Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi

Sommario

Descriviamo un metodo per quantificare l'aggregazione delle proteine misfolded. I nostri dettagli di protocollo lentivirali indotto generazione linea cellulare stabile, imaging confocale automatizzata e l'analisi di immagine di aggregati proteici. Come un'applicazione illustrativa, abbiamo studiato l'effetto di piccole molecole nel promuovere l'aggregazione di SOD1 nel tempo - e dose-dipendente.

Abstract

Sclerosi laterale amiotrofica (ALS) è una malattia neurodegenerative mortale che può essere causata da mutazioni ereditarie nel gene codifica dello rame-zinco superossido dismutasi 1 (SOD1). L'instabilità strutturale della SOD1 e il rilevamento delle inclusioni di SOD1-positivi nei pazienti di ALS familiare supporta un potenziale ruolo causale per SOD1 misfolded e/o aggregate in patologia di ALS. In questo studio, descriviamo lo sviluppo di un'analisi basata su celle progettato per quantificare la dinamica di SOD1 aggregazione in cellule viventi di alto contenuto approcci di screening. Utilizzo di vettori lentivirali, abbiamo generato linee cellulari stabili che esprimono wild-type e mutante SOD1 A4V etichettati come proteina fluorescente gialla e trovato che entrambe le proteine sono state espresse nel citosol senza alcun segno di aggregazione. È interessante notare che, solo SOD1 A4V stabilmente espressa in HEK-293, ma non in linee cellulari di U2OS o SH-SY5Y, formano aggregati al trattamento con un inibitore del proteasoma. Mostriamo che è possibile quantificare aggregazione basata sull'analisi di dose-risposta di vari inibitori del proteosoma e per tenere traccia di cinetica di formazione di aggregati da microscopia time-lapse. Il nostro approccio introduce la possibilità di quantificare l'effetto delle mutazioni ALS sul ruolo della SOD1 nella formazione di aggregati così come screening per piccole molecole che impediscono l'aggregazione A4V SOD1.

Introduzione

L'aggregazione di proteine è un processo biologico mediante il quale misfolded gruppo di proteine fino e può agire come agenti causativi nelle malattie neurodegenerative (amiloidosi). Che caratterizzano l'aggregazione proteica è essenziale nella comprensione del ruolo degli aggregati in disfunzione cellulare anche come facilitare la scoperta di nuovi fattori che influenzano l'insorgenza della patologia. La visualizzazione delle proteine fluorescenza-etichettate in cellule viventi è un metodo potente che può essere di aiuto nello sviluppo di saggi applicabili al contenuto elevato di screening (HCS)^1,2,3,4.

Sclerosi laterale amiotrofica (ALS) è considerata come una malattia proteopathic causata dalla presenza di proteine misfolded con la propensione ad aggregare e si accumulano in motoneuroni ALS familiare (fALS) sia sporadico di ALS (SLAs)^5,6 . Un sottoinsieme di ~ 20% dei casi di fALS sono associati con le mutazioni dominanti nel gene che codifica per l'enzima antiossidante citosolico rame-zinco superossido dismutasi di tipo 1 (SOD1)^7,8. Sono state proposte diverse possibili cause per questa disfunzione geneticamente derivata, compreso i cambiamenti nella struttura e nella funzione di SOD1 varianti, quali stabilità aberrante, tasso aumentato di spiegamento e propensione all'aggregazione^{9, 10}. In particolare, l'unica proprietà verificata e potenzialmente tossico condiviso da entrambe le varianti di ALS-collegato SOD1 e wild type (WT) SOD1 è una tendenza aumentata a formare aggregati proteici compartimenti o inclusioni proteiche^11,12 . Misfolded mutante SOD1, é costantemente poliubiquitinate e degradato dal sistema ubiquitina-proteasoma. Di conseguenza, un basso livello di inibizione del proteasoma conduce all'accumulazione del mutante che SOD1 aggrega^13,14, quali strutture amorfe di forma è composta da componenti solubili che possono scambiare con SOD1 mutante solubile nel citosol¹⁵. In particolare, SOD1 mutante A4V (alanina a codone 4 cambiato a valina) è la mutazione più comune causa di ALS e conduce alla neurodegenerazione di tipo rapido con un tempo di sopravvivenza medio di meno di 2 anni dopo la malattia inizio¹⁶. Biochimicamente, SOD1 A4V ha un'aumentata tendenza al monomerize, aggregare e formare pori dell'amiloide; i poro-come i complessi sono simili a pori dell'amiloide di altre forme mutanti legate alla patologia, come α-synuclein e β-amiloide proteina¹⁷. Per studiare la dinamica di accumulo di SOD1-aggregato, metodi per il monitoraggio solubili e insolubili forme di aggregazione SOD1 rimangono per essere sviluppato.

