Sovrapressione e purificazione dell'uomo Cis -preniltransferasi in

Prenyltransferasi sono un gruppo di enzimi che catalizzano l'allungamento della catena del difosfato allilico usando isopentenil difosfato (IPP) attraverso reazioni di condensazione multiple ^{1 , 2} . Gli enzimi di tipo Z catalizzano la formazione di doppie legami cis dalla reazione di condensazione, mentre gli enzimi E-tipo catalizzano la formazione di doppio legame trans ³ . Cis -Prenyltransferases ( cis -PT, Z-type enzymes) sono classificati in modo classico in base alla loro lunghezza della catena di prodotti in catena a catena corta (C ₁₅ ), catena media (C _50-55 ) e catena lunga (C _70-120 ) ⁴ . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) è un cis -PT a lunga catena eucariotica che catalizza l'allungamento della catena di farnesil difosfato (FPP, un difosfato allilico) attraverso condensazioni multiple con isopentenil difosfato (IPP) ¹, ^{5 , 6} . Ciò si traduce nella formazione di deidrodolicilidifosfato, un polifenilcarbossilico di C _{55-100 che} serve come precursore per il dolichilpirofosfato, la molecola vettore del glicosilico coinvolto nella glicosilazione della proteina N-collegata ¹ . Tra gli ebrei di Ashkenazi, una mutazione non-conservativa missense (K42E) in DHDDS produce una retinite pigmentosa autosomica recessiva ^{7 , 8} . Pertanto, il presente protocollo è stato sviluppato per acquisire DHDDS purificati idonei per studi meccanistici.

Escherichia coli è considerato l'host più conveniente e conveniente per l'espressione di proteine ​​ricombinanti, ed è pertanto anche l'host più utilizzato. Tuttavia, quando si tenta di esercitare eterosamente le proteine ​​in E. coli , occorre fare considerazioni proteiche. Ottenere piegato correttamente, attivareE proteine ​​ricombinanti da E. coli , non è una materia semplice a causa delle proprietà distinte di diverse proteine. Numerosi approcci sono stati sviluppati per superare questi ostacoli. Qui, l'uso di fusione di proteine, condizioni di coltura ottimizzate e ottimizzazione del codone sono stati utilizzati per consentire l'eccessiva espressione e la purificazione di DHDDS umane attivamente attive in E. coli . Da notare, un precedente tentativo di sovraespressione del lievito cis -PT senza fusione di proteine ​​non è riuscito a causa della completa insolubilità anche in presenza di detersivo ¹² . Il protocollo descritto è semplice, conveniente, risparmio di tempo e consente di ottenere preparati DHDDS idonei per studi meccanici. Data l'omologia del cis- PT tra diverse specie, suggeriamo che questo protocollo possa essere applicato anche per altri cis -PT eucariotici.

1. Clonazione di cis -PT per sovraespressione in E. coli

1. Ottenere pET-32b vettore di espressione, progettata per il clonaggio e di alto livello di espressione di sequenze di proteina fusa con la 109aa tioredossina (TRX) proteina ^17, ed E. coli codone ottimizzato ¹⁸ sequenza codificante di intera lunghezza -PT cis.
2. Aver cura di avere un TEV-proteasi (tabacco virus etch proteasi) cleavage site (ENLYFQ / G, dove "/" indica il punto di scissione) ⁹ seguito da una breve linker flessibile (SGSGSG, che permettono di migliorare sito di scissione accessibilità) a monte dei cis -PT sequenza ( Figura 1 A ). Inoltre, aggiungere siti di restrizione 5 'e 3' per la clonazione.
3. Clonare il DNA costruito sintetizzato nel vettore pET-32b utilizzando tecniche standard di legatura ¹⁰ .

