclasti chiamato RAW246.79,10,11. Gli svantaggi di questo modello derivano dal fatto che le cellule sono già impegnate a diventare pre- osteoclasti e non sono di origine umana. Per questi motivi, ricerca traslazionale potrebbe beneficiare grandemente la disponibilità di in vitro pienamente umano modelli preclinici per studiare le interazioni delle cellule di osso cancro.

Abbiamo ottimizzato un metodo di osteoclastogenesi in vitro a partire da sangue periferico umano campioni12,13. Gli osteoclasti derivano da monociti, che sono presenti, seppur in misura limitata, in campioni di sangue periferico. Cellule mononucleari in primo luogo sono separate dal eritrociti e granulociti presenti nel sangue intero mediante gradiente di densità di Ficoll; vengono quindi selezionati grazie alla loro capacità di aderire al substrato di plastica, a differenza dei linfociti. Dopo la semina, le cellule sono coltivate per 14 giorni. Il GFs richiesto dai monociti per differenziare in primo luogo in macrofagi e poi in osteoclasti14,15MCSF e RANKL. MCSF è necessaria per tutta la durata del test, mentre RANKL viene utilizzato per indurre il processo di differenziazione nelle fasi tardive di osteoclastogenesi. Nella fase in anticipo di differenziazione, MCSF aiuta i monociti proliferare e sopravvivere14,15. Durante la seconda parte di osteoclastogenesi, le cellule si fondono insieme e maturano come gli osteoclasti, mostrando la distribuzione caratteristica di actina F in anelli e che esprimono gli indicatori specifici quali la fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) e del recettore della calcitonina (CTR) 14 , 15. il nostro metodo consiste nell'aggiungere MCSF alla cultura del monocito per i primi 7 giorni dell'esperimento e una combinazione di MCSF e RANKL da 7 a 14 giorni. Alla fine dell'esperimento, osteoclastogenesis è analizzato contando le cellule differenziate, come dettagliato di seguito.

Le culture del monocito indotte a differenziarsi da GFs costituiscono la base del nostro modello preclinico. Abbiamo ottimizzato un sistema di co-coltura senza GFs per meglio comprendere il potere di osteoclastogenico delle cellule di cancro al seno. Abbiamo in primo luogo sviluppato un modello di co-culture indirette aggiungendo un mezzo (80% α-terreno minimo essenziale (α-MEM) e 20% condizionato media raccolti da una coltura di cellule di cancro al seno che erano circa 90% confluenti di cellule in fase di differenziazione12 . Il medium condizionato (non raccolto in condizioni di deprivazione di siero) è stato raccolto dopo 24 ore e mescolato con mezzo fresco in proporzione di 1:4. Il medium condizionato ha indotto la differenziazione degli osteoclasti significativo rispetto al controllo negativo. Tuttavia, come le informazioni sulla reciproca interazione tra cellule tumorali e cellule ossee sono perse quando si utilizza co-culture indirette, abbiamo migliorato il nostro sistema di svolgimento dirette co-colture. Abbiamo seminato le cellule tumorali in 0,4 µM inserti e li ha posti in pozzetti in cui sono state placcate cellule mononucleari. Utilizzando questo metodo, le cellule condividono lo stesso mezzo e scambiano di proteine secrete. Abbiamo così creato un modello preclinico pienamente umano di osteoclastogenesi indotta da cancro cellule13.

Questo sistema è estremamente versatile e può essere utilizzato per scopi di ricerca diversi, ad esempio, in studi farmacologici, indagando il ruolo dei farmaci in metastasi dell'osso. Il nostro modello permette di studiare l'efficacia e i meccanismi d'azione delle terapie mirate dell'osso e/o farmaci antitumorali nel microambiente osseo in presenza di cancro cellule13. Progettazione degli esperimenti con i controlli corretti, cioè, le cellule tumorali e gli osteoclasti coltivati singolarmente, lo rende più facile capire l'impatto della co-cultura su attività della droga. Questo approccio diventa ancora più interessante quando entrambi cancro cellule e osteoclasti, per esempio, everolimus16è destinato il farmaco oggetto di studio. Questo modello è utilizzabile anche per identificare nuove vie di interazione tra cellule tumorali e cellule ossee.

