Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Summary

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Abstract

Criteri di risposta nella leucemia mieloide acuta (AML) recentemente è stato ristabilito, con esame morfologico utilizzato per determinare se i pazienti hanno realizzato la remissione completa (CR). Circa la metà dei pazienti adulti che sono entrati CR sarà ricaduta entro 12 mesi dovuto la conseguenza di cellule residue di AML nel midollo osseo. La quantificazione di questi restanti cellule di leucemia, note come malattia residua minima o misurabile (MRD), può essere un biomarcatore affidabile per la previsione di queste ricadute. Inoltre, l'analisi retrospettiva di numerosi studi ha dimostrato che la presenza di MRD nel midollo osseo dei pazienti LMA correla con la sopravvivenza difficile. Non solo è la totale popolazione leucemica, riflessa dalle cellule che harboring una leucemia associato immunitario-fenotipo (LAIP), connesso con risultato clinico, ma così è la sottopopolazione immaturo bassa frequenza delle cellule staminali leucemia (LSC), entrambi i quali possono essere monitorati tramite flusso cytometry MRD o MRD-come approcci. La disponibilità di test sensibili che permettono l'individuazione delle cellule di leucemia residua (staminali) in base alle caratteristiche specifiche di malattia o malattia-collegati (marcatori molecolari anormali o aberrante immunophenotypes) hanno drasticamente migliorato MRD valutazione in AML. Tuttavia, data l'intrinseca eterogeneità e complessità di AML come una malattia, metodi per il campionamento del midollo osseo e l'analisi MRD e LSC devono essere armonizzate quando possibile. In questo manoscritto che descriviamo una metodologia dettagliata per adeguata midollo osseo aspirato di campionamento, trasporto, esempi di elaborazione per la valutazione di citometria a flusso multi-colore ottimale e gating strategie per valutare MRD e LSC per aiutare nel processo decisionale terapeutico per i pazienti AML.

Introduction

Leucemia mieloide acuta (AML) è che un tumore maligno del midollo osseo caratterizzata da difetti nel programma di maturazione, con anomala proliferazione e accumulo di cellule progenitrici mieloidi, inibizione di ematopoiesi normale e in definitiva insufficienza del midollo osseo . La malattia è altamente eterogenea per quanto riguarda la morfologia, immunofenotipo, citogenetica, molecolare aberrazioni e firme di espressione genica, nonché alla risposta al trattamento e trattamento risultato^1,2. Gestione attuale comprende la chemioterapia di induzione con l'obiettivo di raggiungere la remissione completa (CR), seguita da post-remissione trattamento, che è in gran parte guidato dai risultati di molecolare, citogenetica e immunophenotypic studi e consiste di uno diversi corsi di chemioterapia complementare o di trapianto di cellule staminali (autologo o allogenico)³. Nonostante i tassi di remissione alta dopo la chemioterapia intensa fino al 90%, sopravvivenza a 5 anni negli adulti è solo circa 30% - 40%, principalmente dovuto lo sviluppo di recidive che sono comunemente resistenti alla chemioterapia e quindi molto difficili da trattare. Risultato in bambini è meglio, anche se circa un terzo anche la ricaduta. Pertanto, l'individuazione tempestiva della ricaduta imminente riempirà un'esigenza medica insoddisfatta e può guidare la terapia post-remissione⁴.

Malattia residua dopo terapia può riflettere la somma di tutte le diagnosi e meccanismi/fattori di resistenza post-diagnosi; quindi la sua misurazione può essere prognostici e strumentale per guidare il trattamento. La possibilità della malattia residua di definire (precedentemente chiamata malattia minima residua e ora indicata come misurabile malattia residua o MRD) lontano sotto il criterio morfologico delle cellule di scoppio 5% sta cambiando il panorama del rischio classificazione. Attualmente i due metodi utilizzati principalmente per rilevare MRD sono flusso cytometry-molecolari basati e, quest'ultima viene valutata da d'inversione di transcriptase PCR (RT-qPCR)⁵ o, anche se in una fase precoce, di prossima generazione sequenziamento (NGS). Molti studi negli adulti e nei bambini già dimostrato che vari approcci MRD forniscano informazioni prognostiche forte in AML sia dopo induzione e consolidamento terapia^6,7e una nuova definizione di malattia onere ( superiore a CR morfologica) emerge ora⁸. Ciò suggerisce MRD valutata dal flusso e/o tecniche molecolari dovrebbero diventare e in realtà stanno già diventando, standard in ogni studio clinico in AML.

Questo manoscritto viene descritto la procedura di cytometry di flusso dettagliato per ottenere una caratterizzazione di immunophenotypic accurati e riproducibili di MRD nei campioni di midollo osseo, tra cui il campionamento del midollo osseo e l'elaborazione di procedure che precedono la citometria a flusso. La disponibilità di campioni di midollo osseo di buona qualità alla diagnosi ed al follow-up è fondamentale per il successo di questa misura in siti clinici e studi clinici. In realtà, queste considerazioni pre-analitiche sono anche degli approcci MRD di vitale importanza per molecolare (PCR e NGS). Per la caratterizzazione di immunophenotypic di MRD, aberrante espressi marcatori sono combinati con normale mieloide e marcatori di cellule progenitrici, per identificare un immunophenotype leucemia-collegato (LAIP)⁹. MRD misura la risultante di molti fattori che influenzano la risposta alla terapia, quali leucemia intrinseca o acquisita farmacoresistenza, farmacodinamica e cinetica di terapia, sorveglianza immune e di conformità. Di conseguenza, MRD è un parametro di prognostico post-diagnosi molto forte connesso con risultato clinico quando Dicotomizzate su un livello di cut-off determinato mediante analisi di caratteristica operativa ricevente (ROC). Per nostra coorte AML adulto di HOVON 42a studio, il livello di cut-off è fissato a 0,1% di cellule bianche del sangue LAIP positivo cellule/totale. Utilizzando questo criterio per determinare lo status negativo vs positivo MRD, un gruppo di pazienti possa essere identificato che hanno un'incidenza di recidive significativamente peggiore, la sopravvivenza ricaduta-libera e generale⁶. Inoltre, descriviamo la misura delle cellule di leucemia immaturi, resistente alla droga con le caratteristiche delle cellule staminali (cellule staminali CD34 + CD38-leucemia o LSC), che offre un forte predittore di outcome del paziente¹⁰. Insieme LAIP e LSC si avvicina forma l'approccio MRD cytometric di flusso. L'approccio LAIP è adatto per circa il 90% dei pazienti, mentre l'approccio LSC può essere applicato in circa l'80% dei pazienti. Insieme sopra 95% dei pazienti possono essere valutati per un parametro o entrambi.

