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Articolo metodologico

Basato su Dendrimero Nanopatterns irregolare alla localmente adesività di superficie di controllo: un metodo per dirigere la differenziazione Chondrogenic

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DOI:

10.3791/56347

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20 gennaio 2018

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1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

In questo articolo

Sommario

Un metodo per ottenere nanopatterns irregolare Dendrimero-based che consentono il controllo su scala nanometrica di locale arginina-glicina-aspartico (RGD) superficie densità dell'acido è descritto e applicato per lo studio del differenziamento cellulare adesione e chondrogenic.

Abstract

Differenziazione e adesione cellulare è condizionata dalla disposizione su scala nanometrica dei componenti della matrice extracellulare (ECM), con concentrazioni locali avendo un effetto importante. Qui presentiamo un metodo per ottenere nanopatterns su larga scala irregolare di arginina-glicina acido aspartico (RGD)-densità di superficie di dendrimeri funzionalizzati che consentono il controllo su scala nanometrica di RGD locale. Nanopatterns sono costituiti da superficie adsorbimento di dendrimeri da soluzioni a diverse concentrazioni iniziali e sono caratterizzate dall'angolo di contatto di acqua (CA), spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS), e scansione della sonda come tecniche di microscopia scansione microscopio a effetto tunnel (STM) e microscopia a forza atomica (AFM). La densità di superficie locale di RGD viene misurata utilizzando immagini AFM mediante mappe di contorno di probabilità delle distanze minime interparticella e quindi correlato con differenziazione e la risposta di adesione delle cellule. Il metodo nanopatterning presentato qui è una procedura semplice che può essere scalata in modo semplice per grandi superfici. Esso è quindi pienamente compatibile con protocolli della coltura delle cellule e può essere applicato a altri ligandi che esercitano effetti di concentrazione-dipendente sulle cellule.

Introduzione

Qui descriviamo una procedura semplice e versatile basato su Dendrimero nanopatterning per ottenere superfici di coltura delle cellule che consentono il controllo del locale adesività su nanoscala. Dettagli su scala nanometrica di organizzazione ECM sono stati segnalati,1,2,3 e il nanopatterning di superfici di adesione delle cellule ha fornito le comprensioni profonde il cellulare delle esigenze legate alla adesione4, 5. Gli esperimenti usando micellare basati su Litografia nanopatterns ha rivelato un valore di soglia di circa 70 nm per RGD peptide nanospacing, adesione delle cellule significativamente in ritardo sopra questo valore6,7,8 ,9. Questi studi hanno evidenziato l'influenza maggiore di locali di densità globale ligando delle cellule adesione9,10,11.

Durante la morfogenesi, interazioni cellula con l'ambiente circostante innescano i primi eventi di differenziazione, che continuano fino a quando sono state formate strutture del tessuto complesso finale. In questo quadro, le superfici nanostrutturati sono state usate per affrontare l'influenza delle interazioni cellula-superficie iniziale sulla morfogenesi. Basato su Litografia RGD nanopatterns con una spaziatura laterale di 68 nm a β-tipo Ti-40Nb leghe aiutano a mantenere il fenotipo indifferenziato di liberi cellule staminali12, mentre RGD nanospacings di fra 95 e 150 nm che permettono di migliorare la differenziazione dei cellule staminali mesenchimali (MSCs) verso adipogenico/osteogeniche13,14,15 e condrogenica destini16. Inoltre, autoassemblanti macromolecole modificate con componenti di segnalazione sono stati indicati per diretta adesione delle cellule e differenziazione fornendo il regolamento architettonica su scala nanometrica delle stecche segnalazione17. A questo proposito, la deposizione di dendrimeri con moiety d'interazione delle cellule nella loro sfera esterna18,19,20 sulle superfici è stata utilizzata per lo studio delle cellule adesione21,22, morfologia23,24e migrazione eventi25,26. Tuttavia, la mancanza di caratterizzazione delle superfici in questi studi rende difficile stabilire alcuna correlazione tra Configurazione superficie Dendrimero e risposta cellulare.

