Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.

Abstract

La possibilità di sincronizzare le cellule è stata fondamentale per far avanzare la nostra comprensione della regolazione del ciclo cellulare. Tecniche comuni impiegate includono privazione del siero; sostanze chimiche che arrestano le cellule alle fasi del ciclo cellulare diverso; o l'uso di shake-off mitotic che sfrutta la loro aderenza ridotta. Tuttavia, tutti questi hanno svantaggi. Ad esempio, inedia del siero funziona bene per le cellule normali ma meno bene per le cellule del tumore con i checkpoint del ciclo cellulare compromessa a causa della perdita di soppressore del tumore o l'attivazione dell'oncogene. Allo stesso modo, popolazioni cellulari trattati chimicamente possono harbor danno farmaco-indotto e mostrano le alterazioni legate allo stress. Una tecnica che aggira questi problemi è elutriazione centrifugo controcorrente (CCE), dove le cellule sono soggetti a due forze opposte, la forza centrifuga e la velocità del fluido, che provoca la separazione delle cellule in base a dimensione e densità. Poiché le cellule avanzando attraverso il ciclo in genere ingrandicono, CCE può essere utilizzato per separare le cellule in fasi del ciclo cellulare diverso. Qui applichiamo questa tecnica alle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria. In condizioni ottimali, una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M è ottenibile in ottima resa. Queste popolazioni cellulari sono ideali per studi ciclo cellulare-dipendente meccanismi d'azione dei farmaci anticancro e per altre applicazioni. Abbiamo anche mostrare come modifiche alla procedura standard può comportare prestazioni non ottimali e discutere le limitazioni della tecnica. La metodologia dettagliata presentata dovrebbe agevolare applicazione ed esplorazione della tecnica ad altri tipi di cellule.

Introduzione

Le cellule coltivate in genere crescono in modo asincrono e singole celle sono presenti nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Alcuni organismi presentano cicli cellulari naturalmente sincroni o possono essere sincronizzati da specifici stimoli fisiologici. Ad esempio, nuclei all'interno di giganti plasmodi della muffa di melma Physarum polycephalum dividono in un modo altamente sincrono¹e le cellule delle alghe verde che Desmodesmus quadricauda possono essere sincronizzati da un'alternanza di luce e buio periodi². Mentre tali organismi offrono unici attributi sperimentali, modellano non adeguatamente la complessità delle cellule di mammiferi. La possibilità di sincronizzare artificialmente popolazioni di cellule di mammifero è stata fondamentale per far avanzare la nostra comprensione della regolazione del ciclo cellulare e le basi molecolari dei checkpoint del ciclo cellulare. Metodi comuni includono la privazione del siero, chimica blocco e rilascio o sfruttando le caratteristiche fisiche^3,4. Prelievo di siero spesso induce le cellule a entrare in quiescenza, e tale aggiunta di siero promuove il rientro del ciclo cellulare in fase G1⁵. Inibitori chimici includono gli agenti quali timidina eccedente hydroxyurea che bloccano le cellule al contorno di G1/S o inibitori del microtubulo che tipicamente arrestano le cellule in fase^3,M⁴. Approcci che sfruttano le caratteristiche fisiche includono shake-off mitotic che può essere utilizzato per arricchire per cellule mitotiche poiché sono meno aderenti di interfase celle⁶. Tuttavia, tutte queste tecniche hanno svantaggi potenziali. Ad esempio, non tutti i tipi di cellule mantengono vitalità in assenza di siero o la presenza di inibitori chimici e la resa delle cellule dopo shake-off mitotica è limitato senza preventiva sincronizzazione con inibitori mitotici.