Infine, questa pubblicazione fornisce una descrizione dettagliata di operativa per valutare MRD tramite flusso cytometry. Questo include: 1) armonizzazione e/o standardizzazione delle procedure di prelievo di midollo osseo, guida trasporto 2) esempio 3) Descrizione dettagliata del rilevamento delle cellule leucemiche con FACS usando diversi pannelli di anticorpo, inclusi gli approcci di tubo singola cella a caratterizzare la LSC, 4) set-up della FACS macchine per misure standardizzate, 5) programmi analitici per misurazioni MRD e 6) programmi di analisi per il rilevamento di LSC.

Miriamo a mostrare tutte le sfaccettature della procedura tra cui la preparazione del campione, dal momento che è raramente discusso mentre è una questione importante per la qualità del risultato finale. Biopsia e aspirazione del midollo osseo sono procedure cliniche utilizzate per valutare le cellule ematopoietiche all'interno del midollo osseo. Questi vengono eseguiti insieme ad un esame emocromocitometrico completo (CBC) e sbavatura di anima. Il metodo ottimale per l'aspirazione del midollo osseo è fondamentale per la diagnosi esatta e follow-up per la misura di MRD. Inoltre, un successo il midollo osseo aspirato dovrebbe contenere abbastanza cellule per eseguire l'analisi del flusso LAIP e LSC (cellule vitali almeno 10 milioni). Qui, descriviamo il metodo per eseguire un'aspirazione del midollo osseo e fornire linee guida, che dovrebbero provocare adeguata cella campionamento (e limite il potenziale per emodiluizione) necessari per la diagnostica accurata e ulteriori ricerche. Queste considerazioni pre-analitiche sono anche degli approcci MRD di vitale importanza per molecolare (PCR e NGS). Tutti gli esemplari per immunophenotyping dovrebbero essere trattati preferenzialmente entro 24 h dalla raccolta. Anche se non raccomandabile, midollo osseo e campioni di sangue periferici ancora possono elaborati e analizzati fino a 72 h, conservato a temperatura ambiente. Inoltre, tutte le manipolazioni con il materiale devono essere eseguite in condizioni di sterilità, al fine di consentire la crioconservazione di cellule sterili per la successiva valutazione di ricerca/qualità ecc.

Protocol

Il protocollo segue le linee guida del codice ricerca e il comitato etico di ricerca della VU University Medical Center.

1. midollo osseo aspirazione e preparazione di campioni

1. Preparazione paziente e materiale
   1. Riempire uno o due siringhe da 10 mL con lidocaina 1% utilizzando un ago di calibro 16. Sostituire l'ago per un ago da 21 gauge.
   2. Mettere due gocce di EDTA 5% su un vetro da orologio.
   3. Impostare la pagina di vetrini (n = 15 con numerazione coerente del paziente e la data) per le preparazioni di striscio.
   4. Posizionare il paziente in decubito laterale. Individuare la spina iliaca posteriore superiore e segnare con la penna.
      Nota: In generale, la spina iliaca superiore posteriore è situata una mano larghezza distale alla cresta iliaca e una mano larghezza laterale alla linea mediana. Nelle femmine, la colonna vertebrale effettiva può essere un po' più laterale, in alcuni uomini un po' più mediale.
   5. Disinfettare la cute con clorexidina 0,5-1% in etanolo da verso l'esterno l'area di biopsia previsto nei circoli.
   6. Aprire la confezione di guanti sterili, mettere i guanti sterili e fissare il pacchetto sul tavolo per creare un campo sterile. Aprire il pacchetto con l'ago di aspirazione e posizionarlo sul campo sterile.
   7. Infiltrarsi in pelle e tessuto sottocutaneo e infine periostio. Presso il periostio, amministrare la lidocaina in modo tale che un'area di 1 cm di diametro è stata anestetizzata.
      Nota: Un'adeguata somministrazione di lidocaina al periostio è uno dei fattori più importanti per il comfort del paziente. Verificare se il periostio è stato adeguatamente anestetizzato toccando la posizione prevista biopsia con l'ago introdotto e chiedere se il paziente si sente alcun dolore. Nota: i bambini sono completamente anestetizzati durante l'intera procedura.
   8. Tenere l'ago aspirato (15 Ga x 2.8") con l'estremità prossimale nel palmo e dito indice contro il lato del pozzo del metallo dell'ago vicino alla punta; Questa posizione consente un migliore controllo.
   9. Introdurre l'ago con un movimento rotatorio (alternando rapidamente movimento di pronazione/supinating) attraverso la pelle verso la spina dorsale iliaca e portare l'ago a contatto con la spina iliaca posteriore.
   10. Assicurarsi che è dell'ago è stato introdotto alla zona anestetizzata del periostio; il paziente deve sentirsi solo pressione e nessun dolore. Se il paziente si sente dolore, riposizionare l'ago, o amministrare più lidocaina.
   11. Esercitando una pressione leggera ma ferma, far avanzare l'ago ruotandolo in un'alternanza in senso orario-antiorario. Ingresso nella cavità del midollo viene generalmente rilevato da resistenza in diminuzione.
   12. Rimuovere il mandrino dall'ago. Collegare una siringa vuota 10 mL all'ago.
   13. Applicare una pressione negativa ritirando lo stantuffo della siringa con una trazione delicata. Avvertire il paziente che può sentire una sensazione di crampi e dolore quando il midollo è essere stato aspirato. Se non abbastanza spicules del midollo osseo vengono rilasciati, un'altra aspirazione deve essere eseguita con un rapido pareggio. La maggior parte delle spicole sarà i primi 1-2 mL ottenuti dal menu iniziale. Aspirare solo 1-2 mL per evitare di diluire il campione.
       Nota: Diluizione si tradurrà in emodiluizione e possono confondere i risultati MRD).
   14. Rimuovere la siringa e rimettere il mandrino dell'ago di aspirazione. Espellere parte del midollo in un vetro da orologio e il resto in un tubo di 8 mL rivestita con eparina.
       Nota: Capovolgere ogni provetta immediatamente dopo aver piazzato il midollo aspirato nella provetta del campione per garantire un'adeguata anticoagulazione. Coagulazione del midollo osseo è spesso la causa di materiale inappropriato. Ulteriori del midollo osseo può essere aspirato dal punto stesso, ma preferibilmente, l'ago è avanzato 5-10 mm prima che sia adottato un nuovo aspirato. Dovrebbero essere assunto preferibilmente non più di 2 pareggi per livello di inserimento. Assicurarsi di contrassegnare i tubi con l'aumento di numeri che rappresentano il primo, secondo e/o consecutivi pareggi. È regola comune utilizzare il primo sorteggio per l'analisi diagnostica più rilevante.
   15. In alternativa, ritirare l'ago dal luogo inserimento e reintrodurla nella cavità del midollo pochi millimetri di distanza dal luogo di inserimento originale e ripetere la procedura.
       Nota: Non aspirare più di 1-2 mL per tirare, per evitare la contaminazione del sangue significativa.
   16. Ripetere come spesso come materiale è necessario. Quando viene aspirato materiale sufficiente per il protocollo di studio clinico specifico rimuovere l'ago del midollo osseo.
       Nota: In caso di aspirazioni del midollo osseo lento o altrimenti difficile l'uso di siringhe che erano pre-arrossata con anticoagulante può essere utile. In caso di un colpetto secco, eseguire una biopsia del trephine che esula dall'ambito di questo manoscritto.
2. Allestimento dei preparati per l'esame morfologico
   1. Per la valutazione morfologica ottimale, scegli spicole (ad esempio utilizzando una spatola di plastica) da aspirato nel vetro d'orologio e metterli su un vetrino.
   2. Posizionare delicatamente un'altra lastra di vetro sopra il vetrino con il midollo e far scorrere delicatamente; evitare qualsiasi pressione.
      Nota: Solo in caso di midollo osseo molto grande spicules leggera pressione può essere esercitata, per diminuire lo spessore della diffusione delle cellule. I vantaggi di procedura dall'aiuto di un assistente che può gestire le provette dei campioni. Un'etichettatura precisa dei tubi con il numero del paziente e il numero dell'estrazione sequenziale del midollo osseo è fondamentale.
   3. Asciugare accuratamente la diapositiva e quindi eseguire può Giemsa Grünwald colorazione (Vedi tabella dei materiali). Esaminare al microscopio luce per morfologia (Vedi Figura 1).
      Nota: La Figura 1A Mostra le sbavature del midollo osseo sano costituito da tipi differenti delle cellule funzionali mentre Figura 1B un paziente AML con blasti leucemici principalmente. Per meglio definire l'onere leucemica residua, immunophenotyping deve essere eseguita.