Dendrimero nanopatterns con liquido-come ordine e spaziatura definito possono essere ottenuti quando dendrimeri adsorbono a bassa carica superfici dalle soluzioni con bassa forza ionica. 27 sulla base di questa proprietà, qui vi presentiamo un metodo per ottenere nanopatterns su larga scala irregolare di dendrimeri funzionalizzati RGD su superfici di carica bassa che consentono il controllo su scala nanometrica di densità superficiale RGD locale. Angolo di contatto acqua (CA), spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS) e scansione sonda microscopia tecniche (STM e AFM nanopatterns) Visualizza che densità locale ligando può essere regolato modificando la concentrazione iniziale Dendrimero in soluzione. La densità di superficie RGD locale è quantificata da immagini AFM di contorno mappe di probabilità di distanze minime interparticella e quindi correlata con esperimenti cellulari. Confrontato con altre tecniche di nanopatterning4, basato su Dendrimero nanopatterning è semplice e può essere facilmente scalato per grandi superfici, essendo così completamente compatibile con applicazioni della coltura delle cellule. Nanopatterns vengono utilizzati come substrati bioattivi per valutare l'effetto della densità superficiale di RGD locale su cellula adesione28 e sull'induzione condrogenica di adulto umano MSCs29. I nostri risultati indicano che RGD basati su Dendrimero nanopatterns sostenere la crescita delle cellule e che adesione delle cellule è rinforzata da alta densità di superficie RGD locale. Negli esperimenti di differenziazione, intermedio adesività delle cellule ai substrati favorito MSC condensa e differenziazione condrogenica iniziale. A causa della facilità con cui Dendrimero gruppi periferici possono essere modificati, il metodo qui descritto può essere ulteriormente esteso per altri ligandi di ECM che esercitano effetti di concentrazione-dipendente sulle cellule.

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Protocollo

1. preparazione del substrato

  1. Ricottura 1.4 x 1.1 cm au (111) su substrati di Mica.
    1. Posizionare il substrato au (111) su un piano di cottura di vetroceramica e temprare con una fiamma butano per 3 min Consenti il substrato per raffreddare sotto un'atmosfera di argon. Ripetere questo passaggio per ogni substrato au (111).
      Nota: Substrati di au (111) devono essere utilizzati immediatamente dopo la ricottura.
  2. Preparazione di poli (acido L-lattico) (PLLA)-rivestito substrati di vetro.
    1. Tagliare e lavare i vetrini.
      1. Tagliare le diapositive di microscopia in 18 scivoli di 1,25 x 1,25 cm con una fresa a punta di diamante. Fare una piccola rientranza sul lato inferiore di ogni diapositiva, in modo che i lati superiori e inferiori si possono distinguere più tardi.
      2. Lavare i vetrini con acqua deionizzata seguita da etanolo al 96%. Lasciarli asciugare all'aria.
    2. Preparare la soluzione PLLA 2%.
      1. Aggiungere 200 mg di PLLA a 10 mL di 1,4-diossano in un tubo di pressione. Aggiungere una barra per l'agitazione e chiudere saldamente la provetta.
      2. Posizionare il tubo di pressione in un bagno di glicerina su una piastra calda a 60 ° C sotto agitazione delicata per 24 h e quindi trasferire la soluzione in un flaconcino di vetro da 15 mL.
    3. Rivestimento i vetrini con la soluzione PLLA.
      1. Posizionare i vetrini e il flaconcino con la soluzione PLLA su una piastra calda pulita a 60 ° C. Assicurarsi di inserire le diapositive rivolta verso l'alto e consentire loro di rimanere per almeno 10 minuti per raggiungere la temperatura necessaria.
      2. Preparare la spalmatrice di spin e impostare il programma specificato nella tabella 1.
      3. Posizionare una delle diapositive a faccia in sulla SPALMATRICE di spin, utilizzando un sistema di vuoto. Con una pipetta Pasteur, applicare 0,25 mL di soluzione di PLLA alla diapositiva, assicurandosi che l'intera superficie è coperta. Eseguire il programma di rivestimento. Ripetere questo passaggio per ogni diapositiva.

