Questo protocollo descrive l'uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.
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Articolo metodologico
Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La possibilità di sincronizzare le cellule è stata fondamentale per far avanzare la nostra comprensione della regolazione del ciclo cellulare. Tecniche comuni impiegate includono privazione del siero; sostanze chimiche che arrestano le cellule alle fasi del ciclo cellulare diverso; o l'uso di shake-off mitotic che sfrutta la loro aderenza ridotta. Tuttavia, tutti questi hanno svantaggi. Ad esempio, inedia del siero funziona bene per le cellule normali ma meno bene per le cellule del tumore con i checkpoint del ciclo cellulare compromessa a causa della perdita di soppressore del tumore o l'attivazione dell'oncogene. Allo stesso modo, popolazioni cellulari trattati chimicamente possono harbor danno farmaco-indotto e mostrano le alterazioni legate allo stress. Una tecnica che aggira questi problemi è elutriazione centrifugo controcorrente (CCE), dove le cellule sono soggetti a due forze opposte, la forza centrifuga e la velocità del fluido, che provoca la separazione delle cellule in base a dimensione e densità. Poiché le cellule avanzando attraverso il ciclo in genere ingrandicono, CCE può essere utilizzato per separare le cellule in fasi del ciclo cellulare diverso. Qui applichiamo questa tecnica alle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria. In condizioni ottimali, una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M è ottenibile in ottima resa. Queste popolazioni cellulari sono ideali per studi ciclo cellulare-dipendente meccanismi d'azione dei farmaci anticancro e per altre applicazioni. Abbiamo anche mostrare come modifiche alla procedura standard può comportare prestazioni non ottimali e discutere le limitazioni della tecnica. La metodologia dettagliata presentata dovrebbe agevolare applicazione ed esplorazione della tecnica ad altri tipi di cellule.
Introduzione
Le cellule coltivate in genere crescono in modo asincrono e singole celle sono presenti nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Alcuni organismi presentano cicli cellulari naturalmente sincroni o possono essere sincronizzati da specifici stimoli fisiologici. Ad esempio, nuclei all'interno di giganti plasmodi della muffa di melma Physarum polycephalum dividono in un modo altamente sincrono1e le cellule delle alghe verde che Desmodesmus quadricauda possono essere sincronizzati da un'alternanza di luce e buio periodi2. Mentre tali organismi offrono unici attributi sperimentali, modellano non adeguatamente ....
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Protocollo
Nota: questo protocollo è stato ottimizzato per primaria B-tutte le cellule che vanno in diametro da circa 8 µm (fase G1) a 13 µm (fasi di G2/M). Così, la velocità di centrifuga specifico e tassi di flusso della pompa non siano applicabili alle celle con intervalli di dimensioni diverse. Tuttavia, del caso elutriazione parametri possono essere stimati utilizzando l'equazione di tasso di sedimentazione. Le cellule sono coltivate in un medium privo di siero definito come descritto 16 ad una densità ottima di 1-3 x 10 6 cellule/mL. Fatta eccezione per la raccolta delle frazioni che si svolge a 4 ° C, utilizzando tubi di raffredd....
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Risultati
Primaria tutte le celle (3-4 x 108) sono stati sottoposti a classificazione mediante veicolo fluido centrifuga e raccolti in due frazioni di lavaggio e venti frazioni principali, come descritto nel protocollo. La tabella 1 Mostra dati rappresentativi dove vengono presentato il numero totale di cellule in ogni frazione, nonché la corrispondente velocità del rotore. Nel complesso il rendimento era tipicamente oltre 80%. Misura del diametro delle cellule in singole frazioni ha con.......
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Discussione
Abbiamo descritto un metodo per ottenere primaria tutte le celle in diverse fasi del ciclo cellulare utilizzando CCE. In condizioni ottimali una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M potrebbe essere ottenuti prontamente in ottima resa, e cellule altamente arricchite in fase S possono essere ottenute anche se lo si desidera. I risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando uno primario che tutta cultura (in particolare, ALL-5) ed esse.......
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Dichiarazioni
Anisha Kothari è attualmente presso il dipartimento di biologia cellulare e molecolare presso St. Jude Children Research Hospital.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH CA109821 (per TCC). Ringraziamo Beckman Coulter per generosamente fornendo fondi per coprire le spese di pubblicazione e per l'assistenza tecnica nella messa a punto e funzionamento del sistema di classificazione mediante veicolo fluido. Ringraziamo il Dr. Fred Falkenburg per la fornitura iniziale primario di tutte le culture.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina bilanciata di Hanks, | Lonza | 10-508Q, | flacone da 1 L |
| siero bovino Fetal Plus | Atlas Biologicals | FP-0500-A | flacone da 500 mL |
| 2-naftolo-6,8-disolfonico, acido dipotassico, sale Acros | Organics | 212-672-4 | 100 g in polvere |
| 50 mL, tubi conciali | Denville Scientifics | C1062-P | , 500/caso, |
| PES Membrana 0,22 µ m unità filtro | Millipore | SLGP033RB | 250/confezione |
| Avanti J-26S XPI con Elut. Non IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V | Centrifuga Beckman Coulter | B14544 | compatibile con il sistema di elutriazione |
| Kit rotore eluttore JE 5.0 | Beckman Coulter | 356900 | che include il rotore, la chiave esagonale con impugnatura a T, il gruppo a sgancio rapido (senza camera di elutriazione), il cavo di ancoraggio e la camera di montaggio stroboscopica, |
| standard, 4 ml, "A" | Beckman Coulter | 356943 | camera di elutriazione standard |
| Testa della pompa Masterflex L/S Easy-Load | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Azionamento a velocità variabile | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Tubo della pompa in silicone polimerizzato al platino Masterflex BioPharm, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1,5 Ago di scorrimento di precisione | BD | 305127 | aghi sterili monouso |
| 10 mL Luer-Lok siringa | BD | 309604 | siringhe sterili monouso |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| tampone di colorazione PI/RNasi | BD Pharmingen | 550825 | tampone di colorazione ioduro di propidio/RNasi |
| ciclina B1 (GNS1) anticorpo monoclonale IgG di topo | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| ciclina D1 (DCS-6) anticorpo monoclonale IgG di topo | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR coniglio monoclonale anticorpo | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) coniglio monoclonale | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Capra anti-topo IgG (H+L)-HRP coniugato | BioRad | 170-6516 | |
| Capra anti-coniglio IgG (H+L)-HRP coniugato | BioRad | Codice 170-6515 |
Riferimenti
- Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
- Sevcikova, T., et al.
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Ristampe e permessi