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Protocollo

osteoclasti umani sono stati differenziati da PBMCs di donatori sani che hanno dato il consenso informato scritto a partecipare allo studio. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico locale, in conformità con gli standard etici stabiliti nella dichiarazione di Helsinki 1964.

1. differenziazione degli osteoclasti

Nota: raccogliere sangue periferico o buffy cappotti da donatori sani umani in EDTA. Non utilizzare meno di 20 mL di sangue periferico. Buffy coats sono preferibili perché hanno una maggiore abbondanza di cellule mononucleari. Eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio sterili per coltura.

  1. Sangue intero EDTA diluire 1:1 con 1x tampone fosfato salino (PBS). Risospendere bene.
  2. Strato sul supporto di separazione del linfocita (PBS di sangue: media di separazione del linfocita, 2:1) in provette da 50 mL.
    1. Pipetta 30 mL di sangue diluito in PBS in una provetta da 50 mL.
    2. Delicatamente sottoposto 15 mL di mezzi di separazione del linfocita nella parte inferiore del tubo da 50 mL.
  3. Centrifuga a 757 × g per 10 min a temperatura ambiente (senza freni).
  4. Raccolta di cellule mononucleari:
    1. raccogliere lo strato di cellule mononucleari con una pipetta 5 mL bianca senza agitazione e inserirlo in una nuova provetta da 50 mL.
    2. Diluire i PBMCs raccolti con 20 mL di PBS.
  5. I PBMCs di lavaggio:
    1. centrifuga a 225 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    2. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta. Ripetere un' volta.
  6. Lisi RBC:
    Nota: se il pellet cellulare è rosso, trattare le cellule con globuli rossi soluzione tampone di lisi (Vedi Tabella materiali).
    1. Mettere il tubo da 50 mL su ghiaccio.
    2. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi di globuli.
    3. Aspettare 3-5 minuti per completare la lisi degli eritrociti. Il tempo varia a seconda del grado di contaminazione dell'eritrocito.
    4. Fermare la reazione aggiungendo 20 mL di PBS.
    5. Centrifuga a 225 x g per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta.
      Nota: Facoltativo: se viene eseguita la lisi di RBC, lavare i PBMCs come descritto di seguito.
  7. Wash PBMCs:
    1. aggiungere 20 mL di PBS e centrifugare a 225 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    2. Scartare il surnatante capovolgendo la provetta.
  8. Risospendere le cellule in α-MEM completo (supplementato con 10% siero bovino fetale e della glutamina di 1% (concentrazione iniziale 100 X)).
  9. Contare le celle con una camera di Neubauer.
    1. Diluire il campione 1: 100 in acido acetico glaciale e utilizzare 10 µ l della diluizione per contare le celle.
    2. Contare almeno due volte e calcolare la media delle ripetizioni per ottenere il numero totale medio di cellule raccolte.
  10. Cellule del piatto:
    1. piastra cellule ad una concentrazione di 750.000 PBMCs a cm 2.
    2. Conservare le cellule placcate in un incubatore a 37 ° C in un 5% CO 2 ambiente.
      Nota: Progettazione dell'esperimento per includere controlli negativi, che sono cellule che sono trattate con α-MEM completo normale senza MCSF o RANKL GFs. ricordare di eseguire ogni condizione in almeno 3 tecniche replica. Eseguire almeno 3 replicati biologici.
  11. Cambiare il supplementato con GFs:
    1. aspettare circa 3 h dopo la semina delle cellule e quindi rimuovere il mezzo di pipetta (200-1.000 µ l) per scartare i detriti, le cellule non collegate ed eritrociti.
      Nota: Fare attenzione quando si cambia il mezzo per evitare il distacco cellulare.
    2. Aggiungere nuovo completo α-MEM addizionata di 20 ng/mL di MCSF (500 µ l/pozzetto).
      Nota: Quando co-coltura con le cellule tumorali, seme il cancro cellule il giorno dopo la semina di PBMC.
  12. Cambiare i media ogni 2-3 giorni (α-MEM addizionata di 20 ng/mL di MCSF):
    1. eliminare il terreno mediante una pipetta di 200-1.000 µ l.
    2. Aggiungi nuovo fresco mezzo di una pipetta di 200-1.000 µ l.
  13. 6-7 giorni dopo la semina delle cellule, aggiungere 20 ng/mL di RANKL completa α-MEM + MCSF.
  14. Cambiare il mezzo (completa α-MEM + MCSF + RANKL) ogni 2-3 giorni:
    1. eliminare il terreno con una pipetta di 200-1.000 µ l.
    2. Aggiungere nuovo mezzo con una pipetta di 200-1.000 µ l. Smettere di induzione di differenziazione 14 giorni dopo la semina delle cellule.
    3. Scarto medio e lavare due volte con PBS.
  15. Fissare le cellule con paraformaldeide:
    1. lasciare celle a secco.
    2. Aggiungere paraformaldeide al 4% (Vedi Tabella materiali).
    3. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  16. Scartare paraformaldeide e lavare due volte con 500 µ l di PBS.
    Attenzione: Paraformaldeide è tossico; si prega di indossare guanti, mascherina e occhiali da vista.
  17. Permettono che le cellule a secco.
  18. Eseguire trappola colorazione secondo il produttore ' s istruzioni (Vedi Tabella materiali).
  19. Contare osteoclast-come le cellule manualmente al microscopio a ingrandimento 10x; NA 0.30.
    Nota: Osteoclast-come le cellule sono definite come trappola + polycarion cellule con i nuclei di almeno 4.

