Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

Summary

Descriviamo un chip basato su piattaforma per il tridimensionale coltura di cellule in micro-bioreattori. Un chip in grado di ospitare fino a 10 milioni. cellule che possono essere coltivate in condizioni ben definite in relazione al flusso del fluido, tensione ecc ossigeno in una sterile, la circolazione ad anello chiuso.

Abstract

Abbiamo sviluppato un chip basato su sistema di coltura cellulare per la tridimensionalità coltivazione delle cellule. Il chip è tipicamente realizzati in polimeri non biodegradabili, per esempio, policarbonato o polimetilmetacrilato per stampaggio ad iniezione micro, micro caldo o goffratura micro termoformatura. Ma, può anche essere realizzati in polimeri biodegradabili. Le sue dimensioni sono 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (AxPxL). Le principali caratteristiche del chip utilizzati sono sia una griglia di un massimo di 1156 mc micro-contenitori (cf-chip) ciascuno delle dimensioni di 120-300 x 300 x 300 μ (AxPxL) o recessi rotonda con diametro di 300 μ e una profondità di 300 μ (r-chip). L'impalcatura può ospitare 10 milioni. cellule in una configurazione tridimensionale. Per un ottimale dei nutrienti e gas, il chip è inserito in un alloggiamento bioreattore. Il bioreattore è parte di un circuito chiuso sterile circolazione che, nella configurazione più semplice, è additionaly composto da una pompa a rulli ed un serbatoio con una media di fornitura di gas. Il bioreattore può essere eseguito in perfusione, superfusione, o anche una modalità di funzionamento misto. Abbiamo coltivato con successo linee cellulari e cellule primarie per periodi di diverse settimane. Per le cellule di fegato di ratto primarie si potrebbe mostrare una conservazione delle funzioni del organotipica per più di 2 settimane. Per linee cellulari di carcinoma epatocellulare potremmo mostrare l'induzione di geni specifici del fegato o solo leggermente espresso in coltura monostrato standard. Il sistema potrebbe anche essere utile come sistema di cellule staminali dal esperimenti di coltivazione prima differenziazione di linee di cellule staminali sono promettenti.

Protocol

Questo articolo descrive l'utilizzo di un chip basato su piattaforma (fig. 1) per la tridimensionalità coltura di linee cellulari e cellule primarie. Dato che molte cellule fare esprimere le funzioni organotipica solo in un ambiente 3D, abbiamo sviluppato un chip polimero che fornisce una impalcatura a cui le cellule possono aderire in tutte le direzioni spaziali, e che può essere montato in un alloggiamento bioreattore per il controllo del flusso del fluido , la tensione di ossigeno ecc A seconda del disegno sperimentale, la superficie del polimero può essere modificato con tecniche diverse, ad esempio, l'irradiazione UV, PECVD, γ-innesto o convenzionale chimica umida.

Figura 01

1. De-aerazione e idrofilizzazione del chip

Prima dell'uso, il chip deve essere disaerata e hydrophilized. Per questo, una serie di alcol viene effettuata. Soluzioni isopropanolo composta al 100%, 70%, 50%, 30% di isopropanolo in DMPC trattati con acqua sono preparati e il chip viene immerso in ciascuna concentrazione, a cominciare dalla soluzione al 100%, per un massimo di 30 anni. La fase finale della serie è costituito da pura pirocarbonato Dimetil (DMPC)-acqua trattata. Da questo punto in poi, è importante mantenere il chip bagnato.

2. Collagene I rivestimento

Dopo la serie di alcol, il chip è di solito ricoperto con una soluzione di collagene che dalla coda di ratto. Dalla soluzione di collagene stock di 2 mg / ml in 0,2% di acido acetico un'aliquota pari al 30 mcg proteina collagene viene diluito con DMPC trattati con acqua ad un volume finale di 150 microlitri. Ciò si traduce in un rivestimento di collagene della superficie del chip con una densità di 10 mg di collagene I superficie per cm ² di superficie.

3. Inoculazione di cellule di carcinoma epatocellulare

Cellule di carcinoma epatocellulare di linea Hep G2 sono trypsinized e contati. A breve termine esperimenti (1 a 6 giorni) 5 * 10 ⁶ cellule vengono inoculate in ogni chip e la relativa sorveglianza e 6 centimetri di tessuto cultura piastre Petri. Per inoculte, il chip 5 * 10 ⁶ cellule sono risospese in 150 microlitri terreno di coltura e messo in cima alla zona microstrutturate del chip (fig. 2). In seguito, si è posto in un incubatore per 2-3 ore. Durante questo periodo di incubazione le cellule sedimento nella micro-contenitori e aderire al collagene I rivestite patibolo.

