Articolo metodologico

Un metodo generale per la rilevazione Nitrosamide formazione nel metabolismo In Vitro di nitrosammine di citocromo P450s

DOI:

10.3791/56312

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25 settembre 2017

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1Department of Pharmacology, University of Minnesota, 2Masonic Cancer Center, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

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Α-idrossilazione di nitrosamine cancerogene dal citocromo P450s è accettata via metabolica che produce intermedi danneggiano il DNA, che causano mutazioni. Tuttavia, nuovi dati indicano ulteriore ossidazione a nitrosamides può verificarsi. Descriviamo un generale metodo per la rilevazione nitrosamides prodotta da in vitro metabolismo del citocromo P450-catalizzata di nitrosammine.

Abstract

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N-nitrosammine sono un gruppo ben consolidato degli agenti cancerogeni ambientali, che richiedono l'ossidazione del citocromo P450 per esibire l'attività. Il meccanismo di attivazione metabolica accettato coinvolge la formazione di α-hydroxynitrosamines che si decompongono spontaneamente agli agenti alchilanti del DNA. Accumulazione di danno del DNA e le mutazioni risultante in ultima analisi può portare al cancro. La nuova prova indica che α-hydroxynitrosamines può essere ulteriormente ossidata a nitrosamides processively dal citocromo P450s. Poiché nitrosamides sono generalmente più stabili di α-hydroxynitrosamines e anche possibile alchilare il DNA, nitrosamides possono svolgere un ruolo nella carcinogenesi. In questo rapporto, descriviamo un protocollo generale per valutare la produzione di nitrosamide da metabolismo P450-catalizzata-citocromo in vitro di nitrosammine. Questo protocollo utilizza un approccio generale alla sintesi del nitrosamides pertinenti e un in vitro del citocromo P450 metabolismo test utilizzando la spettrometria di massa tandem di cromatografia a fase mobile liquida-nanospray ionizzazione-alta risoluzione per il rilevamento. Questo metodo ha rilevato N′- nitrosonorcotinine come un metabolita secondario di N′- nitrosonornicotine nello studio di esempio. Il metodo ha alta sensibilità e selettivamente dovuto accurata rilevazione di masse. Applicazione di questo metodo per una vasta gamma di sistemi di nitrosamina-citocromo P450 aiuterà a determinare la generalità di questa trasformazione. Perché citocromo P450s sono polimorfici e variano in attività, una migliore comprensione della formazione di nitrosamide potrebbe aiutare nella valutazione del rischio di cancro individuali.

Introduzione

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N-nitrosammine sono una vasta classe di agenti cancerogeni trovati nella dieta, prodotti del tabacco e l'ambiente in generale; si possono anche formare in modo endogeno nel corpo umano1. Più di 300 N -nitroso composti sono stati testati e > 90% sono stati valutati come cancerogeni in modelli animali2,3. Per esibire la loro cancerogenicità, questi composti devono prima essere attivati dal citocromo P450s1,2,3. La ricerca dimostra che il citocromo P450s ossidare prontamente nitr....

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Protocollo

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1. materiali e procedure generali

  1. Synthesize NNN come precedentemente descritto 15. Ottenere norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, sistema di rigenerazione NADPH, tampone di reazione 0,5 x e tutte le altre sostanze chimiche o solventi da fonti commerciali in grado reagente.
  2. Gli spettri RMN record su uno spettrometro di 500 MHz. Prodotto chimico relazione sposta come parti per milione (ppm). Utilizzare picchi di solventi residui come riferimenti interni per 1 H-NMR (7,26 ppm CDCl 3) e 13 C-NMR (77,2 ppm CDCl 3).
    Nota: Peak spaccare usate le seguenti abbreviazioni: s = singolet....

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Risultati

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Basato sul lavoro di bianco et al. 19, norcotinine era nitrosi a NNC in modo pulito e nell'alto rendimento (80-92%) per produrre uno standard per l'esperimento in vitro . Prove strutturali per una reazione di successo è stata ottenuta da analisi spettroscopiche compreso 1H-NMR, 13C-NMR, COSY e HSQC (supporto informazioni) insieme a HRMS che ha confermato la massa di padre [M + H]+ all'interno di 5 ppm della valore .......

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Discussione

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Delucidamento il metabolismo di nitrosammine è un componente critico per comprendere la loro cancerogenicità. Poiché il coinvolto citocromo P450s e altri enzimi metabolici sono polimorfici, ulteriore applicazione di questa conoscenza potrebbe potenzialmente identificare gli individui ad alto rischio1,4. Nuovi dati indica che l'ulteriore ossidazione di α-hydroxynitrosamines, presunti principali metaboliti di nitrosammine coinvolti nel legame al DNA, a nitrosamides.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da grant no. CA-81301 dal National Cancer Institute. Ringraziamo Bob Carlson per assistenza editoriale, Dr. Peter Villalta e Xun Ming per assistenza di spettrometria di massa nella analitica biochimica ha condiviso risorsa del Masonic Cancer Center e Dr. Adam T. Zarth Dr. Anna K. Michel per le loro discussioni importanti e di input. La risorsa condivisa biochimica analitica è parzialmente supportata da nazionale Cancer Institute cancro centro supporto Grant CA-77598

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NorcotinineAKoS GmbH (Steinen, Germania)CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969
Acido aceticoSigma-Aldrich695092
Anidride aceticaSigma-Aldrich242845
Acetato di ammonioSigma-Aldrich431311
Idrossido di barioSigma-Aldrich433373
D-cloroformioSigma-Aldrich151823
HPLC AcetonitrileSigma-Aldrich34998
Solfato di magnesioSigma-AldrichM7506
Cloruro di metileneSigma-Aldrich34856
Nitrito di sodioSigma-Aldrich237213
ViVid CYP2A6 Kit di screening bluLife TechnologiesPV6140
Solfato di zincoSigma-Aldrich221376
provette da 0,5 mLFisherAB0533
Pallone a fondo tondo da 100 mLSigma-AldrichZ510424
Pallone da 125 mL ErlenmeyerSigma-AldrichCLS4980125
Imbuto separatore da 125 mLSigma-AldrichZ261017
25 mL rotondo pallone di fondoSigma-AldrichZ278262
spettrometro NMR 500 MHzBruker
Allegra X-22R CentrifugaBeckman-Coulter
fiale LCChromTechCTC... 0957– BOND
LTQ Orbitrap VelosThermo Scientific
Agitatore magneticoSigma-AldrichZ127035
Tubo NMRSigma-AldrichZ274682
pipette P1000, P200 e P10Eppendorf
Evaporatore rotanteSigma-AldrichZ691410
sistemaRSLCnano UPLCThermo Scientific
Agitazione Bagno d'AcquaFisherFSSWB15
Piastra di AgitazioneSigma-AldrichCLS6795420
PicoFritColonna Nuovo ObiettivoPF3607515N5
Luna C18, 5 umPhenomenex535913-1

Riferimenti

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  1. Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
  2. Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
  3. Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R.

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