2. Colture di cellule di cancro

Nota: gli esperimenti possono essere eseguiti con diversi tipi di linee cellulari di adenocarcinoma mammario come SCP2 17, una linea cellulare osteotropi che proviene dall'essere umano negativo tripla linea di cellule di cancro al seno (MDA-MB-231) e la linea ormonale positivo per il recettore delle cellule MCF7.

  1. Della coltura le cellule come un monostrato in boccette di 75 cm 2.
    1. Seme 1.000.000 cellule di cancro in una boccetta di 75 cm 2.
    2. Conservare le cellule a 37 ° C in medium completo α-MEM supplementato con 1% glutammina e 10% di siero fetale bovino in un 5% CO 2 ambiente.
  2. Staccare le cellule a una confluenza di circa il 90%:
    1. eliminare il terreno, lavate con PBS e aggiungere 2-3 mL di tripsina 1 X in PBS.
    2. Incubare le cellule per 3-5 min a 37 ° C.
    3. Raccogliere le cellule distaccate dalla beuta 75 cm 2 mediante una pipetta 10ml, l'aggiunta di 8 mL di terreno completo per fermare la reazione enzimatica.
    4. Centrifugare a 225 x g per 5 min.
  3. Lavare le cellule tumorali:
    1. aggiungere 10 mL di PBS.
    2. Centrifuga a 600 x g per 5 min.
  4. Contare le cellule tumorali con una camera di Neubauer.
    1. Contare le cellule tumorali, almeno due volte e calcolare la media delle ripetizioni per ottenere il numero totale medio di cellule raccolte.

