Un metodo per ottenere nanopatterns irregolare Dendrimero-based che consentono il controllo su scala nanometrica di locale arginina-glicina-aspartico (RGD) superficie densità dell'acido è descritto e applicato per lo studio del differenziamento cellulare adesione e chondrogenic.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Basato su Dendrimero Nanopatterns irregolare alla localmente adesività di superficie di controllo: un metodo per dirigere la differenziazione Chondrogenic
In questo articolo
Sommario
Abstract
Differenziazione e adesione cellulare è condizionata dalla disposizione su scala nanometrica dei componenti della matrice extracellulare (ECM), con concentrazioni locali avendo un effetto importante. Qui presentiamo un metodo per ottenere nanopatterns su larga scala irregolare di arginina-glicina acido aspartico (RGD)-densità di superficie di dendrimeri funzionalizzati che consentono il controllo su scala nanometrica di RGD locale. Nanopatterns sono costituiti da superficie adsorbimento di dendrimeri da soluzioni a diverse concentrazioni iniziali e sono caratterizzate dall'angolo di contatto di acqua (CA), spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS), e scansione della sonda come tecniche di microscopia scansione microscopio a effetto tunnel (STM) e microscopia a forza atomica (AFM). La densità di superficie locale di RGD viene misurata utilizzando immagini AFM mediante mappe di contorno di probabilità delle distanze minime interparticella e quindi correlato con differenziazione e la risposta di adesione delle cellule. Il metodo nanopatterning presentato qui è una procedura semplice che può essere scalata in modo semplice per grandi superfici. Esso è quindi pienamente compatibile con protocolli della coltura delle cellule e può essere applicato a altri ligandi che esercitano effetti di concentrazione-dipendente sulle cellule.
Introduzione
Qui descriviamo una procedura semplice e versatile basato su Dendrimero nanopatterning per ottenere superfici di coltura delle cellule che consentono il controllo del locale adesività su nanoscala. Dettagli su scala nanometrica di organizzazione ECM sono stati segnalati,1,2,3 e il nanopatterning di superfici di adesione delle cellule ha fornito le comprensioni profonde il cellulare delle esigenze legate alla adesione4, 5. Gli esperimenti usando micellare basati su Litografia nanopatterns ha rivelato un valore di sogl....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. preparazione del substrato
-
Ricottura 1.4 x 1.1 cm au (111) su substrati di Mica.
- Posizionare il substrato au (111) su un piano di cottura di vetroceramica e temprare con una fiamma butano per 3 min Consenti il substrato per raffreddare sotto un'atmosfera di argon. Ripetere questo passaggio per ogni substrato au (111).
Nota: Substrati di au (111) devono essere utilizzati immediatamente dopo la ricottura.
- Posizionare il substrato au (111) su un piano di cottura di vetroceramica e temprare con una fiamma butano per 3 min Consenti il substrato per raffreddare sotto un'atmosfera di argon. Ripetere questo passaggio per ogni substrato au (111).
-
Preparazione di poli (acido L-lattico) (PLLA)-rivestito substrati di vetro.
- Tagliare e lavare i vetrini.
- Tagliare le diapositive di microscopia in 18 scivoli di 1,25 ....
- Tagliare e lavare i vetrini.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Presentiamo un metodo nanopatterning che permette adesività superficiale essere affrontati su scala nanometrica (Figura 1). La struttura chimica del RGD-Cys-D1 è mostrata in Figura 1A. Dendrimeri sono stati modellati su superfici conduttive elettriche di au (111) per caratterizzazione di STM ad alta risoluzione. Dendrimero basse concentrazioni in soluzione (fino a 10-5% w/w) resi dendrimeri isolato di 4-5 nm d.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Durante lo sviluppo del protocollo descritto, dovrebbe essere considerato un numero di passaggi critici. Il primo si riferisce alla GNSM caratterizzazione con tecniche di microscopia della sonda di scansione. Per visualizzare il nanopatterns, la superficie dove viene prodotto il patterning deve avere un valore di rugosità di sotto del diametro medio di dendrimeri, che è di circa 4 – 5 nm come misurato da STM (Figura 1B). Inoltre, si dovrebbe tener conto che la formazione immagine ad alta risoluzione STM .