Figura 2

4. L'inserimento del chip nel corpo bioreattore

Dopo il periodo di incubazione, il chip viene rimosso dal termostato e montato nella custodia bioreattore. Per questo, sotto il banco pulito, il bioreattore premontato viene rimosso dalla confezione sterile e smontato in una misura che consente l'inserimento del chip. Il chip viene accuratamente gestita con una pinza sterile e posizionato nella scanalatura che contiene la guarnizione che sigilla il chip e che si traduce nella generazione di un vano superiore e inferiore del bioreattore. Poi, il bioreattore è montato di nuovo e trasferito l'incubatore in cui è collegata alla pompa, la fornitura di gas e l'analizzatore di ossigeno.

5. Riempimento del sistema

Non appena il bioreattore è collegato al serbatoio di media, pompa e il ciclo di fornitura del gas a circuito chiuso è pieno di media. Questo viene fatto posizionando il 3-way-connettori in modo tale che superfusione, che è definito come il passaggio del fluido sopra la parte superiore del chip, è raggiunto. Questo porta a una scarica di aria racchiusa dalla circolazione bioreattore senza rimuovere le cellule dal patibolo. Dopo che il sistema è completamente piena di media, il 3-way-connettori sono collegati in modo tale che perfusione, che è definito come il flusso dal basso il chip attraverso il tessuto, è raggiunto. Nella configurazione di perfusione il flusso è regolato ai bisogni della cellula che per epatociti varia tipicamente 6-50 microlitri / min.

6. Campionatura

Durante l'esperimento i campioni mezzo può essere disegnato. Per questo, siringhe sono collegate alle porte sterile sulla parte superiore del serbatoio mezzo. Dopo il campionamento, le porte sono sterilizzati con il 70% di isopropanolo.

7. Isolamento di cellule intatte dal chip per le applicazioni a valle

Alla fine dell'esperimento, i bioreattori sono scollegati dalla rete del gas e la pompa a rulli, trasferiti al banco pulita e smontata, come descritto in precedenza. Con una pinza sterile, il chip viene rimosso dal corpo bioreattore, postoin un piatto cm 3.5 Petri e sciacquati con PBS. In seguito, il chip è incubato con tripsina / EDTA (0,25% / 0,53 mm) per 5-15 minuti in un incubatore per staccare le cellule dalla zona microstrutturata. La sospensione di cellule raccolte è centrifugato per 5 min a 600 g. Le cellule possono quindi essere utilizzati per tradizionali applicazioni a valle, ad esempio, l'RNA totale o isolamento delle proteine. Di routine, isoliamo RNA totale (PARIS kit, Ambion Inc., Austin, Texas, USA) per l'analisi microarray e real-time RT-PCR. Espressione della proteina è analizzata dopo colorazione immunoistochimica delle cellule all'interno del chip con un microscopio a scansione laser, ma può anche essere analizzato in caso contrario, ad esempio, in citometria a flusso.

Discussion

Abbiamo sviluppato un chip basato su piattaforma per il tridimensionale coltura di cellule in bioreattori micro attivamente perfusi. I chip possono essere fabbricati da non biodegradabili e polimeri biodegradabili per stampaggio ad iniezione micro, goffratura a caldo ed micro tecniche di termoformatura ^3. A seconda del disegno sperimentale, la superficie del polimero può essere modificato da irradiazione ^UV-4. Linee cellulari di epatociti così come epatociti primari di ratto può essere coltivata con successo in questi ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellule	Altro	ATCC	HB-8065
Collagene I da coda di ratto	Reagente	Roche Gruppo	11 179 179 001
Kit PARIS	Reagente	Ambion	AM1921
Syto16	Reagente	Invitrogen	S7578
anti citocheratina 18	Anticorpo	Abcam	ab668	Ab primario, Topo monoclonale, usato 1/100 in PBS
Anticorpo anti E-caderina		Abcam	ab1416	Ab primario, monoclonale di topo, usato 1/50 in PBS.
Reagente	anti-albumina di capra Bethyl	Laboratories	E80-129	Ab primario, albumina anti-umana di capra, usato 1/200 in PBS
Anticorpo IgG1 anti-topo di coniglio		Invitrogen	A11059	Ab secondario, farina Alexa 488 coniugata, usata 1/100 in PBS + 0,5 % BSA
Cy3 anti-capra	Reagente	IgG Jackson ImmunoResearch	705-165-003	Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, usato 1/700 in PBS + 0,5% BSA