2. il trasporto di materiale per l'ulteriore elaborazione

1. Preparazione dei campioni per il trasporto
   1. Al fine di assicurarsi che il materiale non colerà e i tubi non si rompono, garantire il corretto imballaggio (Vedi Figura 2).
      Nota: Dal nostro e altre esperienze la vitalità delle cellule è meglio conservati quando il midollo osseo è mantenuto a temperatura ambiente. Per il trasporto a lungo termine questo si ottiene tramite una temperatura ambiente 'gel-pack' per aiutare nella stabilità di temperatura durante il trasporto.
   2. Etichetta pacchetti e aggiungere le forme corrette per evitare la perdita del pacchetto, trasporto prolungato o il passaggio dei pazienti.
      Nota: Questo dovrebbe contenere almeno: i dati del paziente (modulo 1). Ciò dovrebbe includere il numero di studio e comunemente la 'data di nascita'. Essenziale per il giusto trattamento del materiale dopo l'arrivo al laboratorio ricevente, è una chiara dichiarazione specificamente richiesto delle analisi di laboratorio (diagnostica molecolare, immunofenotipizzazione, MRD ecc) su questo modulo. (Modulo 2) Indirizzo e numero di telefono della persona da contattare, e quando necessario, documenti per la dogana. Per evitare la perdita di pacchetti nella mail, il laboratorio di invio notifica sempre il laboratorio ricevente che è stato inviato un campione. Si consiglia di "track and trace".
2. Ricevere campioni da altri istituti
   1. Assicurarsi che la logistica adatta è in atto presso l'Istituto per ricevere il campione al laboratorio, non appena viene consegnato presso l'Istituto.
      Nota: Per organizzazione logistica ottimale preferibilmente un laboratorio centrale è richiesto, che riceve e raccoglie tutto il materiale dalla clinica locale e da ospedali esterni. In particolare, l'assegnazione di protocolli per la distribuzione e una comunicazione chiara con i laboratori esecutivi è essenziale.
   2. Dopo aver ricevuto i campioni, accuratamente nota la numerazione appropriata in forme di copia cartacea e un database protetto che contiene campi importanti come numero ID MRD, numero ID specifici di prova, numero di registrazione di ospedale, Istituto di invio, data di nascita, materiale tipo (midollo osseo o sangue periferico), conteggio di globuli bianchi (WBC), data di aspirazione del midollo osseo, data della misurazione del campione ed eventuali osservazioni utili per la qualità della misura.
      Nota: Preferibilmente, questo database è anche attrezzato per contenere dati aggiuntivi (o essere collegato ad altri database) dei risultati di analisi e ulteriormente i dati del paziente ad esempio dati di follow-up.