2. OverexpreSsion di DHDDS umani in E. coli

1. Trasformare le cellule competenti di E. coli T7 con il TRD-fusion DHDDS conforme alle istruzioni del produttore.
2. Piattare le cellule trasformate secondo le istruzioni del produttore su LB-agar in condizioni selettive di ampicillina (200 mg / L).
3. Inoculare le colonie selezionate in 100 ml di mezzo LB in colture di avviamento a fiale di 250 ml con ampicillina da 100 mg / L e incubare per una notte a 37 ° C con scossa costante a 200 giri / min.
4. Inoculare 80 ml di coltura in due fiale da 5 L (40 ml per pallone), ognuno contenente 1,5 L di mezzo 2x YT (16 g / L di tryptone, 10 g / L di estratto di lievito, 5 g / L di NaCl) con 100 mg / L ampicillina.
5. Incubare la coltura a 37 ° C con scossa costante a 180 giri / min fino a raggiungere OD _{600 nm} = 0,5.
6. Abbassare la temperatura a 16 ° C e indurre le cellule aggiungendo 0.5 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG). controIncubare in condizioni uniformi per 16-20 h per l'espressione proteica.
7. Raccogliere le cellule per centrifugazione (10.000 x g per 10 min).
   Nota: il protocollo può essere interrotto qui; Le pellicole delle cellule devono essere mantenute a -80 ° C fino alla purificazione.

3. Purificazione di DHDDS umane

1. Resuspendere le cellule nel tampone A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoetanolo), 1 μg / ml DNasi I e una miscela di inibitori della proteasi.
2. Homogenizzare le cellule utilizzando un omogeneizzatore di vetro in teflon.
3. Distruggere le cellule utilizzando un microfluidizzatore o un equivalente a 12.000 - 15.000 psi ¹¹ .
4. Centrifugare la lisi cellulare a 40.000 xg per 45 minuti a 4 ° C. Recuperare il surnatante, contenente la frazione solubile.
5. Caricare il supernatante su una colonna di cromatografia con affinità metallica immobilizzata di cobalto da 5-10 ml (Co ²⁺ -IMAC) ¹² colonna con 10MM imidazolo, seguito da un lavaggio approfondito con tampone A e 10 mM imidazolo per ridurre la legame delle proteine ​​non specifiche.
6. Eluire le proteine ​​sovrapresse con tampone A integrato con 250 mM imidazolo.
7. Rimuovere l'imidazolo usando una colonna di disintegrazione preparativa da 53 ml equilibrata con il tampone A.
8. Aggiungere proteasi TEV a 6xHis (1 mg TEV proteasi per 50 mg proteina) alle proteine ​​eluite per rimuovere la loro proteina di fusione TRX a 6xHis a 4 ° C per una notte.
9. Caricare le proteine ​​cedute su una colonna Co2 ⁺ -IMAC, equilibrata con un tampone A integrato con 5 mM imidazolo, per rimuovere la proteina fusione TRX tagliata a 6x His-contrassegnata e TEV proteasi.
10. Raccogliere il flusso e concentrarlo a 3 - 4 ml utilizzando un filtro centrifugo di taglio di peso molecolare di 30 kDa.
11. Caricare la proteina concentrata su una colonna di cromatografia di esclusione di dimensioni superdex-200 equilibrata con il tampone A per la purificazione finale. La proteina eluisce come dimero (~ 76 kDa). Selezionare le frazioni rilevanti confrontando il profilo di eluizione con una curva di calibrazione della colonna.
12. Valutare la purezza del preparato usando SDS-PAGE.
13. Determinare la concentrazione proteica necessaria per la sperimentazione a valle e le aliquote di flash-freeze di proteine ​​purificate concentrate in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino all'uso.

4. Cromatografia analitica di esclusione di dimensioni (SEC)

1. Per garantire la capacità della proteina di sopportare i cicli di congelamento e disgelo, scongelare una aliquota delle proteine ​​congelate e centrifugare a 21.000 x g per 10 minuti per rimuovere gli aggregati insolubili. Raccogliere il surnatante.
2. Caricare le proteine ​​su una colonna analitica superdex-200 pre-equilibrata con 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoetanolo utilizzando un sistema di cromatografia liquida a ultrasuoni ^{13 , 14} .
3. Monitor di triptofano fluoro(Λ _ex = 280 nm, λ _em = 350 nm) per rilevare il profilo eluente di eluizione delle proteine. Assicurarsi di avere una curva di calibrazione valida per la valutazione del peso molecolare - tali curve sono disponibili tramite i produttori di colonna SEC.