Ad eccezione dei primi cicli cellulari embrionali, dove le cellule diminuiscono progressivamente di dimensioni come dividono⁷, maggior parte delle cellule avanzando attraverso il ciclo di subire le fasi di crescita e diventano più grande. Questa proprietà viene sfruttata nella tecnica della elutriazione centrifugo controcorrente (CCE), che può essere utilizzato per separare le cellule differiscono per dimensioni e quindi nel ciclo cellulare fase^8,9. Durante CCE, le cellule sono sotto l'influenza di due forze opposte: la forza centrifuga, che spinge le cellule dall'asse di rotazione e la velocità del fluido (controcorrente), che spinge le cellule verso l'asse di rotazione (Figura 1). Le cellule nella camera di elutriazione raggiungere una posizione di equilibrio dove queste forze sono uguali. Densità e diametro delle cellule sono i fattori chiave che dettano la posizione di equilibrio. Come il flusso del tasso della soluzione tampone è aumentato e la forza di trascinamento controcorrente supera la forza centrifuga, è stabilito un nuovo equilibrio, causando un cambiamento nella posizione delle cellule all'interno della camera. Tutte le celle vengono spostate verso l'uscita della camera, con conseguente più piccoli lasciando l'aula in primo luogo, considerando che le più grandi cellule rimanere all'interno della camera fino a quando il tasso di controcorrente è aumentato sufficientemente per promuovere la loro uscita. Le cellule fuggire la camera di elutriazione con aumenti consecutivi nel tasso di controcorrente possono essere raccolti in frazioni specifiche e ciascuna frazione contiene cellule in sequenza crescente di dimensioni. Invece di condurre elutriazione con aumenti incrementali nel tasso di controcorrente, sequenziale diminuisce in forza centrifuga diminuendo la velocità di centrifugazione compirà lo stesso risultato. Il processo di elutriazione richiede l'ottimizzazione a seconda del tipo di cellula, buffer elutriazione impiegate e le specifiche dell'apparecchio utilizzato. Il tasso di sedimentazione delle cellule in queste condizioni è meglio descritto dalla legge di Stokes: SV = [d²(ρ_p- ρ_m) / 18η] .ω²r, dove SV = velocità di sedimentazione; d = diametro della particella; Ρ_p = densità della particella; Ρ_m = densità del buffer; Η = viscosità del buffer; Ω = Velocità angolare del rotore; e r = radiale posizione della particella. Così, SV è proporzionale alla densità e diametro delle cellule, e dal momento che il diametro è elevato alla seconda potenza, contribuisce più significativamente densità che è generalmente costante durante il ciclo cellulare.

Un importante vantaggio di CCE è che le cellule non sono sottoposti a dure condizioni di trattamento chimico o privazione nutrizionale e possono essere recuperate in ottima resa essenzialmente senza scomporsi. Un requisito è che le cellule in questione subiscono un significativo aumento di diametro, di almeno il 30%, mentre attraversano il ciclo cellulare. Lo svantaggio principale è il costo della centrifuga specializzata, rotore e accessori. Tuttavia, la capacità di preparare cellule arricchite in fasi del ciclo cellulare specifico da CCE ha notevolmente facilitato ricerca ciclo cellulare negli organismi da lievito per cellule di mammifero^9,10. Inoltre, i recenti progressi stanno espandendo usi alla separazione delle cellule da sano rispetto al tessuto cancerogeno, la separazione dei diversi tipi di cellule in miscugli eterogenei e per la produzione di tipi cellulari specifici per immunoterapia⁹.

Il nostro interesse principale è stato la comprensione del meccanismo d'azione del microtubule targeting agenti (MTA) come alcaloidi della vinca e taxani. Queste droghe sono state pensate per agire esclusivamente in mitosi, blocco mandrino microtubule funzione^11,12, ma la prova recente suggerisce che possono anche rivolgersi a interfase i microtubuli^13,14. Recentemente abbiamo riferito che le cellule primarie leucemia linfoblastica acuta (tutta) subiscono la morte in una fase G1 o in M di fase quando trattati con vincristina e altri MTA in un modo dipendente dal ciclo cellulare¹⁵. La capacità di separare tutte le cellule in ciclo cellulare diverse fasi di CCE è stato determinante per giungere a questa conclusione. In questo articolo, descriviamo i dettagli tecnici e offrire consigli pratici per l'applicazione di CCE per la preparazione delle primarie tutte le cellule nel ciclo cellulare diverse fasi.

Protocollo

Nota: questo protocollo è stato ottimizzato per primaria B-tutte le cellule che vanno in diametro da circa 8 µm (fase G1) a 13 µm (fasi di G2/M). Così, la velocità di centrifuga specifico e tassi di flusso della pompa non siano applicabili alle celle con intervalli di dimensioni diverse. Tuttavia, del caso elutriazione parametri possono essere stimati utilizzando l'equazione di tasso di sedimentazione. Le cellule sono coltivate in un medium privo di siero definito come descritto ¹⁶ ad una densità ottima di 1-3 x 10 ⁶ cellule/mL. Fatta eccezione per la raccolta delle frazioni che si svolge a 4 ° C, utilizzando tubi di raffreddamento a ghiaccio, tutte le operazioni sono condotte a temperatura ambiente e la centrifuga impostata a 20 ° C con un massimo di 24 ° C.

