Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

Summary

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.

Abstract

Il crosstalk tra cellule tumorali e cellule di osso nel microambiente osseo è fondamentale per la comprensione del meccanismo di formazione di metastasi dell'osso. Abbiamo sviluppato un in vitro pienamente umano modello preclinico di un co-coltura delle cellule di cancro al seno e monociti in fase di differenziazione verso gli osteoclasti. Abbiamo ottimizzato un modello di osteoclastogenesi a partire da un campione di sangue periferico raccolto da donatori sani. Cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) sono state separate da centrifugazione in gradiente di densità, seminate ad una densità elevata e indotte a differenziarsi con l'aggiunta di due fattori di crescita (GFs): attivatore del ricevitore di fattore-κB nucleare ligando (RANKL) e del macrofago fattore distimolazione (MCSF). Le cellule erano lasciate in coltura per 14 giorni e quindi fisso e analizzate da analisi a valle. In metastasi osteolitiche, uno degli effetti dell'arrivo di cellule di cancro in osso è l'induzione di osteoclastogenesi. Così abbiamo sfidato il nostro modello con co-colture di cellule di cancro al seno per studiare il potere di differenziazione delle cellule tumorali rispetto a GFs. Un modo semplice per studiare l'interazione delle cellule osteoclasti di cancro è quello di eseguire indirette co-colture basate sull'uso del medium condizionato raccolti da colture di cellule di cancro al seno e mescolato con mezzo fresco. Questa miscela viene quindi utilizzata per indurre la differenziazione degli osteoclasti. Abbiamo inoltre ottimizzato un metodo di co-coltura diretta in cui il cancro cellule e monociti in fase di differenziazione il mezzo di condividere e scambiano fattori secreti. Questo è un miglioramento significativo sopra l'originale metodo di co-culture indiretta come i ricercatori possono osservare le interazioni reciproche dei due tipi cellulari ed eseguire analisi a valle per sia le cellule tumorali e gli osteoclasti. Questo metodo permette di studiare l'effetto delle droghe sul microambiente osseo metastatico e di linee cellulari di seme diverso da quelli derivati da cancro al seno. Il modello è utilizzabile anche per lo studio di altre malattie come l'osteoporosi o altre condizioni di osso.

Introduction

L'osso è un comune sito di metastasi per diversi tipi di tumori primari come il cancro della prostata, del polmone e del seno, con 20-25% dei pazienti che sviluppano metastasi ossee durante il corso della malattia^1,2,3. In particolare, il 70% dei pazienti di cancro al seno trasportare prova della metastasi dell'osso alla morte⁴. Tumore e cellule stromali interazione è essenziale per la progressione del cancro cancro primario sia lesioni secondarie. Nel microambiente osseo, metastasi osteolitiche dell'osso da cancro al seno dipendono l'istituzione di un....

Protocol

osteoclasti umani sono stati differenziati da PBMCs di donatori sani che hanno dato il consenso informato scritto a partecipare allo studio. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico locale, in conformità con gli standard etici stabiliti nella dichiarazione di Helsinki 1964.

1. differenziazione degli osteoclasti

Nota: raccogliere sangue periferico o buffy cappotti da donatori sani umani in EDTA. Non utilizzare meno di 20 mL di sangue periferico. Buffy coats sono preferibili perché hanno una maggiore abbondanza di cellule mononucleari. Eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio sterili per....

Results

Un metodo è stato ottimizzato per differenziare facilmente gli osteoclasti dai monociti del sangue periferico umano. La cultura del monocito è stata coltivata con le cellule tumorali, che conferma (come descritto nella letteratura¹⁸) che le cellule tumorali sono in grado di sostenere il osteoclastogenesi nelle metastasi dell'osso. Osteoclasti differenziano dalle cellule tumorali e GFs sono mostrati nella Figura 1. Una cella osteoclast-.......

Discussion

Modelli preclinici in vitro studiando i meccanismi di diafonia tra cellule tumorali e cellule ossee sono necessari per identificare i meccanismi della metastasi dell'osso che può essere utilizzato per creare nuove strategie terapeutiche. Abbiamo sviluppato un modello pienamente umana in vitro di osteoclastogenesis da sangue periferico umano (Figura 3). Durante l'ottimizzazione della metodologia, un numero di punti critici sono stato identificato e risolti. Il primo riguarda.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
&alfa; MEM	Euroclone	BE12-169F
Glutammina	Life-technologies	ECB3000D
Siero fetale bovino	Life-technologies	ECS0180DPR
hMCSF	Peprotech	300-25	conservazione devono essere rispettate
hRANKL	Peprotech	310-01	indicazioni per la conservazione devono essere rispettate
Fosfatasi acida, Kit leucociti (TRAP)	Sigma Aldrich	387 A
Terreni di separazione dei linfociti	Biowest	L0560-100
Tampone per lisi dei globuli rossi	SIgma	11814389001 ROCHE
Tripsina	EuroClone	COD. ECB3052D
Soluzione acquosa di paraformaldeide al 4%,	microscopia elettronica	Scienze 157-4-100
Linea cellulare MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-267
MCF7	ATCC	HTB-22
Transwell	Corning	3470-Clear	Questi inserti sono per piastre a 24 pozzetti; 6,5 mm, 0,4 μ M; dimensione dei pori