2. Dendrimero Nanopatterning

  1. Preparazione delle soluzioni di 28 Dendrimero RGD-funzionalizzate (RGD-Cys-D1).
    1. Sciogliere 5 mg di Dendrimero in 6,494 mL di acqua deionizzata. Questa è la soluzione A.
      Nota: Utilizzare la soluzione di riserva Dendrimero entro 6 mesi di preparazione.
    2. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione A per 10 min e preparare soluzioni B e C seguente tabella 2.
    3. Sottoporre ad ultrasuoni soluzione C per 10 min e preparare soluzioni D, E e F seguente tabella 2.
    4. Conservare soluzioni B, C, D, E e F a 4 ° C fino all'utilizzo. Soluzione A possa essere conservata a-20 ° C per un uso successivo.
  2. Nanopatterning di RGD-Cys-D1 dendrimeri sui substrati
    1. In una cappa di coltura del tessuto, sterilizzare i substrati da loro irradiazione con luce UV per 13 min.
      Nota: Questo passaggio è necessario solo quando i substrati nanostrutturati stanno per essere utilizzati come substrati di coltura delle cellule. In questo caso, mantenere le condizioni di sterilità (cappa di coltura di tessuti, materiali sterili, soluzioni e tecniche) per le seguenti operazioni.
    2. Posizionare ogni substrato scoperte nei pozzetti di una piastra, gestirli attentamente con le pinzette.
    3. Sonicare soluzioni B, C, D, E e F per 10 min.
    4. Passare le soluzioni Dendrimero RGD-Cys-D1 attraverso un filtro di diametro 0,22 µm utilizzando una siringa direttamente nei pozzetti contenenti substrati (2 mL/pozzetto). Almeno tre repliche per concentrazione Dendrimero sono raccomandate. Chiudere e sigillare la piastra e lasciarlo a temperatura ambiente (TA) per 16 h.
    5. Rimuovere e scartare le soluzioni. Lavare i substrati con acqua deionizzata sterile e asciugare. Substrati di negozio a 4 ° C.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. preparazione di substrati di controllo

Nota: Tutti i passaggi sono stati eseguiti in un cappuccio sterili per coltura e solo materiali sterili, soluzioni e tecniche sono state usate. Almeno, sei di controllo substrati sono state usate (tre repliche del controllo positivo) e tre repliche del controllo negativo.

  1. In una cappa di coltura del tessuto, sterilizzare i substrati da loro irradiazione con luce UV per 13 min.
  2. Substrati di controllo per l'esperimento di aderenza del fibroblasto.
    1. Utilizzare substrati di fiamma-ricotto au (111) come controllo negativo. L'oro ha un effetto ben noto di denaturazione proteica che conferisce proprietà adesive delle anti-cellule28. Sottoporre ad ultrasuoni tutte le soluzioni e filtrare prima dell'incubazione del substrato.
    2. Per i controlli positivi, immergere fiamma-ricotto di substrati di au (111) in una soluzione di PEG RGD-modificato del tiolo, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glicole mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH):30 e trietilene glicole mono-11-mercaptoundecyl etere (PEG-SH) a un rapporto molare 1: 100 in etanolo al 96% per 16 h a TA.
    3. Lavare accuratamente substrati in etanolo e asciugarle con argon. Substrati di negozio a 4 ° C.
  3. Controllo substrati Chondrogenesis.
    1. Utilizzare substrati PLLA incontaminate come controllo negativo. Senza alcun trattamento superficiale, PLLA dimostra scarsa interfacciamento con le cellule viventi. 31
    2. Per i controlli positivi, preparare 5 mL di fibronectin di 0,1 mg/mL in tampone fosfato salino (PBS) e incubare ogni substrato PLLA con 1,6 mL della soluzione di fibronectina per 1 h a TA.
    3. Rimuovere e scartare la soluzione di fibronectina e lavare i substrati con PBS. Substrati di negozio a 4 ° C.