1. preparazione di elutriazione Buffer e materiali

1. al fine di ridurre l'aggregazione delle cellule, preparare un tampone di elutriazione di Hank ' s equilibrata soluzione salina (HBSS) con rosso fenolo completato con 2% di siero bovino fetale ( FBS), per proteggere le cellule dallo stress meccanico durante il processo di elutriazione e 1,6 g/L di sale 2-naphthol-6,8-disolfonico acido dipotassico (NDA), che rende l'esterno cella carico negativamente e riduce l'agglutinamento.
   1. Aggiungere 1,6 g di NDA una provetta conica da 50 mL.
   2. In condizioni sterili, aggiungere 35 mL di HBSS da una bottiglia da 1 litro per la provetta conica da 50 mL contenente NDA. Agitare la provetta fino a sciolta la NDA.
   3. Usando un filtro di 0,2 µm, trasferire la NDA disciolta in una nuova provetta conica sterile 50 mL. Quindi aggiungere la NDA per il restante 1 L di HBSS.
   4. Infine, aggiungere mL 21 FBS HBSS per ottenere una concentrazione finale del 2% (v/v).
      Nota: Il buffer di elutriazione può essere preparato e conservato a 4 ° C fino alla data di scadenza sull'HBSS, o fino a quando c'è un grande cambiamento del pH, come indicato da un ingiallimento del colorante indicatore.
2. Etichetta 50 mL provette coniche per la raccolta delle frazioni affinché ci sono tubi etichettati lavare le frazioni di (W1 e W2), 1-20 (F1 - F20) 1 e 2 e STOP.
   1. Pre-chill questi tubi sul ghiaccio prima di raccogliere le frazioni.

2. Assemblaggio del sistema di classificazione mediante veicolo fluido

1. in primo luogo, installare l'assembly di strobo nella centrifuga in modo che il cavo di alimentazione è alimentato dalla camera attraverso la porta sul lato sinistro. Assicurarsi che la lampada flash strobo sia nella parte anteriore della camera di modo che si allinei con la finestra di visualizzazione quando la centrifuga viene chiuso.
   1. Fissare il gruppo al posto di prima due viti Phillips a testa nei due fori nella parte superiore di ogni staffa e poi stringendo le viti nella parte inferiore di ogni staffa.
   2. Collegare il cavo di alimentazione alla porta di alimentazione dello stroboscopio sul retro della centrifuga.
2. Successivamente, impostare il rotore verso il basso sul mozzo disco centrifuga e fissare con una chiave esagonale da impugnatura a T.
   Nota: Se la centrifuga non è necessario per gli scopi non-elutriazione, l'Assemblea di strobo e il rotore può essere conservati in centrifuga tra le esecuzioni.
3. Dopo aver fissato il rotore, è collocare il gruppo di sgancio rapido contenente elutriazione sezione, contrappeso, rotanti assieme tenuta e una piastra di montaggio nel rotore.
   1. Spingere verso il basso in modo uniforme con una mano sulla camera elutriazione e l'altra mano sul contrappeso fino a quando i bulloni nel rotore a scatto nei fori sulla piastra di montaggio.
   2. Infine, collegare il cavo di ancoraggio posizionando il pin su un lato del cavo nel foro il gruppo rotante della tenuta e protezione eyehole su altro lato del cavo con una delle viti Phillips a testa (menzionate al punto 2.1.1) sulla staffa sul lato sinistro o Camera di f.
4. Successivamente, montare il sistema di flusso utilizzando una pompa a velocità variabile e tubazione al buffer di pompa nella classificazione mediante veicolo fluido dell'alloggiamento e raccogliere buffer come fluisce nella camera di classificazione mediante veicolo fluido.
   1. Inserire il tubo di ingresso taglia 16 provenienti dalla pompa a velocità variabile tramite la porta nella parte superiore sinistra della camera della centrifuga in modo che entra nella camera.
   2. Collegare un raccordo all'estremità libera del tubo di ingresso e inserire il raccordo nel foro di ingresso sul lato di assieme della tenuta rotante.
   3. Inserisci la dimensione 16 tubi attraverso la porta di uscita e collegarlo al tubo di trasferimento nella parte superiore della parte rotante assieme della tenuta.
      Nota: Il sistema di flusso può anche rimanere montato tra le esecuzioni di elutriazione.
5. Infine, attivare la centrifuga e impostare le specifiche necessarie per l'esperimento.
   1. Cambia il rotore ID.
   2. Se la centrifuga richiede un input di tempo, impostare per 2 h, che è più che sufficiente per completare un elutriazione eseguire.
   3. Impostare la temperatura a 20 ° C con una temperatura max di 24 ° C.
   4. Impostare l'accelerazione per max e la decelerazione per lento.
   5. Infine, impostare la velocità a 867 x g.