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono Oriol Font-Bach e Albert G. Castaño per il loro aiuto in dmin quantificazione. Riconoscono anche l'unità di microscopia digitale avanzato presso l'Istituto di ricerca in biomedicina (IRB Barcelona) affinché gli autori di registrare il video nei loro locali. Questo lavoro è stato supportato dal Networking Biomedical Research Center (CIBER), Spagna. CIBER è che un'iniziativa finanziata dal VI nazionale R & D & i piano 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programma Consolider, CIBER azioni e l'Instituto de Salud Carlos III, con il sostegno del Fondo europeo di sviluppo regionale. Questo lavoro è stato supportato dalla Commissione....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Oro (111) su mica. 1,4x1,1 cm | Spi Supplies | 466PS-AB | |
| Micro vetrini in vetro, lisci | Corning | 2947-75x25 | |
| Acqua deionizzata | Millipore | 18MΩ cm | |
| Etanolo 96% | PanReac | 131085.1212 | |
| Copolimero L-Lactide/DL-Lactide | Corbion | 95/05 rapporto molare | |
| 1,4 - diossano | Sigma-Aldrich | 296309-1L | |
| Olio di silicone, alta temperatura | Acros Organics | 174665000 | |
| Spinner | Laurell | WS-650MZ-23NPP/Lite | |
| Cappa a flusso laminare per colture tissutali | Telstar | Bio II Advance | Classe II cabina di sicurezza biologica |
| filtrante | Millex-GP | SLGP033RB | 0,22 &; m |
| Siringa 10 mL | Discardit | 309110 | |
| Microscopio a forza atomica | Veeco Instruments | Dimension 3000 Strumento | |
| Sonde AFM in silicio | Sensori economici | Tap300AI-G | Frequenza risonante 300 kHz, k = 40 N/m |
| Microscopio a scansione a effetto tunnel | Microscopio | PicoSPM | |
| Pt0.8:Ir0.2 filo | Avvento | PT671012 | Diametro 0,25 mm |
| WSxM 4.0 Software | Nanotec electronica | ||
| Sistema ottico dell'angolo di contatto (CA) | Dataphysics | ||
| Software SCA20 | Dataphysics | ||
| Spettrometro fotoelettronico a raggi X | Physical Electronics | Perkin-Elmer PHI 5500 Sistema | |
| Fibronectina da plasma bovino | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | 1.0 mL soluzione |
| Soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) | Gibco | 21600-10 | Polvere |
| Fibroblasti embrionali di topo | ATCC ATCC | CRL-1658 | NIH/3T3 |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquido ad alto glucosio | Gibco | 11960044 | glucosio alto liquido, senza glutammina, 500 ml |
| di siero fetale bovino (FBS) | Gibco | 16000044 | 500 mL |
| L-Glutammina | Invitrogen | 25030 | 200 mM (100X) |
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen | 15140 | |
| Piruvato di sodio | Invitrogen | 11360039 | 100 mL |
| Fiasche di coltura T75 | Nunclon | 156499 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25200072 | 0,25% EDTA |
| Centrifuga | Hermle Labortechnik | Z 206 A | |
| Piastra trattata con coltura non tissutale, 12 pozzetti | Falcon | 351143 | |
| HMSC di derivazione adiposa | non aderente ATCC | ATCC PCS-500-011 | Fiala cellulare 1 mL |
| MSC terreno basale | ATCC | ATCC PCS-500-030 | |
| Kit di crescita MSC | ATCC | ATCC PCS-500-040 | Siero basso |
| Strumento di differenziazione dei condrociti | ATCC | ATCC PCS-500-051 | |
| Soluzione di formalina | Sigma-Aldrich | HT5011-15ML | tamponato neutro, 10% |
| cloruro di ammonio | Sigma-Aldrich | A9434-500G | per biologia molecolare, adatto per colture cellulari, &ge. 99,5% |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | per biologia molecolare, utilizzata come tensioattivo non ionico, adiuvante |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-50G | |
| Coniglio monoclonale [Y113] anticorpo anti-paxillina | Abcam | ab32084 | Diluito 1:200 |
| Catena monoclonale di topo [1F5] anti-collagene alfa-1 XX | Acris Antibodies | AM00212PU-N | diluito: 1:400 |
| Alexa Fluor 488-coniugato capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo secondario | Invitrogen | A10667 | 2 mg/mL. Anticorpo secondario diluito 1:1000 |
| Alexa Fluor 568-coniugato di capra anti-coniglio IgG (H+L) | Invitrogen | A11036 | 2 mg/mL. Diluito 1:1000 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 10ML | 10 mg/mL. Vetro di copertura diluito 1:1000 |
| 24x24 mm | Deltalab | D102424 | |
| Fluoromount Microscopio | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | |
| Microscopio verticale Nikon | Eclipse E1000 | con telecamera CCD | |
| Microscopio confocale | Microsystems | Microscopio confocale verticale Leica SPE | |
| ImageJ 1.50g freeware | |||
| software MATLAB | La MATHWORKS, Inc. | ||
| Software OriginPro 8.5 | Coordinamento |
Riferimenti
- Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