3. flusso Cytometer Setup

Nota: Questa sezione si basa su istruzioni di Euroflow. ¹¹

1. Messa a punto di fotomoltiplicatore (PMT) tensioni per FCS SSC parametri e canali di fluorescenza di destinazione
   1. Parametri per FCS SSC avviare il citometro a flusso ed eseguire il "citometro installazione e monitoraggio (CST)" eseguire il citofluorimetro con perline CST (Vedi tabella dei materiali). Lisare cellule di anima rosse da un donatore sano (descritto nella sezione 4.1).
      1. Creare un nuovo esperimento (nel menu: esperimento, sperimentare nuovi, selezionare vuoto esperimento) utilizzando il software del produttore (Vedi tabella materiali) con un Forward scatter (FSC) contro lateralmente (SSC) puntino a dispersione per impostare i parametri FSC e SSC. Nome questo esperimento FSC/SCC PMT con la data. In primo luogo utilizzare le impostazioni correnti del citometro (tasto destro del mouse: "applicare corrente CST"). Queste impostazioni sono state generate con il controllo delle prestazioni CST usando i branelli di CST-calibrazione (Vedi tabella dei materiali). Regolare FSC e SSC per visualizzare i linfociti in "impostazioni global experiment". Nota: nel nostro citometro a flusso questi sono 285 V e 400 V rispettivamente. Spuntare la "compensazione attiva" in: ispettore/strumento Impostazioni/compensazione.
      2. Per valutare la dimensione delle cellule (FSC) e granularità (SSC) inizio misurazione senza etichetta lisate globuli periferici dalla funzione "acquisire le cellule". Cancello i linfociti e regolare/fine-sintonizzazione FSC e SSC tensioni per raggiungere i seguenti valori di destinazione di media per la popolazione dei linfociti gated: FSC: 100.000 (gamma 95.000-105.000); SSC: 15.000 (gamma 13.000-17.000).
      3. Acquisire e registrare i dati di misurazione almeno 10.000 eventi. Verificare la media FSC e SSC valori obiettivo per linfociti gated e regolare nuovamente se necessario.
   2. Per impostare la fluorescenza di destinazione canali tensioni PMT utilizzano particelle di calibrazione perline 8-picco arcobaleno (Vedi tabella dei materiali).
      1. Creare un nuovo esperimento sul FACS per picchi di 7. Creare un foglio di lavoro "Target media intensità di fluorescenza (MFI)" con tutte le necessarie dot trame (n = 2; FSC vs SSC, FITC versus PE), istogrammi (n = 8; un istogramma per ogni rivelatore a fluorescenza) e statistiche che indicano il riferimento i valori di picco (MFI e coefficiente di variazione (CV)) per ogni canale di fluorescenza.
      2. Appena preparare una soluzione contenente 1 goccia (± 60 µ l) di perle dell'arcobaleno in 1 mL di vortice di dH O. delicatamente₂per mescolare le perle nella soluzione.
      3. Utilizzare le impostazioni di PMT del tensioni FSC/SSC da sopra e iniziare a misurare la fluorescenza delle perle arcobaleno utilizzando la funzione "acquisire" (senza registrazione) a "Bassa" portata con una soglia di 5.000. Utilizzare il tasto"cancello rettangolare" al cancello la popolazione di perline di singoletto P1 in FSC contro dot plot SSC. Cancello il 7^th PEAK - popolazione P2 in FITC contro trama dot PE.
      4. Continuare l'acquisizione delle 7 vette Rainbow perlina sospensione e regolare/fine-sintonizzazione PMT tensioni in tutti i canali di fluorescenza a raggiungere valori di MFI di destinazione secondo i canali di destinazione MFI annotati come previsto con le perline.
      5. Utilizzare "Record" per raccogliere i dati di circa 10.000 eventi e controllare l'IFM per la 7^th perle di picco. Se necessario, correggere le tensioni PMT. Una volta raggiunto il valore di destinazione MFI per il picco di^th 7, record/sovrascrivere il file per i valori finali di PMT.
      6. Salvare i valori finali di PMT e denominare il file PMT Setup con la data, che sarà salvare nel catalogo di software del produttore. Utilizzare questa impostazione PMT per correggere la fuoriuscita sopra ogni tintura di fluorescenza.
2. Impostazioni di compensazione di fluorescenza
   1. Etichettare una provetta per il controllo non macchia e ogni anticorpo coniugato fluorocromo (Vedi tabella S1 per i fluorocromi usati). Pipettare 100 µ l di tampone in ogni provetta.
   2. Vortice il flaconcino di perline multicolor compensazione (Vedi tabella materiali) accuratamente e quindi aggiungere 1 goccia completo (± 60 µ l) di queste perle in ogni provetta.
      Nota: Evitare gocciolamento le perline lungo il lato del tubo durante l'aggiunta di loro in ogni provetta. Questo può portare a perlina bassa concentrazione e potrebbe urtare i risultati della matrice compensazione.
   3. Pipetta calcolato il volume appropriato per una prova di sufficiente fluorocromo-coniugate dell'anticorpo (che sarebbe sufficiente a macchiare 10⁶ cellule) nel tubo corrispondente e vortice accuratamente. Non aggiungere dell'anticorpo per il tubo di controllo non colorati. Incubare per 15-30 minuti al buio a temperatura ambiente (TA).
   4. Aggiungere 4 mL di tampone di lavaggio (soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)/0.05% azide-0.1%, albumina sierica umana (HSA) (Vedi tabella materiali)) in ogni provetta. Centrifugare le provette a 300g per 10 min. eliminare il surnatante e risospendere il pellet perlina aggiungendo 0,2 mL di tampone di lavaggio in ogni provetta. Vortex le provette accuratamente.
   5. Aprire il software di analisi del produttore (Vedi tabella dei materiali) e creare un nuovo esperimento (nel menu: esperimento, sperimentare nuovi, selezionare vuoto esperimento) e rinominare come file di compensazione con la data corrente.
   6. Vai a "impostazioni citometro" e utilizzare l'impostazione di PMT dalla sezione 3.1. Essere sicuri che la soglia in FSC è 5.000 e i valori di compensazione di tutti i fluorocromi usati sono pari a zero.
   7. Creare controlli di compensazione, compresi i tubi etichetta specifici, come necessario. Assicurarsi di includere un controllo non colorato. Selezionare dal menu: esperimento, installazione di compensazione, creare i controlli di compensazione.
   8. Caricare la provetta di controllo non macchiate e regolare il cancello P1 intorno alla popolazione del branello di singoletto e garantire che il cancello di P1 contiene solo perle di singoletto.
   9. Il cancello di P1 di destro e selezionare "Applica a tutti i controlli di compensazione". Registrare i dati per tutti i tubi a fluorescenza con etichetta singola. Verificare che la P2 cancello comprende la popolazione positiva su ogni istogramma di fluorescenza. Se necessario regolare il cancello.
   10. Calcolare la compensazione. Seleziona esperimento, installazione di compensazione, calcolare la compensazione.
   11. Se il calcolo della compensazione non è riuscito, viene visualizzato un messaggio di errore. Apportare le modifiche necessarie e ricalcolare. Quando il calcolo della compensazione ha esito positivo, una finestra di dialogo viene visualizzata prompt per il nome per l'impostazione di compensazione.
   12. Immettere un nome (ad esempio installazione di colore di 8 AA-MM-GG) e fare clic su, collegare e salvare. L'impostazione di compensazione verrà salvato anche nel catalogo di programma di installazione di compensazione.
       Nota: Le stesse impostazioni possono essere utilizzate per tutti gli esperimenti usando la stessa fluorofori.