4. superficie caratterizzazione

  1. Formazione immagine AFM
    1. Eseguire formazione immagine AFM di substrati PLLA per un'analisi di rugosità. Poiché dendrimeri hanno un diametro di 4-5 nm, valori di rugosità di 1 nm dovrebbe essere ottenuta per la corretta visualizzazione della nanopatterns. Inoltre, eseguire formazione immagine AFM della nanopatterns. In entrambi i casi, è necessario eseguire AFM in modalità in aria a intermittenza.
    2. Selezionare un cantilever di silicio con una molla di costante k = 40 N/m e una frequenza di risonanza ν = 300 kHz e montarlo sull'apparecchiatura AFM.
    3. Inserire il campione sul palco del microscopio a forza atomica. A seconda della configurazione dell'apparato, tuning e specifiche possono variare. Consultare il manuale del produttore.
    4. Approccio il campione con la punta del microscopio fino al contatto.
    5. Per realizzare l'immagine PLLA per analisi di rugosità, è necessario selezionare almeno quattro aree rappresentative di 20x20 µm al substrato da tre substrati indipendente. Dendrimero nanopatterns di immagine, scegliere almeno tre immagini rappresentative di 5 × 5 µm al substrato da tre substrati indipendenti a condizione (Dendrimero iniziale concentrazione in soluzione). Per evitare di danneggiare il layer Dendrimero durante la formazione immagine, regolare il set point per mantenere la forza al minimo.
      Nota: La scelta dell'area di imaging dipende anche il campo di lavoro dello scanner piezoelettrico. A questo proposito si prega di consultare il manuale dello strumento.
    6. Processo l'altezza AFM immagini inserendo ogni scansione riga per polinomio livellamento funzioni utilizzando il software proprietario del produttore dell'apparato AFM e analizzare quelli da PLLA per calcolare la rugosità superficiale. Root-mean square (RMS) analisi può fornire un'opzione adatta.
  2. Misura di densità superficiale di RGD locale.
    1. Ottenere le soglie di immagine delle immagini elaborate di altezza AFM per selezionare i dendrimeri sulla superficie.
    2. Determinare le posizioni delle particelle utilizzando una software di elaborazione di immagini e li usa per ottenere le distanze minime interparticella (dmin).
    3. Stampa valorimin da z per le posizioni di particella corrispondente per ottenere le mappe di contorno di probabilità per dmin. Regolare la scala di colore della trama per visualizzare le regioni di più alta densità superficiale per locale RGD (dmin < 70 nm).
    4. Quantificare l'area delle regioni con la più alta densità superficiale locale RGD utilizzando una software di elaborazione di immagini. Includono le zone di Dendrimero aggregati nel calcolo.
  3. Imaging di STM.
    Nota: la formazione immagine STM può essere eseguita solo per nanopatterns su substrati conduttivi di au (111). Misurazioni sono fatte in aria.
    1. Posto il substrato nanostrutturati in supporto del campione dell'apparecchiatura STM. Controllare il collegamento elettrico tra campione e titolare con un tester.
    2. Etch un suggerimento del materiale selezionato sonda (vale a dire. PT 0,8: Ir 0,2) con un diametro che assicura il corretto montaggio sulla testa dell'apparecchiatura STM. Acquaforte può essere eseguita mediante taglio manuale o incisione elettrochimica. 32
      Nota: Acquaforte elettrochimica rende più punte simmetriche.
    3. Montare la punta alla testa dell'apparecchiatura STM e collegare il campione.
    4. Impostare "corrente" nel canale di feedback (in questo tipo di misurazione, attuale sarà costante di feedback tuning). Regolare la tensione di polarizzazione e punto impostato corrente e dimensioni di scansione per ottenere un'immagine ben risolta una volta che la punta è impegnata.
      Nota: La scelta dell'area di imaging dipende anche il campo di lavoro dello scanner piezoelettrico. A questo proposito si prega di consultare il manuale dello strumento.
    5. Processo le immagini topografiche STM inserendo ogni linea di scansione a livellare la polinomiale funzioni usando il software proprietario del produttore dell'apparato STM.
  4. Misure di CA.
    1. Misura CA sui substrati nanostrutturati mediante il metodo sessile-goccia tre diverse posizioni su tre substrati indipendenti a condizione (Dendrimero iniziale concentrazione in soluzione) con un sistema ottico di CA.
    2. Riempire la microsiringa con acqua deionizzata e impostare i parametri del software di CA per produrre gocce di 1 µ l.
    3. Posizionare il campione sul palco in modo che la superficie del campione è chiaramente visibile sul computer per l'imaging.
    4. Spostare la siringa con il micromanipolatore, fino a quando si arriva vicino alla superficie e versare la goccia sulla superficie. Registrare l'immagine immediatamente dopo la stabilizzazione della gocciolina.
      Nota: Nelle misurazioni di CA, è molto importante controllare l'umidità al fine di ottenere risultati riproducibili.
    5. Analizzare il CAs misurato con il software proprietario del produttore dell'apparato di CA. Il metodo di montaggio può essere regolato ai requisiti utente. Il metodo di montaggio ellittica può essere un'opzione.