5. Kinetica enzimatica - Attività dipendente dal tempo ^{15 , 16 , 17}

1. Per garantire l'attività della proteina purificata, mescolare 5 uM di DHDDS purificati con 10 FPP pM e 50 pM ¹⁴ C-IPP per iniziare la reazione in tampone A con 0,5 mM MgCl ₂ a 22 - 30 ° C.
   Nota: le condizioni di reazione esatta possono variare con le preparazioni di cis -PTs diverse da DHDDS. Inoltre, l'attività di DHDDS dipende anche dalla temperatura e da [Mg ²⁺ ].
   Attenzione: ¹⁴ C-IPP è radioattivo e deve essere utilizzato in conformità alle normative locali in materia di sicurezza delle radiazioni. Ritirare 15 μl di campioni dalla reazione a 0, 2, 4 e 6 h, dopo la tempra immediata della reazione mediante l'aggiunta di 15 μl di tampone A integrato da 20 mM di EDTA (a una concentrazione finale di 10 mM EDTA).
2. Aggiungere 1 ml di 1-butanolo saturo di H ₂ O e vorticarsi accuratamente per estrarre i prodotti di reazione.
   Nota: il protocollo può essere fermato qui e i campioni possono essere conservati per una lettura successiva.
3. Aggiungere un cocktail di scintillazione ai campioni e, utilizzando un contatore di scintillazione, quantitate i prodotti di reazione nella fase di butanolo che comprendono ¹⁴ C, insieme alla radioattività di 15 μL dalla miscela di reazione, rappresentando la radioattività totale.
4. Sottrarre le letture di fondo misurate utilizzando i campioni di 0 h da ogni punto temporale e calcolare il percentuale di ¹⁴ C-IPP utilizzati.
5. Calcola l'incorporazione netta ^{14 di} C-IPP ad ogni punto temporale calcolando il percentuale utilizzato dal totale ¹⁴ 14 C-IPP con il tempo.

Panoramica generale del costrutto qui impiegato e del processo di purificazione sono mostrati in Figura 1 . I campioni ottenuti ad ogni passo di purificazione sono mostrati in Figura 2 . Questa analisi SDS-PAGE mostra la purificazione graduale di DHDDS, determinando un prodotto altamente purificato. La Figura 3 mostra i risultati della SEC analitica dell'enzima purificata, rivelando che la proteina è osservata solo come un omodimero. La figura 4 mostra un esemplare di attività dipendente dal tempo. 14 L' incorporazione di C-IPP sale chiaramente in 6 ore, verificando che l'enzima purificato sia funzionale.

Figura 1: Clonazione e purificazione umana DHDDS . ( B ) Descrizione del protocollo di purificazione umana DHDDS descritto qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Purificazione di DHDDS umane . Analisi SDS-PAGE di passi di purificazione affinità DHDDS umani. Lane 1, marcatore a peso molecolare (kDa); Corsia 2, estratto grezzo; Corsia 3, flusso di passaggio Co2 + -IMAC. La freccia indica la proteina di fusione TRX-DHDDS; Corsia 4, eluato Co2 + -IMAC; Cella 5, proteina-proteina TEV dopo l'incubazione di una notte; Corsia 6, Co 2+ -IMAC flusso attraverso la scissione TEV; Corsia 7, eluato Co2 + -IMAC dopo la scissione TEV; Corsia 8, DHDDS umano purificato (indicSeguito da una freccia) a seguito della cromatografia di esclusione di dimensioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: SEC analitica di DHDDS umane purificate. La fluorescenza della triptofano è stata monitorata come descritto nel protocollo. Secondo la curva di taratura di questa colonna, DHDDS forma un homodimer (77,4 kDa). La freccia indica il volume void. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : TiAttività dipendente da me DHDDS umane purificate. L' attività in vitro di DHDDS umane purificate nella reazione con 10 μM FPP e 50 μM di 14 C-IPP come substrati viene espressa come incorporazione di IPP per proteina (mol / mol). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno niente da rivelare.