4. flusso Cytometry valutazione (LAIP e LSC)

Nota: Qui descriviamo la procedura di lisi di massa prima della colorazione, che consente a macchiare una concentrazione preferita di WBC. Maggior parte dei protocolli MRD utilizza questo approccio, anche se alcuni hanno utilizzato con successo altre opzioni come la colorazione prima di lisi. Intero midollo osseo colorazione prima di lisi minimizza preferenziale delle cellule perdita¹², ma ha lo svantaggio di concentrazioni cella imprevedibile, troppo bassa.

1. Massa di lisi delle cellule
   Nota: Mantenere i campioni unmanipulated orizzontale a RT, acquisizione di cytrometric di flusso non può essere eseguita lo stesso giorno al fine di avviare tutta la procedura il giorno successivo.
   1. Risospendere il campione di midollo osseo anticoagulated ad omogeneità capovolgendo il campione più volte. Determinare la concentrazione di cellule del midollo osseo (numero di globuli bianchi (WBC)) utilizzando una cella camera di conteggio con HankyPanky soluzione di colorazione cellulare (Vedi tabella dei materiali).
   2. Dispensare il volume necessario del midollo osseo in una provetta separata 15 mL. La quantità di cellule è dipenda dal numero di tubi separati di colorazione; per una colorazione (un tubo) utilizzare circa 2 x 10⁶ cellule bianche del sangue per la misurazioni di LAIP e 8 x 10⁶ cellule bianche del sangue per la misura del tubo LSC.
   3. Lisare cellule rosse del sangue con l'aggiunta di soluzione lisante (Vedi tabella dei materiali). Volume richiesto di soluzione lisante dovrebbe essere 10 volte il volume della sospensione cellulare.
   4. Mescolare delicatamente, capovolgendo e incubare per 10 minuti a TA. Centrifugare per 7 min 800g a RT. scartare il supernatante (ad es. con una pompa a vuoto o pipetta Pasteur). Risospendere il pellet cellulare in tampone fosfato salino (PBS)/0.05% azide-0.1%, albumina sierica umana (HSA) (Vedi tabella materiali) a RT. uso il volume massimo del tubo.
   5. Centrifugare per 7 min 800g a RT. scartare il surnatante (ad es. con una pompa a vuoto o pipetta Pasteur). Risospendere il pellet cellulare in PBS/0.05% azide-0.1% HSA per una concentrazione di cellule di 100 x 10⁶ WBC/mL e dividere per il numero di provette previsti.
2. Macchiatura delle cellule per citometria a flusso
   1. Soluzione cocktail di anticorpi monoclonali (MoAb) dispensare mescolare nei tubi del selezionatore (FACS) cella appropriata di fluorescenza-attivato e incubare con le cellule del midollo osseo lisate per 15 min al buio.
      Nota: Questo è molto importante quando tandem-coloranti vengono utilizzati. Ad esempio, vedere le miscele dei pannelli standard utilizzati nel nostro laboratorio (tabella S1).
   2. Lavare le cellule con 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% ha. Centrifugare le cellule per 5 min a 400g. Scartare il supernatante (ad es. con una pompa a vuoto o pipetta Pasteur) e risospendere il pellet cellulare a 300 µ l PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
   3. Per la misura di LSC: risospendere il pellet cellulare in 400 µ l PBS/0.05% azide-0.1% HSA e 4 µ l di perline in bianco (per esempio Spherotech, vedere tabella materiali) da utilizzare come popolazione di controllo negativo nell'analisi.
   4. Aprire il MRD o LSC esperimento lay-out sulla FACS (Vedi tabella dei materiali) e misura per MRD almeno 100.000 WBC gated eventi per la misura di campioni di pazienti AML alle diagnosi e 1 X 10⁶ WBC per campioni AML al follow-up. Per la LSC esperimenti misurano almeno 4 x 10⁶ WBC sia alla diagnosi ed al follow-up per un risultato affidabile di LSC.
   5. Salvare i dati utilizzando un nome di file appropriato standardizzati per l'analisi dei risultati. Fare un inventario dei diversi marcatori misurati sulle cellule AML e sulle cellule staminali AML (positivi, negativi, più di/meno di espressione) e memorizzare questi dati nella Gazzetta lab.
   6. Nel caso in cui non c'è nessuna diagnosi LAIP disponibile, misurare tutti i 4 tubi al follow-up per garantire che qualsiasi possibile LAIP misurabile può essere identificato in un approccio diverso dal normale.
   7. Scegli il più affidabile LAIP(s)¹³ stabilito al momento della diagnosi e acquisire eventi come molti come possibile, ma > numeri minimi definiti.

5. identificazione di leucemia associata Immuno-fenotipi (LAIP): analisi di diverse popolazioni cellulari

Nota: I file FCS possono essere analizzati con diversi programma software per la visualizzazione ottimale delle popolazioni differenti delle cellule (Vedi tabella dei materiali).