5. coltura cellulare

Nota: Tutti i passaggi sono stati eseguiti in una cappa di coltura del tessuto e solo materiali sterili, soluzioni e tecniche sono state usate.

  1. Esperimento di aderenza del fibroblasto.
    1. Cultura di fibroblasti embrionali del mouse di NIH 3T3 dai primi passaggi (< 10) a 37 ° C e atmosfera al 4,6% CO2 in sostanza basale con alto glucosio completato con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, piruvato di sodio di penicillina-streptomicina e l'1% 1% (crescita medio). T75 boccette per una semina totale di 500.000 cellule per fiaschetta in 10 mL di terreno di coltura sono raccomandati.
    2. Rimuovere il vecchio mezzo con una pipetta 10ml ogni 2 giorni e sostituire con 10 mL di terreno di coltura preparati al momento.
    3. Cellule di cultura nel mezzo di crescita fino a raggiungere intorno 80% confluenza, quindi rimuovere il mezzo e aggiungere 5 mL di tripsina per fiaschetta. Per garantire la separazione adeguata delle cellule dal fondo del matraccio, mantenere la soluzione di tripsina in contatto con le cellule per 5 min a 37 ° C.
    4. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura per fiaschetta e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga. Centrifugare le cellule a 470 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura. Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro.
    5. Trasferire i substrati per bene le piastre non trattati per coltura tissutale (antiaderente).
    6. Le cellule sui substrati ad una densità di 4.000 cellule/cm2 a crescita medio di semi e li Incubare per 4,5 h a 37 ° C e 10% di CO2 in atmosfera.
  2. Induzione condrogenica delle MSC.
    1. MSCs umano dai primi passaggi della coltura (< 5) a 37 ° C e del 4,6% CO2 in atmosfera nel mezzo di crescita di MSC. T75 boccette per una semina totale di 500.000 cellule per fiaschetta in 10 mL di terreno di coltura sono raccomandati.
    2. Sostituire il terreno ogni 3 giorni (come descritto in 5.1.2).
    3. Tripsinizzano cellule prima 80% confluenza è raggiunto e centrifugare e risospendere li in mezzo di sviluppo di MSC (come descritto in 5.1.3). Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro.
    4. Centrifugare le cellule ancora e li risospendere in 10 mL di terreno che inducono chondrogenesis.
    5. Trasferire i substrati dalle piastre nuove piastre a pozzetti non trattate per coltura tissutale (antiaderente). Seme le cellule sui substrati ad una densità di 3.000 cellule/cm2.
    6. Modificare il mezzo condrogenica ogni 3 giorni (come descritto in 5.1.2).