3. Diretto co-colture di cellule tumorali un nd monociti in fase di differenziazione verso gli osteoclasti

  1. seme le cellule tumorali su inserti (poro diametro 0.4 µm):
    1. le cellule tumorali ad una concentrazione di 4.000 cellule per cm 2 di semi.
    2. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
      Nota: Seme il cancro cellule il giorno dopo la semina di PBMC per l'esperimento di co-coltura in 0,4 µm inserti.
  2. Attendere 24 ore permettere alle cellule di aderire.
  3. Posto le teste di serie inserire cultura sopra le culture mononucleari per avviare la co-cultura (Vedi sezione 1.10 del protocollo).
  4. Cambiare il supporto ogni 2-3 giorni con completa α-MEM.
    1. Eliminare il terreno con una pipetta di 200-1.000 µ l.
    2. Aggiungere 500 µ l di fresco medio.
      Nota: Lo scopo primario della co-cultura è quello di comprendere il potere di osteoclastogenico delle cellule tumorali, di conseguenza, il GFs non vengono aggiunti a α-MEM. In ogni esperimento di co-coltura, includere necontrolli negativi (vedere nota punto 1.10 del protocollo) e controlli positivi degli osteoclasti differenziati di RANKL e MCSF (senza le cellule tumorali). Le cellule tumorali seminate negli inserti non posizionati sopra le cellule mononucleari sono utilizzate come controllo negativo della co-cultura.
  5. Interrompere la co-cultura e utilizzare le cellule tumorali per analisi a valle:
    1. 13 giorni dopo la semina di PBMC e 12 giorni dopo la semina delle cellule tumorali collocare l'inserto su un piatto nuovo.
    2. Smettere di coltura delle cellule di cancro in base ai quali analisi successive devono essere eseguite (Vedi discussione).
  6. Il giorno 14, interrompere la differenziazione degli osteoclasti e fissare le cellule, come riportati al punto 1.15.
  7. Eseguire trappola macchiatura immediatamente o entro 14-30 giorni.
    Nota: La macchiatura opzionale: per confermare che le cellule di polycarion TRAP + sono gli osteoclasti, i ricercatori possono eseguire ulteriori macchiatura per rilevare CTR, un marcatore specifico degli osteoclasti. La rilevazione degli anelli di F-actina è un altro degli osteoclasti specifiche colorazione dosaggio 12 , 13 , 14.

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Risultati

Un metodo è stato ottimizzato per differenziare facilmente gli osteoclasti dai monociti del sangue periferico umano. La cultura del monocito è stata coltivata con le cellule tumorali, che conferma (come descritto nella letteratura18) che le cellule tumorali sono in grado di sostenere il osteoclastogenesi nelle metastasi dell'osso. Osteoclasti differenziano dalle cellule tumorali e GFs sono mostrati nella Figura 1. Una cella osteoclast-...

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Discussione

Modelli preclinici in vitro studiando i meccanismi di diafonia tra cellule tumorali e cellule ossee sono necessari per identificare i meccanismi della metastasi dell'osso che può essere utilizzato per creare nuove strategie terapeutiche. Abbiamo sviluppato un modello pienamente umana in vitro di osteoclastogenesis da sangue periferico umano (Figura 3). Durante l'ottimizzazione della metodologia, un numero di punti critici sono stato identificato e risolti. Il primo riguarda...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Yibin Kang per fornire la linea cellulare SCP2 e Cristiano Verna per assistenza editoriale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
&alfa; MEMEurocloneBE12-169F
GlutamminaLife-technologiesECB3000D
Siero fetale bovinoLife-technologiesECS0180DPR
hMCSFPeprotech300-25conservazione devono essere rispettate
hRANKLPeprotech310-01indicazioni per la conservazione devono essere rispettate
Fosfatasi acida, Kit leucociti (TRAP)Sigma Aldrich387 A
Terreni di separazione dei linfocitiBiowestL0560-100
Tampone per lisi dei globuli rossiSIgma11814389001
ROCHE
TripsinaEuroCloneCOD.
ECB3052D
Soluzione acquosa di paraformaldeide al 4%,microscopia elettronicaScienze 157-4-100
Linea cellulare MDA-MB-231ATCCCRM-HTB-267
MCF7ATCCHTB-22
TranswellCorning3470-ClearQuesti inserti sono per piastre a 24 pozzetti;
6,5 mm, 0,4 μ M;
dimensione dei pori
Le indicazioni per la Le di grado EM

Riferimenti

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Co-coltura del cancro al senoDifferenziamento RANKL MCSFCentrifugazione a gradiente di densitàColorazione TRAPTerreno condizionatoCo-coltura direttaAnalisi dell'espressione genicaWestern Blot
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