1. Popolazione di globuli bianchi
   1. Cancello le cellule positive di CD45 e le cellule vitali comparenti, lasciando fuori basso FSC (cellule non vitali, cellule eritroidi) all'interno del plot FSC/SSC; Questi contengono il WBC (Figura 3Aho). Visualizza il WBC e utilizzare uno dei marcatori primitivi (ad esempio CD34; Figura 3Aii) per contribuire ad per accertare la posizione finale degli scoppi nella zona de CD45dim (Figura 3Aiii).
   2. Le cellule CD45dim del cancello e cancello indietro le cellule nella trama FSC/SSC (Figura 3Bio). Rimuovere il cancello di CD34 (Figura 3Bii) mentre la % di cellule in questo cancello come % di blasti nel tuo albero di popolazione nel programma di segnalazione. Visualizza gli scoppi in un SSC/CD34 trama e cancello le cellule positive CD34 (figura3Biii).
2. Linfociti
   1. Utilizzare linfociti come controllo interno: mieloide popolazioni come popolazioni linfoidi come controllo positivo e un controllo negativo.
   2. A partire dalla popolazione di globuli bianchi (Figura 4A). Linfociti del cancello come la CD45^altapopolazione^bassa del /SSC (Figura 4B).
   3. Assicurarsi che non vi siano nessun cellule mieloidi nel cancello utilizzando CD34, CD117, CD13 o CD33 e cancello per il CD13 negativo/CD33 cellule negative (Figura 4C-E). Chiamare questa popolazione 'linfociti' nella struttura della popolazione (Figura 4F).
3. LAIP alla diagnosi
   1. Gli scoppi del cancello e successivamente le cellule positive CD34 in un SSC/CD34 trama e chiamano questi "primitivi"marcatore nella struttura della popolazione.
   2. Tracciare le cellule primitive, in questo caso CD34 positivi e i linfociti in una nuova trama con un pennarello linfoide (CD7) contro un marcatore mieloide (CD33). La popolazione aberrante (vedere per le linee guida supplementari File 1) del cancello e li chiamano 'LAIP positivo' nella struttura della popolazione.
      Nota: Il finale scelto LAIP viene segnalato come % LAIP sulla popolazione di esplosione. La sensibilità, la specificità e la stabilità del LAIPs può essere stabilite solo da personale con ampia esperienza nelle misurazioni di MRD. Il totale di questi parametri determina la qualità della LAIP. Esempi di quattro diverse valutazioni LAIP alla diagnosi sono riportati nella Figura 5 A-D.
   3. Determinare l'espressione di LAIPs (% di blasti) e conservare questi dati in un database o file di excel.
   4. Rendere i report delle analisi FACS e le note di LAIPs che devono essere utilizzati alle misurazioni MRD.
      Nota: La definizione di LAIPs è autorizzata in un team di esperti, dal momento che è una caratteristica essenziale per misure accurate di MRD al follow-.
4. MRD al follow-up
   1. Gli scoppi del cancello come descritto in 5.1, ma a seconda del punto di tempo dopo la terapia; valutazione corretta di questa porta può essere impegnativo. Concentrarsi sul fenotipo LAIP che è stato stabilito al momento della diagnosi e della popolazione immatura del cancello.
   2. Come descritto in 5.1. trovare la porta corretta blast basato sul aberrancy definiti ed essere consapevoli della rigenerazione del midollo osseo e le espressioni normali per loro fuori del cancello
   3. Ripetere lo stesso gating strategia punti affatto follow-up e determinare MRD come la percentuale di cellule LAIP nella popolazione intera globuli bianchi. Vedere per esempio Figura 6A e 6B.
   4. Rapporto di positività MRD quando la % di MRD è ≥ 0,1% di cellule bianche del sangue. Stampare dati analizzati in un formato standard per discutere ogni settimana con il team MRD. Registrare i risultati dopo consenso è raggiunto. Lasciare i risultati essere autorizzati dall'autorità di vigilanza prima di comunicare i risultati ai clinici.

6. analisi di Stem cell MRD (LSC singolo tubo)¹⁴

1. Analisi di LSC alla diagnosi ed al follow-up
   1. Le cellule di scoppio del cancello come descritto nel paragrafo 5.1.
   2. Come controllo negativo potenziale per CD38-, cancello rosso cellule-frazione (cioè restanti globuli rossi dopo lisi, caratterizzato come SSC^basso/FSC^basso e CD45^negativi). Se necessario, le cellule morte e frammenti di cellule possono essere esclusi da una porta supplementare in questa trama.
   3. Determinare entro il cancello leucemica blastica la sottopopolazione con espressione di CD34. Selezionare all'interno di questa popolazione il CD34⁺ CD38 cellule^– (utilizzare come Cut-off: bordo superiore delle perline vuoto taratura per la determinazione della soglia (Vedi tabella dei materiali), il rosso-frazione o uso 10³ come punto di cut-off). Chiamare questa popolazione 'CD38^basso progenitori' (Figura 7).
      Nota: Vedere complementare File 1 per ulteriori dettagli sull'impostazione dei livelli di CD38-cut-off.
   4. Determinare all'interno di questa popolazione^bassa CD38 vero CD34 + CD38 popolazione^{molto bassa} delle cellule staminali, utilizzando la mediana della frazione rossa, il bordo inferiore dei branelli calibrazione vuoto o scegliere 10² come punto di cut-off (Figura 7 ). Per ulteriori dettagli su come impostare i livelli di CD38-cut-off, vedere complementare File 1.
   5. All'interno di entrambe le popolazioni, cancello le cellule staminali leucemiche vs le normali cellule staminali ematopoietiche (LSC vs HSC) analizzando ogni marcatore leucemiche fornito nel pannello (cioè CD45RA, combi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 e CD56 tutto in PE), CD123, CD33 e CD44).
   6. Tracciare il marcatore di cellule staminali di interesse contro altro marcatore di cellule staminali per confrontare la positività/negatività con positività/negatività di altri marcatori e perfezionare LSC vs frequenza HSC.
   7. Segnala la percentuale di blasti immaturi, linfociti, cellule CD34 +. Per gli indicatori tutti separati, elencare i numeri totali di CD38^basso e CD38^verylow e i numeri di CD38^basso e CD38^verylow che sono indicatore positivo (e così neoplastiche).
   8. Selezionare per il marcatore che contraddistingue meglio le cellule staminali emopoietiche normali vs cellule staminali leucemiche per ulteriore analisi. Calcolare la percentuale di LSC e HSC come percentuale del totale WBC.
      Nota: Una percentuale di LSC ≥ 0,004% è segnalata come LSC positivo al momento della diagnosi, mentre il cut-off è 0,0001% al follow-up. Cellule staminali aberranti gating nei campioni di follow-up è simile all'analisi come al momento della diagnosi, tuttavia, i numeri di cellulare in popolazioni di cellule staminali possono essere molto piccoli. Da qui la necessità di acquisire abbastanza eventi.

Results

Nel 90% dei pazienti LMA può essere identificato almeno un LAIP. Al fine di generare le percentuali precise di cellule LAIP + il primitive delle cellule di scoppio al momento della diagnosi, l'impostazione appropriata del cancello blast è cruciale ed esigenze di verifica come visualizzato nella Figura 3. Un esempio di ogni paziente che harboring un tipo specifico di aberranza sulle cellule CD34 + primitive viene visualizzato in Figura 5. Per la misurazione di MRD di follow-up, la precedenza definito LAIP + cellule sono gated e definite come percentuale di cellule LAIP + del WBC. Quindi l'impostazione di questo cancello è fondamentale per ottenere i giusti risultati MRD. Figura 6 Mostra un paziente che rimane nella remissione completa e un paziente che ricadute dopo avere risultati positivi MRD (≥ 0,1%) dopo il secondo ciclo di terapia di induzione.

