Method Article

Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

DOI:

10.3791/56340

⸱

October 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 3Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 4Cellular and Molecular Pathology Graduate Program, University of Wisconsin-Madison, 5Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 6Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è un dispositivo compartimenti progettato per orientare e trattenere le larve di zebrafish. Il design permette di coda transection e a lungo termine raccolta di immagini di microscopia fluorescente ad alta risoluzione di guarigione delle ferite e la rigenerazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La larva di pesce zebra è un importante organismo modello per biologia inerente allo sviluppo e per la guarigione della ferita. Ulteriormente, la larva di pesce zebra è un prezioso sistema per live imaging ad alta risoluzione microscopica di fenomeni biologici dinamici nello spazio e nel tempo con cellulare ad alta risoluzione. Tuttavia, il metodo tradizionale di incapsulamento di agarosio per live imaging può ostacolare lo sviluppo larvale e la ricrescita del tessuto. Di conseguenza, questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è stato progettato e fabbricato come un dispositivo funzionalmente suddiviso in compartimenti per orientare le larve per microscopia ad alta risoluzione permettendo transection pinna caudale all'interno del dispositivo e lo sviluppo successivo coda sfrenato e ricrescita. Questo dispositivo permette di ferimento e a lungo termine imaging mantenendo attuabilità. Dato che la muffa di zWEDGI è stampato in 3D, la possibilità di personalizzazione delle sue geometrie lo rendono facilmente modificati per applicazioni di imaging di zebrafish diversificata. Inoltre, il zWEDGI offre che numerosi vantaggi, quali l'accesso alla larva durante la sperimentazione per ferire o per l'applicazione dei reagenti, parallelo orientamento delle larve multiple per l'imaging snella e riusabilità del dispositivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacità rigenerativa delle larve di zebrafish rerio del Danio li rendono un organismo modello ideale per esaminare la risposta di ferita così come la guarigione e la ricrescita1,2,3,4. Accesso a una serie di linee di zebrafish transgenici e trasparenza anatomica di zebrafish ulteriormente migliorare la loro utilità per gli studi in vivo di ferita risposta eventi, nonché a più lungo termine i processi rigenerativi4. Studio di questi processi biologici mediante microscopia a fluorescenza ad alta ri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: il disegno di base zWEDGI è stato formulato per le larve di zebrafish che sono post-fertilizzazione di 2-4 giorni (dpf) e seguono le linee guida del centro risorse animali ricerca Università del Wisconsin-Madison.