6. fissaggio e Immunostaining delle cellule

Nota: La seguente procedura può essere eseguita in condizioni non sterili.

  1. Rimuovere il supporto e lavare le cellule delicatamente con PBS. Correggerli aggiungendo una soluzione di formalina al 10% per 20 min a TA.
  2. Rimuovere la formalina e lavare le cellule con PBS.
  3. Bloccare i gruppi di aldeide gratis aggiungendo una soluzione di 50 mM di cloruro di ammonio (NH4Cl) in PBS. Lasciare le cellule per 20 min a RT. rimuovere NH4Cl soluzione e lavare le cellule con PBS.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C.
  4. Rimuovere PBS e permeabilize le cellule aggiungendo una soluzione di 0,1% di saponina nella soluzione bloccante (1% di albumina in PBS) per 10 min al RT. Wash le cellule con PBS e trasferire campioni per una nuova piastra bene.
  5. Incubare le cellule con una soluzione di anticorpi primari nella soluzione bloccante (tabella 3) per 1 h a TA. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario, quindi lavare le cellule con PBS.
  6. Incubare le cellule con anticorpi secondari nella soluzione bloccante (tabella 3) per 1 h a TA.
    Nota: Evitare di luce dell'esposizione.
  7. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare le cellule con PBS e asciugare.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C al buio.
  8. Montaggio del campione per l'osservazione del microscopio: utilizzando una fresa a punta di diamante, lamelle tagliate a 1,25 cm x 1,25 cm. applicare 50 µ l di microscopia mezzo su campioni di montaggio e coprire delicatamente con il coprioggetto taglio.
  9. Trasferire i campioni a un destinatario conveniente, coprire con foglio di alluminio e negozio al buio a 4 ° C fino a osservazione.

7. cell Imaging e l'analisi di dati

Nota: Per opaco au (111) e substrati spessi basati su 2mpx, deve essere utilizzato un microscopio dritto.

  1. Esperimento di aderenza del fibroblasto.
    1. Uso di un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera digitale, basso (cioè 10 X) e alto (cioè 40 X) ingrandimento obiettivi. Effettuare misurazioni in aria.
    2. Posizionare il campione sui nuclei delle cellule palcoscenico e immagine con l'obiettivo 10x utilizzando un'eccitazione ultravioletta, filtro di emissione longpass per visualizzare la macchia di Hoechst/DAPI.
    3. Immagine cella citoscheletro e adesioni focali (FAs) con l'obiettivo 40x, selezionando il filtro di microscopio che corrisponde alle specifiche di fluorocromo anticorpo corrispondente.
    4. Per la quantificazione di FA, utilizzare una software di elaborazione di immagini per convertire immagini in file a 8 bit. Rimuovere le immagini di sfondo e convertire in binario impostando una soglia. Calcolare almeno 30 immagini al campione e considera FAs da 1 µm2 per il calcolo.
  2. Induzione condrogenica delle MSC.
    1. Condensati di cella di immagine alle fasi iniziali della induzione condrogenica (< 5 giorni) con un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di una fotocamera digitale e una bassa (cioè 10 X) obiettivo di ingrandimento. Filtro di emissione ultravioletto di eccitazione e longpass consente di visualizzare la macchia di Hoechst/DAPI.
    2. Per misurare la superficie di condensa, utilizzare un software di elaborazione dell'immagine, convertire immagini in file a 8 bit, rimuovere lo sfondo e selezionare una soglia che mette in evidenza il contorno di aggregato. Calcolare l'area delle particelle.
    3. Immagini di esempio immunostained per FAs, fibre di actina del citoscheletro e cartilagine specifico collagene tipo II alfa 1 (COL2A1) con un microscopio confocale dritto ad alto ingrandimento (cioè 40-60 X). Raccogliere le sezioni a intervalli rappresentativo (cioè 0,5 – 1 µm).
    4. Per elaborare lo stack, utilizzare una software di elaborazione di immagini. Convertire immagini in file a 8 bit, rimuovere lo sfondo e renderli binario impostando una soglia. Trattare un minimo di tre condensati di cella a condizione di tre campioni indipendenti.
    5. Quantificare la proteina FA tinto aree dalla zona basale dei condensati di cella e di esprimere come la corrispondente percentuale di area divisa per il numero dei nuclei delle cellule nell'immagine.
    6. Per misurare la macchiatura COL2A1, utilizzare confocale z-proiezioni e quantificare la somma dell'area proiettata (con una superficie massima di COL2A1 per campione). Normalizzare il valore dell'area ottenuto contro la zona della condensa corrispondente.