Precedentemente abbiamo indicato, usando la formazione immagine di cellule vive e cellule HEK-293 transfected transitoriamente con fluorescente contrassegnati proteina SOD1, che mutazioni associate a ALS alterano SOD1 dimerizzazione e aggregazione¹¹. Anche se i sistemi di espressione transiente possono fornire utili informazioni circa l'esito biologico della sovraespressione genica a breve termine, metodi fornendo integrazione stabile dei geni desiderati possono essere preferiti per sviluppo di analisi. Come tale, vettori lentivirali offrono la possibilità di conferire l'espressione genica a lungo termine e regolata su cellule di mammifero ¹⁸. In questo studio, ci siamo concentrati sulla generazione di linee cellulari stabilizzate trasformata con lentivirus ricombinanti WT del cuscinetto e mutante SOD1 contrassegnati con la proteina fluorescente gialla (YFP). Utilizzando cellule vive imaging microscopia e quantificazione automatizzata dell'aggregazione di SOD1, abbiamo attivato e quantificato SOD1 tra gli eventi di aggregazione all'inibizione del proteasoma.

Protocollo

1. produzione di lentivirus

Nota: la produzione e la manipolazione di vettori lentivirali è stato effettuato secondo le direttive del National Institutes of Health (NIH) per la ricerca che coinvolge ricombinante DNA. Il plasmide che codifica la wild-type e mutante A4V SOD1 taggati con avanzata YFP (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP) sono descritti in Kim et al. ¹¹ entrambi prodotti di fusione del gene sono stati amplificati utilizzando la coppia di primer PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ e 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ e inserito il CMV di U3 pTRIP-delta plasmide ¹⁹ utilizzo XhoI e BsrGI siti di restrizione. In precedenti esperimenti, le cellule HEK 293T sono state spaccate con un rapporto di 1:4 a 1:6 ogni due giorni. Evasione di più di 20 passaggi e mantenimento delle cellule a meno 60% e confluenza aiuta ad assicurare l'efficienza di trasfezione buona.

1. Il giorno 1, dividere le cellule HEK 293T confluenza di 30-40% in una piastra di coltura del tessuto di diametro di 10 cm (3 x 10 ⁶ cellule/piatto) in 10 mL di terreno di coltura cellulare (alto-glucosio DMEM con 10% FBS e 4 mM L-Glutammina) per la produzione di virus.
2. Tenere la coltura del tessuto 10 cm diametro piastra in un incubatore a CO ₂ (37 ° C, 5% CO ₂) durante la notte.
3. Il giorno 2, preparare una soluzione di transfezione del DNA contenente 10 µ g di vettori lentivirali (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP o - SOD1A4V-YFP) insieme con i vettori lentivirali imballaggio (plasmidi (5 µ g di pVSVg; 10 µ g di pCMV-dR8.71) Figura 2A) ²⁰. Aggiungere 125 µ l di 1 M CaCl ₂ e regolare il volume a 500 µ l con acqua distillata. Delicatamente aggiungere 500 µ l di 0,05 M HEPES nell'impasto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Sostituisci HEK-293T cellule medio con 10 mL pre-riscaldato fresco mezzo di coltura privo di antibiotico misto con 1 mL di soluzione di transfezione del DNA e incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO ₂.
5. Il giorno 3, sostituire la cella surnatante con terreno di coltura fresco.
6. Il giorno 4, raccogliere il surnatante in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 500 x g per rimuovere le cellule morte e detriti. Purificare ulteriormente il surnatante facendolo passare attraverso un filtro da 0,45 µm utilizzando una siringa grande 60 mL. Immediatamente dispensare in aliquote monouso (300 µ l) e conservare a-80 ° C. Per mantenere l'attività massima del prodotto, evitare un ciclo di congelamento-scongelamento.