1. design e stampa 3D di stampi

  1. modello il PDMS componente del dispositivo con geometrie desiderate e attributi in un software 5 di modellazione 3D. Creare un assembly di uno stampo in bianco e la parte PDMS e generare uno stampo negativo per la parte PDMS creando una cavità nello stampo corrispondente alla parte PDSM. Salvare la muffa come un file. STL per la stampa 3D (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il dispositivo di microfluidica PDMS zWEDGI è un dispositivo funzionalmente suddiviso in compartimenti, progettato per ospitare quattro funzioni principali (elencate sotto) connesse con formazione immagine dal vivo della pinna caudale, ferendo la guarigione e la ricrescita nelle larve di zebrafish. PDMS è stato scelto per la fabbricazione di zWEDGI, perché non solo è prontamente disponibile e uno standard industriale per la biocompatibilità, ma funziona bene in stampi anche. Inoltre, PDMS.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo scopo del dispositivo zWEDGI è quello di catturare il lasso di tempo 3D imaging stabilizzando e orientare il pesce dentro la piccola distanza di lavoro di un obiettivo del microscopio ad alta risoluzione. Durante l'incontro di queste specifiche di progettazione, è anche un miglioramento rispetto tradizionale preparazione a base di agar per imaging dal vivo. Ci sono tre fasi critiche (sotto) nella fabbricazione di zWEDGI, che, se non eseguite correttamente, possono provocare dispositivi difettosi:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desidera ringraziare progetto primario finanziamento dell'Istituto Morgridge per la ricerca e il laboratorio per ottici e strumentazione computazionale. Riconosciamo anche finanziamenti dal NIH # R01GM102924 (AH e KWE). KH, JMS, RS, AH e KWE ideato e realizzato lo studio. KH e JMS effettuati tutti gli esperimenti con supporto da DL, KP e RS. KH, JS, RS, AH e KWE ha contribuito alla stesura del manoscritto.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research Software di modellazione 3DDassault SystèmesSPX0117-01Fisher Unitech
Viper Si2 SLA stampante3D 3D Systems Inc.23200-902Sistemi 3D Inc.
Resina fotopolimerica Accura 603D Systems Inc.24075-902Sistemi 3D Inc.
alcool denaturatoSunnyside5613735Menards
Apparecchio UV per la post-polimerizzazione 3DSystems Inc.23363-101-00Sistemi 3D Inc.
Guanti in nitrile TouchNTuffAnsell92-600McMaster Carr
220B, 400B, grana 600 T414 carta vetrata blu-bak.Norton66261139359, 54, 52MSC
disco in vetro borosilicato, diametro 2"McMaster-CarrMIL-G-47033McMaster-Carr
detergente per ultrasuoniBranson1510R-MTH
alcol isopropilico denaturato 70%Hydrox54845T43McMaster-Carr
10oz bicchiere di plastica trasparenteWNA Capolavoro557405Amazon
6 "bastone artigianalePerfect StixCraft WTD-500Amazon
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Fabbricare il dispositivo PDMS zWEDGI
elastomerico siliconico Sylgard 184Adesivi Dow-Corning4019862Ellworth
Siringa da 10 mlBecton Dickinson305219essiccatore Vitality Medical Inc
Bel-Art SciencewareF42027-0000Amazon
4 in morsetto a cricchettoPittsburgh68974Forno
da laboratorioQuincy Lab Inc.20GCGlobal
Aven549825ugello filtrato ad
aria compressaMcMaster-Carr InnotechTA-N2-2000FTCleanroom Supply
morsa da banco a vuotoWilton Tool Group63500MSC Industrial
55mm piatto inferiore in vetro; vetro di copertura da 30 mm a micropozzetto #1.5Cellvis
D60-30-1.5-Npulitore al plasmaHarrick PlasmaPDC-001Harrick Plasma
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Loading Larvae
Pipetteman, P200GilsonF123601
100% etanolo (diluito al 70% con acqua prima dell'uso)Pharmco-aaper111000200
Pipetta di trasferimentoFisherbrand13-711-5AFisher Scientific
scremato in polvereMP Biomedicals
acqua
N-feniltiorureaSigma-AldrichP7629Sigma-Aldrich
tricaina (etile 3-amminobenzoato)C-FINQ-UEWestern Chemical
agarosio a basso punto di fusioneSigma-AldrichA0701Blocco termico Sigma-Aldrich
(incubatore a bagno secco)Fisher Scientific11-718-2Fisher Scientific
E3 tampone 
punta per pipetta con orifizio grande, 200 uLFisherbrand02-707-134Fisher Scientific
Punta per pipetta per uso generale, 200 uLFisherbrand21-197-8EFisher Scientific
#15 lama per bisturi Feather2976Amazon
25G ago per siringaBD BD305122Fisher Scientific
NameCompanyNumero di catalogoComments
Imaging
reverse microscope
imaging ImarisBitplane
Kit ... Harbor Freight Set di pinzette industriali latte 2902887 doppia distillataSoftware di

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoo, S. K., Freisinger, C. M., LeBert, D. C., Huttenlocher, A. Early redox, Src family kinase, and calcium signaling integrate wound responses and tissue regeneration in zebrafish. J. Cell Biology. 199 (2), 225-234 (2012).
  2. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish LarvaeWound HealingLive ImagingPDMS Device3D PrintingMultiphoton MicroscopyCollagen Fiber AnalysisTissue RegrowthMicrofluidic ChannelsAgarose Encapsulation

Related Articles