8. quantitativa analisi di reazione a catena (qRT-PCR) della trascrizione-polimerasi inversa

Nota: Per evitare la contaminazione di RNasi, utilizzare oggetti in plastica monouso, sterile e indossare guanti monouso durante la manipolazione di reagenti e RNA. Sempre utilizzare tecniche asettiche microbiologici adeguate e una soluzione appropriata decontaminazione per rimuovere la contaminazione RNasi da superfici di lavoro e gli elementi riutilizzabili come centrifughe e pipette.

  1. Isolare il RNA totale e si polverizzare in un disgregatore di RNA. Trattare i campioni di RNA con DNasi e convertirli in cDNA usando un kit di sintesi di cDNA.
  2. Condurre qRT-PCR utilizzando primers per il fattore di trascrizione SOX9. Beta-2-microglobulina (B2M) e proteina ribosomale L13a (RPL13a) può essere utilizzato come geni housekeeping.
  3. Calcolare i livelli di espressione e normalizzarli contro il controllo negativo (PLLA).

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Risultati

Presentiamo un metodo nanopatterning che permette adesività superficiale essere affrontati su scala nanometrica (Figura 1). La struttura chimica del RGD-Cys-D1 è mostrata in Figura 1A. Dendrimeri sono stati modellati su superfici conduttive elettriche di au (111) per caratterizzazione di STM ad alta risoluzione. Dendrimero basse concentrazioni in soluzione (fino a 10-5% w/w) resi dendrimeri isolato di 4-5 nm d...

