Descriviamo un metodo per quantificare l'aggregazione delle proteine misfolded. I nostri dettagli di protocollo lentivirali indotto generazione linea cellulare stabile, imaging confocale automatizzata e l'analisi di immagine di aggregati proteici. Come un'applicazione illustrativa, abbiamo studiato l'effetto di piccole molecole nel promuovere l'aggregazione di SOD1 nel tempo - e dose-dipendente.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sclerosi laterale amiotrofica (ALS) è una malattia neurodegenerative mortale che può essere causata da mutazioni ereditarie nel gene codifica dello rame-zinco superossido dismutasi 1 (SOD1). L'instabilità strutturale della SOD1 e il rilevamento delle inclusioni di SOD1-positivi nei pazienti di ALS familiare supporta un potenziale ruolo causale per SOD1 misfolded e/o aggregate in patologia di ALS. In questo studio, descriviamo lo sviluppo di un'analisi basata su celle progettato per quantificare la dinamica di SOD1 aggregazione in cellule viventi di alto contenuto approcci di screening. Utilizzo di vettori lentivirali, abbiamo generato linee cellulari stabili che esprimono wild-type e mutante SOD1 A4V etichettati come proteina fluorescente gialla e trovato che entrambe le proteine sono state espresse nel citosol senza alcun segno di aggregazione. È interessante notare che, solo SOD1 A4V stabilmente espressa in HEK-293, ma non in linee cellulari di U2OS o SH-SY5Y, formano aggregati al trattamento con un inibitore del proteasoma. Mostriamo che è possibile quantificare aggregazione basata sull'analisi di dose-risposta di vari inibitori del proteosoma e per tenere traccia di cinetica di formazione di aggregati da microscopia time-lapse. Il nostro approccio introduce la possibilità di quantificare l'effetto delle mutazioni ALS sul ruolo della SOD1 nella formazione di aggregati così come screening per piccole molecole che impediscono l'aggregazione A4V SOD1.
Introduzione
L'aggregazione di proteine è un processo biologico mediante il quale misfolded gruppo di proteine fino e può agire come agenti causativi nelle malattie neurodegenerative (amiloidosi). Che caratterizzano l'aggregazione proteica è essenziale nella comprensione del ruolo degli aggregati in disfunzione cellulare anche come facilitare la scoperta di nuovi fattori che influenzano l'insorgenza della patologia. La visualizzazione delle proteine fluorescenza-etichettate in cellule viventi è un metodo potente che può essere di aiuto nello sviluppo di saggi applicabili al contenuto elevato di screening (HCS)1,2,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. produzione di lentivirus
Nota: la produzione e la manipolazione di vettori lentivirali è stato effettuato secondo le direttive del National Institutes of Health (NIH) per la ricerca che coinvolge ricombinante DNA. Il plasmide che codifica la wild-type e mutante A4V SOD1 taggati con avanzata YFP (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP) sono descritti in Kim et al. 11 entrambi prodotti di fusione del gene sono stati amplificati utilizzando la coppia di primer PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ e 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ e inserito il CMV di U3 pTRIP-delta plasmi....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Generazione stabile di cellula utilizzando lentivirus: Strategia globale per il monitoraggio di aggregati di proteine SOD1 è illustrata nella Figura 1. In una prima fase, abbiamo generato un vettore di espressione lentivirali per consegna stabile gene SOD1 in linee cellulari (passaggio 1). Due vettori lentivirali codifica YFP-etichetta SOD1 WT e SOD1 A4V (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP, rispettivamente) con imballaggio e busta plasmidi sono stati p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Ci sono due approcci principali per la generazione di linee cellulari stabili. Il primo richiede parecchie settimane e selezione di transfezione e resistenza transitoria dei vettori di DNA genomico plasmide integrato. Il secondo prende una questione di ore attraverso l'uso dei lentivirus, rendendo questo protocollo suscettibili dell'efficace espressione di proteina bersaglio in linee cellulari multiple con sforzo limitato. Il viaggio-CMV vettore19 era un vettore di sostenuta da utilizzare, con eff.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione finanziata dal governo coreano (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) e il programma di supporto individuale scienziato National Research Foundation di Corea (NRF) (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C 28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Software di imaging Harmony | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Software di analisi delle immagini Columbus | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell manipolazione dei liquidi | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Riferimenti
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).
- Honarnejad, K., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