3. Innesco del sistema elutriazione

1. in primo luogo al fine di sterilizzare il sistema di classificazione mediante veicolo fluido, inserire il tubo serbatoio in una bottiglia di plastica da 500 mL contenente candeggina al 5% e inserire il tubo di uscita in una bottiglia di rifiuti in plastica vuota di 1 L.
   1. Accendere la pompa e impostare la velocità di 25 mL/min e lasciare che la candeggina 5% a scorrere tutto il modo attraverso il sistema di classificazione mediante veicolo fluido fino a quando non viene pompato fuori dal tubo di uscita nella bottiglia degli scarti.
   2. Attivare la centrifuga e lasciare che entri al massimo indicato velocità (867 x g) al fine di liberare le bolle e contropressione.
   3. Blocca la centrifuga. Una volta che il rotore ha smesso di ruotare, aprire il coperchio e ispezionare la camera non vi siano perdite.
   4. Se non vi siano perdite, lasciate che la soluzione di candeggina flusso attraverso il sistema per almeno 5 min
2. Successivamente, lavare il sistema con acqua in autoclave come candeggina può portare alla formazione di precipitati dal buffer elutriazione che può portare a agglutinamento delle cellule, come pure causare danni alle cellule.
   1. Posto il tubo serbatoio in una bottiglia da 1 litro di sterilizzato nell'autoclave acqua e permettono di irrigare attraverso per almeno 10 min.
3. Dopo il lavaggio con acqua, introdurre il tampone elutriazione nel sistema. Utilizzare una bottiglia di vetro di 150 mL che è stato sterilizzato nell'autoclave per creare un serbatoio per il buffer di elutriazione e cellule.
   1. Aggiungere 100 mL di tampone di elutriazione alla bottiglia e spostare il serbatoio della tubazione per la bottiglia di vetro modo che il tubo sia nella parte inferiore.
   2. Avviare la centrifuga e permettere al tampone di fluire attraverso il sistema per svuotare l'acqua.
   3. Una volta la bottiglia serbatoio è quasi vuota, e l'acqua viene scaricata completamente fuori dal sistema, spostare l'uscita della tubazione dalla bottiglia degli scarti al serbatoio affinché il buffer viene riciclato attraverso il sistema.
4. Infine, regolare la finestra di visualizzazione in modo che la camera di elutriazione può essere visto alla velocità corrente.
   1. Stampa la strobo lampada pulsante all'esterno della centrifuga di alimentazione così che la lampada si accende. Girare il k elutriazioneNob anche sul lato esterno della centrifuga tutta la strada a sinistra.
   2. Mentre guardando attraverso la finestra di visualizzazione, lentamente girare la manopola verso destra fino a quando la camera di elutriazione entra in vista e la luce stroboscopica è nel tempo con la rotazione del rotore.
      Nota: Il sistema di classificazione mediante veicolo fluido può essere lasciato in questo stato fino a quando le cellule sono prepped.

4. Preparazione del campione delle cellule

1. conteggio celle e aliquota 300 a 400 milioni in crescita medio in diverse provette coniche da 50 mL. Rotazione verso il basso le cellule a 1210 x g per 3 min.
2. Aspirato fuori crescita media e risospendere le cellule in 25 mL di tampone di elutriazione pipettando su e giù delicatamente.
3. Al fine di ridurre la cella che ragruppa, cellule passa due volte attraverso un 25 ago del manometro.
   1. Usando una siringa da 10 mL redigere le celle e quindi allegare 25 ago di calibro e passare le cellule attraverso l'interno muro di una provetta conica sterile 50 mL. Ripetere l'operazione finché tutti i 25 mL sono passati attraverso l'ago.
   2. Ottenere un nuovo ago e siringa e ripetere il processo sopra una volta.
      Attenzione: Aghi siringhe devono essere posti in contenitori di sharps.
      Nota: È fondamentale che le cellule sono spinto attraverso l'ago immediatamente prima di introdurli al sistema di classificazione mediante veicolo fluido a tenere il cellulare agglutinamento al minimo.