2. Trasduzione lentivirale

1. dividere la linea cellulare di essere infetti alla confluenza del 60% (cellule HEK-293 e SH-SY5Y; 5 x 10 ⁵ cellule per pozzetto e U2OS; 1 x 10 ⁵ cellule per pozzetto) in una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti in 2 mL di terreno DMEM completate con 10% FBS.
2. Tenere la piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti in un incubatore a 37 ° C 5% CO ₂ durante la notte.
3. Rimuovere i lentivirus congelati dal congelatore-80 ° C e scongelare un'aliquota sul ghiaccio prima di ogni utilizzo; non ricongelare.
4. Mentre il virus è lo scongelamento, riscaldare il mezzo di coltura cellulare contenente siero compatibile con la linea cellulare di interesse. Una volta che il virus è completamente scongelato, preparare una serie di diluizioni (1:3, 01:10, 01:30 e 1: 100) in DMEM in un tubo di microfuge fresco 1,5 mL.
5. Portare il volume nei tubi a mL 1 con media di siero riduttore.
6. Add 2 µ l di Polybrene (presso un magazzino di 4 µ g / µ l) di 1 mL di virus e media. Miscelare bene pipettando e aggiungere 1 mL di miscela per le cellule. Incubare le cellule con il virus per 24 h.
7. Rimuovere il supporto di virus e sostituire con normale media DMEM supplementato con 10% FBS. Mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂.
8. Monitorare la crescita delle cellule e cambiare il cultura media ogni due giorni. Confluenza, espandere il piatto 6 pozzetti in una piastra di coltura del tessuto del diametro di 10 cm.
9. Una volta che le cellule sono state ampliate in modo sufficientemente, seme 1.5 x 10 ⁴ cellule per bene in 50 µ l di media DMEM su piastre 384 pozzetti test per verificare il livello di espressione della YFP contrassegnato come proteina da microscopia. Se il YFP proteina cellulare espressione tagged Mostra un rapporto segnale-rumore ≥ 3, preparare il brodo di cella per la corrispondente linea cellulare.

3. Tempo dipendente effetto dell'inibitore del proteosoma su aggregazione proteica

Nota: effettuare l'acquisizione immagine utilizzando un microscopio automatizzato (Vedi materiali).

1. Dispensare 0,25 µ l di DMSO o proteasoma inibitore disciolti in 100% DMSO (ESGONALE, 2mm) sulle piastre di fondo piatto 384 pozzetti.
2. Manualmente le cellule ⁴ seme 1.5 x 10 per pozzetto in 50 µ l di DMEM media sulla stessa piastra di dosaggio. La concentrazione finale di proteasoma inibitore (ESGONALE) dovrebbe essere di 10 µM.
3. Impostare l'unità di controllo ambientale del sistema di microscopio a 37 ° C e 5% CO ₂. Uno screenshot del setup sperimentale è illustrato nella Figura 3.
4. Operare al microscopio in modalità di fluorescenza ampio campo, utilizzando il software con le seguenti impostazioni: LWD 20 X obiettivo, modalità non-confocale, 4 campi/bene, con un intervallo di acquisizione di un'ora. Alla fine di ogni esecuzione, le immagini catturate vengono automaticamente caricate sul server.

4. Tempo di formazione immagine lasso per espressione di YFP in cellule viventi e analisi (singolo canale) dell'immagine

Nota: I passaggi seguenti descrivono l'applicazione del software (ad es., Columbus).

1. Selezionare l'appropriato algoritmo per segmentare gli oggetti primari (citosol e aggregati). Se necessario, regolare i parametri di soglia e contrasto sfondo ( Figura 4).
2. Numero di celle utilizzando ' trovare le celle ' con una soglia individuale di 0.1 per il canale di intensità YFP. Determinare gli aggregati utilizzando un ' trovare macchie ' algoritmo con un'intensità relativa di spot YFP > 0,2 e un coefficiente di suddivisione di 1.0.

5. Effetto di reazione di inibitori del proteasoma su aggregazione della proteina in cellule viventi che hanno macchiato per loro nuclei (due canali) della dose

Nota: effettuare l'acquisizione immagine utilizzando un microscopio automatizzato. Determinare l'intervallo di concentrazione di inibitori del proteasoma (ESGONALE, epoxomicina e MG132) sulla base del valore di ₅₀ IC previsto per garantire una calzata ottimale curva.