Il protocollo attuale è solo adatto per definire le cellule staminali in cellule CD34 +, poiché approfondita caratterizzazione di questo comparto ha mostrato che il CD38-popolazione porti il più potente della cellula formativa come frazione. Al fine di separare la LSC da HSC all'interno di questa frazione, ulteriori marcatori vengono utilizzati. Marcatori più spesso selezionati per distinguere LSC sono CD45RA e il canale di combi che harboring 6 marcatori specifici di LSC etichettati con PE. Basato su ulteriori valutazioni cliniche, un livello di cut-off di ≥ 0,004% è stato definito come LSC-positivo ed è stato associato con una sopravvivenza peggiore alla diagnosi mentre un livello di cut-off di 0,0001% è stato utilizzato follw-up¹⁰.

Figura 1 : Sbavatura del midollo osseo. A) sano donatore e paziente B) AML (sottotipo FAB 5). Colorazione di Giemsa mostrato ad ingrandimento 100x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Correggere il materiale di imballaggio per liquidi biologici. Maggiori dettagli sulle regole di trasporto di fluidi biologici si trovano presso il sito Web¹⁵ dei centri per controllo e la prevenzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Strategia per la definizione di blastomeri di gating. A) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + esplosioni.

Figura 4 : Gating linfociti. A) cellule blu sono WBC indicato nel plot FSC/SSC, cellule B) verde sono linfociti caratterizzati da CD45^alta/SSC^basso, C) esempi di negatività per CD34, D) negatività per CD117 ed E) negatività per CD13, F) i diversi tipi cellulari sono riportati un albero di popolazione di panoramica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : LAIPs al momento della diagnosi AML. A) LAIP basata su croce lignaggio aberrancy (CD7 sulle cellule esprimenti CD33), B) LAIP basato sulla differenziazione asincrona (CD11b sulle cellule esprimenti CD13), C) LAIP basato su sovraespressione rispetto alle cellule normali (CD34^{molto alta} su CD13 che esprimono le cellule), D). LAIP basato su sottoespressione rispetto alle cellule normali (HLA-DR^basso su CD33 che esprimono le cellule). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : LAIP seguita durante la terapia. Definizione di A) LAIP alla diagnosi (CD34 + CD13 + / CD33-) e perdita di LAIP durante il follow-up in un paziente che è rimasto in remissione completa continua, definizione di B) LAIP alla diagnosi (CD117 + CD7 + / CD33 +) e persistenza di LAIP durante il follow-up in un paziente che è ricaduto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Cellule staminali gating. A) Gating dei diversi CD34 + CD38 popolazioni basato su beads (CD38^basso è sotto il bordo superiore delle perline, mentre CD38 sono definiti come le vere cellule negative che rappresenta il LSC^{molto bassa} e si trovano sotto la mediana delle perle), B) due esempi di pazienti con distinzione tra HSC e LSC al follow-up basato su CD45RA^neg e CD45RA^pos espressione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Dati ampio sono disponibili che mostrano la prova per la positività MRD essendo associate con la sopravvivenza difficile, e quindi valutazione MRD può migliorare il risultato paziente fornendo informazioni prognostiche supplementari su cui si possono prendere decisioni cliniche. Quindi, un metodo coerenza e armonizzato per valutazione immuno-fenotipica della MRD è indispensabile migliorare in ultima analisi, la terapia del paziente. Questo è importante anche quando si confrontano gli studi clinici attraverso diversi siti clinici, e può in definitiva aiuto in clinica decisione fare e servire come un endpoint clinico surrogato per la sopravvivenza globale. La nozione che solidi orientamenti sono garantiti per le misure precise e coerenti di MRD ha portato a un'azione concertata della rete europea di leucemia (ELN) indicazioni di progettazione all'avanguardia. Questo documento completo sarà pubblicato tardo-2017 e sarà fondamentale per molti gruppi di studio e laboratori muovendo in avanti.

Fasi critiche all'interno del protocollo

Un aspetto importante e spesso trascurato dell'analisi MRD è l'impatto della qualità del campione sulla determinazione accurata di MRD. Questo è più evidente quando il materiale deve essere trasportata ad altri istituti in sperimentazioni cliniche, dati le considerazioni operative aggiuntive che devono essere prese in considerazione in questa impostazione. Per ridurre il rischio di confondere il paziente informazioni e consegna tempestiva dell'amministrazione adeguata campioni è cruciale. Ancora una volta, in questa fase del trasporto le forme corrette e/o importazione in sistemi elettronici ospedalieri con chiare assegnazioni dell'analisi richiesta è necessaria. Notando la stage presso terapia di campionamento MRD è anche cruciale poiché esso può essere rilevante per risoluzione clinica (ad esempio dopo il secondo corso della terapia) e pertanto dovrebbe essere chiaramente definito. L'uso di dati fittizi (come per esempio gennaio 1 all'anno di nascita) aumenta il rischio di confondere i pazienti o le analisi. Se richiesto dalla legge, un modo alternativo di anonimo di identificazione deve essere utilizzato.

Tutti gli esemplari per immunophenotyping dovrebbero essere trattati preferenzialmente entro 24 h dalla raccolta. Anche se non raccomandabile, midollo osseo e campioni di sangue periferici ancora possono elaborati e analizzati fino a 72 h, conservato a temperatura ambiente. Inoltre, tutte le manipolazioni con il materiale migliore possono essere eseguite in condizioni di sterilità, così ulteriore crioconservazione delle cellule in biobanche (locale) rimane rilevante: molti studi clinici hanno ulteriori analisi per analizzare ulteriormente le cellule di leucemia con rispetto alle caratteristiche molecolari, immuno-fenotipica e funzionale deve essere eseguita in una fase successiva. Tuttavia dettagli di biobanking non rientrano nell'ambito di questo manoscritto.

Utilizzando MRD come strumento diagnostico implica che ha bisogno di un laboratorio accreditato, non solo per citometria a flusso, ma anche per quanto riguarda il controllo di qualità di valutazione MRD. Ciò può richiedere la distribuzione di campioni ai laboratori di riferimento specifici o (ri) analisi dei file di flusso con le misurazioni di MRD da squadre di riferimento.