5. Introduzione del campione di cellule nel sistema di classificazione mediante veicolo fluido e raccolta delle frazioni

1. introdurre il campione di cellule nel sistema elutriazione versando il campione di cellule nel serbatoio che ha il restante buffer elutriazione riciclaggio attraverso .
   1. Lasciare che le celle entrare nel sistema e raggiungere l'equilibrio all'interno della camera di elutriazione.
      Nota: Questo processo richiederà circa 5 minuti e progresso può essere rintracciato guardando le cellule come essi entrano nella camera attraverso la finestra di visualizzazione. Per garantire che tutte le celle sono in aula, prendere una goccia di eluente, posto su un vetrino e mostra sotto un microscopio. Se il campione è libero di cellule intatte, questo conferma la loro conservazione nella camera.
2. Iniziare la raccolta delle frazioni una volta tutte le celle siano entrati in camera e c'è un confine distinto nella parte più larga della camera in cui le cellule sono in equilibrio.
   1. Begin spostando il tubo di uscita per la provetta conica da 50 mL con l'etichetta W1. Raccogliere 50 mL di tampone di elutriazione per questa frazione, assicurandosi di tenere d'occhio il serbatoio e riempire con buffer elutriazione quando necessario.
      Nota: Al fine di assicurarsi che tutte le celle sono entrati nel sistema, lasciare che il serbatoio di serbatoio di diventare quasi vuoto prima di riempimento del serbatoio la prima volta. Dopo la prima ricarica non sarà necessario attendere il serbatoio a diventare quasi vuoto. Inoltre, non si deve mai lasciare il serbatoio diventano vuote come questo creerà bolle e contropressione nel sistema.
   2. Una volta 50 mL sono stati raccolti per W1, contemporaneamente modificare la velocità a 821 x g e spostare il tubo di uscita a tubo conico etichettato W2 e raccogliere 50 mL più a questa velocità.
   3. Continuare a cambiare la velocità e raccogliendo le frazioni come indicato nella tabella 1. Assicurarsi che vi sia media nel serbatoio serbatoio e mantenere le provette coniche su ghiaccio a tutti i tempi. Infine, regolare la finestra di visualizzazione girando lentamente la manopola verso destra man mano che la velocità diminuisce.
   4. Una volta 20 tutte le frazioni sono stati raccolte, blocca la centrifuga e raccogliere 50 mL in tubo conico etichettato STOP.

6. Flushing del sistema elutriazione

1. dopo la centrifuga ha smesso completamente a filo il sistema inserendo il tubo serbatoio in bottiglia 1L di acqua in autoclave e il tubo di uscita nella bottiglia dei rifiuti.
   1. Girare la velocità della pompa fino a 50 mL/min e permettere all'acqua di fluire attraverso il sistema fino a quando non si è esaurita.
2. Girare la pompa, rimuovere il tubo di ingresso e di uscita dall'assemblaggio rapido e sfilare la spina del cavo di ancoraggio.
   1. Rimuovere l'assembly di sgancio rapido dal rotore.
      Nota: A seconda di ciò che la centrifuga verrà utilizzata per, il sistema di classificazione mediante veicolo fluido può ora essere lasciato come è. In caso contrario, tutta l'Assemblea può essere preso giù nell'ordine opposto come descritto sopra. La camera di classificazione mediante veicolo fluido possa essere rimossi dall'assemblaggio rapido e pulita tra esecuzioni utilizzando un bagno d'acqua ad ultrasuoni. Questo rimuove residui e contaminanti dalla parete della camera che può influire negativamente sulle successive esecuzioni.

7. Analisi delle frazioni e raccolta del G1 o G2/M piscine.

Nota: al fine di dimostrare l'efficacia di elutriazione, ogni frazione è analizzata per il conteggio delle cellule, diametro delle cellule e del DNA contenuto, e vengono creati pool di cellule in fase G1 o G2/M per le analisi di immunoblot, come descritto Risultati di rappresentante. Questa sezione del protocollo descriverà come creare queste piscine e prepararli per uso sperimentale.