1. Preparare diluizioni seriali di composti su un polipropilene deposito 384 pozzetti della piastra dallo standard serie di diluizione di 1:3. Assicurarsi di mescolare le diluizioni mescola bene per garantire che le concentrazioni di composte siano accurate.
2. Versare 0,25 µ l di inibitori del proteasoma sulle piastre di vuoto fondo piatto nero 384 pozzetti dosaggio. Usiamo un gestore liquido equipaggiato con una testa di 384-capillare in grado di trasferire volumi.
3. Seme 1.5 x 10 ⁴ cellule per pozzetto in 50 µ l di DMEM Media sulle piastre di dosaggio. Incubare le piastre di dosaggio a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 24 h.
4. Aggiungere 10 μl di DMEM Media (preriscaldato a 37 ° C) con la macchiatura soluzione (Hoechst 33342 a uno stock di 10 mg/mL) e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
5. Lanciare il microsfar fronte software operativo. Uno screenshot del setup sperimentale è illustrato nella Figura 6. Selezionare il " configurazione " scheda e selezionare 20X obiettivo e il tipo di lastra corretta. Garantire " collo " è impostata sul valore corretto sull'obiettivo che permette la corretta messa a fuoco con i tipi differenti.
6. Seleziona il " microscopio " Tab. Definisci l'esposizione 1 come YFP (488 laser) e l'esposizione di 2 come Hoechst (laser 405). Attivare il filtro su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 telecamera 1 e 2 di esposizione alla fotocamera 2. Impostare tempi di esposizione a ~ 800 ms per esposizione 1 e ~ 40 ms per esposizione 2.
Esposizione di
7. selezionare 1. Impostare lo stato attivo altezza su 0 µm. Select " fuoco ". Una volta messo a fuoco, esporre telecamera 1. Regolare l'altezza di messa a fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e fare clic su " prendere altezza ". Modificare i tempi di esposizione e potere dare un'intensità di pixel massimi di ~ 3.000 laser. Salvare i parametri di esposizione. Ripetere per esposizione 2.
8. Selezionare " esperimento definizione " Tab. creare un layout e sublayout. Trascinare e rilasciare il relativo layout, esposizione, immagine di riferimento, skewcrop file e sublayout. Salvare l'esperimento.
9. Selezionare " automatico esperimento " scheda e acquisire immagini. Alla fine di ogni esecuzione, le immagini catturate vengono automaticamente caricate sul server.

6. Analisi di due immagini di canale dell'immagine

1. selezionare l'algoritmo software per segmentare gli oggetti primari (nuclei, cytosol e aggregati) ( Figura 7).
2. Selezionare il metodo che segmenti i nuclei con precisione mediante ispezione visiva degli oggetti segmentati. Hoechst-macchiato oggetti nel canale 1 (Ch1) verranno utilizzati per determinare il numero di celle. La macchiatura di YFP dal mutante SOD1-A4V nel canale 2 (Ch2) verrà utilizzato per determinare la quantità di aggregati.
3. Conteggio celle usando i ' trovare i nuclei ' algoritmo come Hoechst-macchiatura regioni > 20 µm ², con un fattore di divisione di 7.0, una soglia individuale di 0.40 e un contrasto > 0.10.
4. Creare la tabella dati e determinare CE ₅₀ per ciascuno dei composti utilizzando la ' regressione Non lineare ' equazione nel software grafico.

Risultati

Generazione stabile di cellula utilizzando lentivirus: Strategia globale per il monitoraggio di aggregati di proteine SOD1 è illustrata nella Figura 1. In una prima fase, abbiamo generato un vettore di espressione lentivirali per consegna stabile gene SOD1 in linee cellulari (passaggio 1). Due vettori lentivirali codifica YFP-etichetta SOD1 WT e SOD1 A4V (SOD1WT-YFP e SOD1A4V-YFP, rispettivamente) con imballaggio e busta plasmidi sono stati p...

Discussione

Ci sono due approcci principali per la generazione di linee cellulari stabili. Il primo richiede parecchie settimane e selezione di transfezione e resistenza transitoria dei vettori di DNA genomico plasmide integrato. Il secondo prende una questione di ore attraverso l'uso dei lentivirus, rendendo questo protocollo suscettibili dell'efficace espressione di proteina bersaglio in linee cellulari multiple con sforzo limitato. Il viaggio-CMV vettore¹⁹ era un vettore di sostenuta da utilizzare, con eff...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ALLN (C20H37N3O4)	Millipore	208719
MG132 (C26H41N3O5)	Sigma-Aldrich	C2211
Epoxomicin (C 28H50N4O7)	Sigma-Aldrich	E3652
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Opera EvoShell software	Perkin Elmer	Ver 1.8.1
Operetta	Perkin Elmer	OPRT1288
Software di imaging Harmony	Perkin Elmer	Ver 3.0.0
Software di analisi delle immagini Columbus	Perkin Elmer	Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell manipolazione dei liquidi	CyBio AG	OL 3387 3 0110