Questo articolo viene descritto le azioni più importanti da midollo osseo aspirato insieme alla determinazione di MRD in campioni clinici - che richiedono un intero team di esperti con specifici compiti, responsabilità e con una comunicazione frequente per una efficace caratterizzazione e analisi. Poiché ogni attività è determinante per la procedura, è consigliabile avere suono logistica tra cui protocolli ad ogni laboratorio e sufficiente personale di backup che sono stato addestrato in modo specifico per l'attività. Inoltre, poiché ci sono alcuni passaggi relativamente soggettive in parte delle procedure (soprattutto la identificazione dei marcatori aberranti LAIP e LSC), è essenziale avere discussioni circa il risultato finale da parte del team, e hanno la relazione finale autorizzata da un team di autorità di vigilanza. Gli sforzi attuali stanno perseguendo lo sviluppo del software di computer che vi aiuterà a standardizzare l'analisi MRD (LAIP e LSC).

Modificazione e risoluzione dei problemi

Ogni laboratorio può avere una propria serie di anticorpi che può essere utilizzato per definire le sottopopolazioni differenti pur avendo un backbone standardizzato dei marcatori è essenziale per ottenere risultati comparabili, come indicato nelle linee guida ELN d'avanguardia per documento misure MRD di cui sopra. Indipendentemente degli indicatori scelti ci sono alcuni problemi che possono rendere difficile l'analisi dei risultati e devono essere prese in considerazione.

Limiti della tecnica

L'identificazione di espressione aberrante marcatore LAIP e LSC è in primo luogo valutato alla diagnosi e monitorato nel tempo (durante e dopo la terapia) per accurata caratterizzazione del fenotipo MRD. Mentre oltre il 95% dei pazienti può essere valutato tramite LAIP o LSC (o entrambi), ancora alcuni pazienti hanno nessun LAIPs definito o no CD34 + CD38-LSCs presentano con CD34 negativi blasti o avere un campione di diagnosi mancante. In questi casi, vale ancora la pena di cercare di misurare MRD con un pannello di anticorpi più ampi in quanto il numero di celle disponibili permette e quindi seleziona il più affidabile (dando la distinzione più forte delle cellule leucemiche) LAIP. Considerando che una percentuale di pazienti che recidivano in definitiva non assomigliano completamente il immunophenotype di diagnosi, a causa dell'eterogeneità della malattia AML, un vasto pannello degli anticorpi alle MRD di misura è consigliabile comunque. Questi spostamenti di immunophenotypic includono le cellule di scoppio e LSCs e sono stati indicati per verificarsi durante terapia¹⁶ e la malattia misurabile può basarsi su queste popolazioni prossime cosiddette. In questo momento tuttavia, esso è non stato determinato se tutte le sottopopolazioni di immunophenotypic porterà alla ricaduta di malattia, ed è pertanto non comune pratica di segnalare MRD su misura-terapia basato su queste cellule negli studi clinici. È importante notare che il rischio di perdere LSC a causa di spostamenti di popolazione è ridotta tramite l'approccio di un tubo in cui i più importanti marcatori definizione aberrancy sono in un unico flusso cytometry (PE) canale¹⁴.

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti

Il metodo descritto in questo protocollo si basa sulla definizione di uno o più LAIPs, le celle che sono seguite durante la terapia. Uno svantaggio di questo metodo è che è stato recentemente dimostrato che LAIP possono cambiare durante la terapia. In questo modo alcune popolazioni prossime con differenti marcatori aberranti possono essere mancate. Per ovviare a questo, sarebbe meglio misurare tutti i marcatori aberranti anziché solo quelli che si trovano al momento della diagnosi. Quindi questo sarebbe simile all'approccio "diverso dal normale" che viene utilizzato da diversi laboratori¹⁷.

Applicazioni future

Recentemente, MRD ha ricevuto attenzione supplementare per sperimentazione clinica romanzo di progettazione. In epoca di opzioni di trattamento specializzato e terapia farmacologica mirata, l'uso di MRD come misura di esito ridurrà il tempo necessario per stabilire l'efficacia clinica di nuovi trattamenti, in ultima analisi, permettendo più veloce introduzione di urgente bisogno terapeutico opzioni in clinica. L'importanza della logistica appropriata ed esecuzione pratica di una valutazione di MRD armonizzata sono cruciali per il futuro successo di trattamento di AML come la FDA sta attualmente esaminando la possibilità di usando MRD come endpoint surrogato invece di sopravvivenza globale misura¹⁸.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	BD Biosciences	120995496,060996589 e 013729	FACS Canto II
	BD Biosciences	555360	CD7 FITC
	DAKO	F076701	CD2 FITC
	Sanquin	M1613	CD36 FITC
	BD Biosciences	332778	CD15 FITC
	BD Biosciences	335039	CD45RA FITC
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345785	CD14 PE
	Miltenyi Biotec	130-080-801	CD133 PE
	BD Biosciences	562566	Clec12a PE
	BD Biosciences	565568	Tim-3 PE
	BD Biosciences	332774	CD7 PE
	BD Biosciences	333142	CD11b PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	347222	CD34 PERCP-CY5.5
	BD Biosciences	558714	CD123 PERCP-CY5.5
	Beckman Coulter	B49221	CD117 PE-CY7
	BD Biosciences	562854	CD33 BV421
	BD Biosciences	345791	CD19 APC
	BD Biosciences	333143	CD11b APC
	BD Biosciences	345800	CD33 APC
	BD Biosciences	345807	CD38 APC
	BD Biosciences	641411	HLA-DR APC-H7
	BD Biosciences	560532	CD44 APC-H7
	BD Biosciences	562596	CD13 BV421
	BD Biosciences	348811	CD34 PE-CY7
	Beckman Coulter	A96416	CD45 Krome Orange
	BD Biosciences	655873	CD45 HV500c
	BD Biosciences	655051	perline CST
	BD Biosciences	555899	Soluzione
	BD Biosciences	644204	Multicolor CompBeads
	BD Biosciences	655051	Perline
	BD Biosciences		FACSDiva software
	Cytognos		Infinicyt
	Spherotech	Euroflow RCP-30-5a
	Soluzione
Spherotech	BCP-100-5	Perline di calibrazione in bianco
			HSA
			azoturo
			ddH2O