1. Spin ogni frazione a 2000 x g per 5 min a 4 ° C e aspirato tampone elutriazione.
2. Frazioni di combinare insieme per ottenere una piscina di fasi di G2/M e una piscina di fase G1.
   1. Per il G1 fase piscina, risospendere le frazioni che sono stati raccolti nella gamma di velocità di 788 x g-661 x g (F1 - F5) in un totale di 1 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) e trasferirlo in una provetta conica da 15 mL. Per il pool di fasi di G2/M, risospendere le frazioni che sono stati raccolti nella gamma di velocità di 387 x g e 333 x g (F17 - F20).
   2. Rotazione verso il basso le cellule a 2000 x g per 5 min a 4 ° C e aspirato di PBS.
3. Risospendere le cellule in 10 mL di coltura e prendere un conteggio delle cellule.
4. Prendere un'aliquota da ogni girone da analizzare per il DNA contenuto tramite ioduro di propidio e flusso cytometric analisi ¹⁵.
   Nota: Il resto di ogni pool può essere utilizzato per ulteriori esperimenti.

Risultati

Primaria tutte le celle (3-4 x 10⁸) sono stati sottoposti a classificazione mediante veicolo fluido centrifuga e raccolti in due frazioni di lavaggio e venti frazioni principali, come descritto nel protocollo. La tabella 1 Mostra dati rappresentativi dove vengono presentato il numero totale di cellule in ogni frazione, nonché la corrispondente velocità del rotore. Nel complesso il rendimento era tipicamente oltre 80%. Misura del diametro delle cellule in singole frazioni ha con...

Discussione

Abbiamo descritto un metodo per ottenere primaria tutte le celle in diverse fasi del ciclo cellulare utilizzando CCE. In condizioni ottimali una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M potrebbe essere ottenuti prontamente in ottima resa, e cellule altamente arricchite in fase S possono essere ottenute anche se lo si desidera. I risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando uno primario che tutta cultura (in particolare, ALL-5) ed esse...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina bilanciata di Hanks,	Lonza	10-508Q,	flacone da 1 L
siero bovino Fetal Plus	Atlas Biologicals	FP-0500-A	flacone da 500 mL
2-naftolo-6,8-disolfonico, acido dipotassico, sale Acros	Organics	212-672-4	100 g in polvere
50 mL, tubi conciali	Denville Scientifics	C1062-P	, 500/caso,
PES Membrana 0,22 µ m unità filtro	Millipore	SLGP033RB	250/confezione
Avanti J-26S XPI con Elut. Non IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V	Centrifuga Beckman Coulter	B14544	compatibile con il sistema di elutriazione
Kit rotore eluttore JE 5.0	Beckman Coulter	356900	che include il rotore, la chiave esagonale con impugnatura a T, il gruppo a sgancio rapido (senza camera di elutriazione), il cavo di ancoraggio e la camera di montaggio stroboscopica,
standard, 4 ml, "A"	Beckman Coulter	356943	camera di elutriazione standard
Testa della pompa Masterflex L/S Easy-Load	Cole-Parmer	EW-07518-10
Masterflex L/S Azionamento a velocità variabile	Cole-Parmer	EW-07528-10
Tubo della pompa in silicone polimerizzato al platino Masterflex BioPharm, L/S 16	Cole-Parmer	EW-96420-16
25 G x 1,5 Ago di scorrimento di precisione	BD	305127	aghi sterili monouso
10 mL Luer-Lok siringa	BD	309604	siringhe sterili monouso
Vi-Cell XR	Beckman Coulter	383556
tampone di colorazione PI/RNasi	BD Pharmingen	550825	tampone di colorazione ioduro di propidio/RNasi
ciclina B1 (GNS1) anticorpo monoclonale IgG di topo	Santa Cruz Biotechnology	sc-245
ciclina D1 (DCS-6) anticorpo monoclonale IgG di topo	Santa Cruz Biotechnology	sc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR coniglio monoclonale anticorpo	Cell Signaling Technology	8516s
GAPDH (14C10) coniglio monoclonale	Cell Signaling Technology	2118s
Capra anti-topo IgG (H+L)-HRP coniugato	BioRad	170-6516
Capra anti-coniglio IgG (H+L)-HRP coniugato	BioRad	Codice 170-6515