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Discussione

Durante lo sviluppo del protocollo descritto, dovrebbe essere considerato un numero di passaggi critici. Il primo si riferisce alla GNSM caratterizzazione con tecniche di microscopia della sonda di scansione. Per visualizzare il nanopatterns, la superficie dove viene prodotto il patterning deve avere un valore di rugosità di sotto del diametro medio di dendrimeri, che è di circa 4 – 5 nm come misurato da STM (Figura 1B). Inoltre, si dovrebbe tener conto che la formazione immagine ad alta risoluzione STM ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono Oriol Font-Bach e Albert G. Castaño per il loro aiuto in dmin quantificazione. Riconoscono anche l'unità di microscopia digitale avanzato presso l'Istituto di ricerca in biomedicina (IRB Barcelona) affinché gli autori di registrare il video nei loro locali. Questo lavoro è stato supportato dal Networking Biomedical Research Center (CIBER), Spagna. CIBER è che un'iniziativa finanziata dal VI nazionale R & D & i piano 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programma Consolider, CIBER azioni e l'Instituto de Salud Carlos III, con il sostegno del Fondo europeo di sviluppo regionale. Questo lavoro è stato supportato dalla Commissione per l'Università e la ricerca del dipartimento innovazione, Università e impresa della Generalitat de Catalunya (2014 SGR 1442). È stato inoltre finanziato dai progetti OLIGOCODES (No. MAT2012-38573-C02) e CTQ2013-41339-P, assegnato dal Ministero spagnolo dell'economia e competitività, in aggiunta a INTERREG va Spagna-Portogallo 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P riconosce sostegno finanziario dalla concessione Ministero dell'economia e della competitività spagnolo (n. IFI15/00151).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Oro (111) su mica. 1,4x1,1 cm Spi Supplies466PS-AB
Micro vetrini in vetro, lisciCorning2947-75x25
Acqua deionizzataMillipore18MΩ cm
Etanolo 96%PanReac131085.1212
Copolimero L-Lactide/DL-LactideCorbion95/05 rapporto molare
1,4 - diossanoSigma-Aldrich296309-1L
Olio di silicone, alta temperaturaAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Cappa a flusso laminare per colture tissutaliTelstarBio II AdvanceClasse II cabina di sicurezza biologica
filtranteMillex-GPSLGP033RB0,22 &; m
Siringa 10 mLDiscardit309110
Microscopio a forza atomicaVeeco InstrumentsDimension 3000 Strumento
Sonde AFM in silicioSensori economiciTap300AI-GFrequenza risonante 300 kHz, k = 40 N/m
Microscopio a scansione a effetto tunnelMicroscopioPicoSPM
Pt0.8:Ir0.2 filoAvventoPT671012Diametro 0,25 mm
WSxM 4.0 SoftwareNanotec electronica
Sistema ottico dell'angolo di contatto (CA)Dataphysics
Software SCA20Dataphysics
Spettrometro fotoelettronico a raggi XPhysical ElectronicsPerkin-Elmer PHI 5500 Sistema
Fibronectina da plasma bovinoSigma-AldrichF1141-1MG1.0 mL soluzione
Soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS)Gibco21600-10Polvere
Fibroblasti embrionali di topoATCC ATCCCRL-1658NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquido ad alto glucosioGibco11960044glucosio alto liquido, senza glutammina, 500 ml
di siero fetale bovino (FBS)Gibco16000044500 mL
L-GlutamminaInvitrogen25030200 mM (100X)
Penicillina-streptomicinaInvitrogen15140
Piruvato di sodioInvitrogen11360039100 mL
Fiasche di coltura T75Nunclon156499
TrypsinLife Technologies252000720,25% EDTA
CentrifugaHermle LabortechnikZ 206 A
Piastra trattata con coltura non tissutale, 12 pozzettiFalcon351143
HMSC di derivazione adiposanon aderente ATCCATCC PCS-500-011Fiala cellulare 1 mL
MSC terreno basaleATCCATCC PCS-500-030
Kit di crescita MSCATCCATCC PCS-500-040Siero basso
Strumento di differenziazione dei condrocitiATCCATCC PCS-500-051
Soluzione di formalinaSigma-AldrichHT5011-15MLtamponato neutro, 10%
cloruro di ammonioSigma-AldrichA9434-500Gper biologia molecolare, adatto per colture cellulari, &ge. 99,5%
SaponinaSigma-Aldrich47036-50G-Fper biologia molecolare, utilizzata come tensioattivo non ionico, adiuvante
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Coniglio monoclonale [Y113] anticorpo anti-paxillinaAbcamab32084Diluito 1:200
Catena monoclonale di topo [1F5] anti-collagene alfa-1 XX Acris AntibodiesAM00212PU-Ndiluito: 1:400
Alexa Fluor 488-coniugato capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo secondarioInvitrogenA106672 mg/mL. Anticorpo secondario diluito 1:1000
Alexa Fluor 568-coniugato di capra anti-coniglio IgG (H+L)InvitrogenA110362 mg/mL. Diluito 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. Vetro di copertura diluito 1:1000
24x24 mmDeltalabD102424
Fluoromount MicroscopioSigma-AldrichF4680-25ML
Microscopio verticale NikonEclipse E1000con telecamera CCD
Microscopio confocaleMicrosystemsMicroscopio confocale verticale Leica SPE
ImageJ 1.50g freeware
software MATLABLa MATHWORKS, Inc.
Software OriginPro 8.5Coordinamento
UnitàAFM per imaging molecolaremultitecnica a epifluorescenza Leica http://imgej.nih.gov/ij OriginLab

Riferimenti

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046(2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96(2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

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