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questo protocollo segue esperimenti approvati: (1) gli esseri umani dal comitato etico del Monash Medical Centre e (2) animali dal comitato etico dell'Università di Melbourne.
1. lavaggio broncoalveolare (BAL) macrofagi
- BAL di uso per ottenere i macrofagi del polmone in: (1) umani soggetti di broncoscopia 6 e (2) topi mediante aspirazione endotracheale 13 .
Nota: Acquisizione dei macrofagi causa generalmente alcuni attivazione di queste cellule. I macrofagi sono ottenuti da pazienti che richiedono una broncoscopia per indagare un potenziale problema medico e non tutti i soggetti possono essere adatti per l'analisi dei METs (questo dovrà essere determinata per ogni singolo progetto).
- Prendere la soluzione BAL e spin-down (500 x g per 10 min) per formare una pallina, lavare due volte con terreno di coltura (Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) con 5% di siero fetale di vitello e 1% L-Glutammina) a temperatura ambiente e poi diluire le cellule in 4 mL di cultura medi um.
- Se necessario, richiedere una formale conteggio differenziale; la maggior parte delle cellule (generalmente > 80%) sarà macrofagi 6.
Nota: Questo in genere viene eseguito da un servizio di istologia clinica utilizzando l'aspetto morfologico delle cellule differenti tipi 6.
- Eseguire una cellula macrofagica praticabile contare sulla soluzione BAL utilizzando esclusione in Trypan blue e un emocitometro.
Nota: Soluzione di BAL è ottenuta dagli esseri umani e topi come indicato al punto 1.1.
- Add 1-4 x 10 5 macrofagi a 24 pozzetti sulle lamelle in 500 µ l di terreno di coltura per bene e lasciare tutta la notte a 37 ° C; le cellule si atterranno alle lamelle. Per campioni umani, aggiungere antibiotici (ad es., penicillina e streptomicina, 10 4 U/mL) per prevenire la contaminazione batterica.
2. Etichettatura/microscopia di immunofluorescenza dei macrofagi BAL
Nota: cellule siano rispettate su vetrini coprioggetti, come accennato in precedenza.
- Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS). Difficoltà cellule nel fissativo di paraformaldeide/periodato/lisina (PLP) del 2% per un minimo di 10
- Lavare le cellule brevemente in PBS e quindi permeabilize in 0,2% Tween 20 in PBS per 20 min.
- Cellule di blocco con i sieri di pollo 10% a 5% albumina di siero bovino (BSA) diluito in PBS per 30 min.
Gli anticorpi - incubare con controllo primario e isotype per 1 h a temperatura ambiente a concentrazioni di 1: 100 (dettagli più specifici sono elencati in Tabella materiali) a 37 ° C.
Nota: Per i campioni di BAL, un marcatore specifico di macrofagi di solito non è necessario.
- Dopo l'aggiunta di anticorpi primari, lavare le cellule in PBS e incubare ulteriormente con i corrispondenti anticorpi secondari per 40 min a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni nel PBS e montare con il mezzo di montaggio a base DAPI per visualizzazione utilizzando un microscopio confocale (come detto sopra) al laser eccitazioni 405, 488, 561 e 647 nm e 40 X, 1,0 NA olio obiettivo.
3. Campioni di tessuto polmonare
Nota: per studi in vivo del tessuto polmonare, studiare i campioni dopo l'esposizione pertinente (ad es., come descritto da O ' Sullivan et al. 7). l'esposizione più pertinente per questo esperimento sono microrganismi infettivi, soprattutto batteri. Diversi ceppi di topi che potrebbero essere utilizzati per questo metodo sono topi C57BL/6 o BALB/c, 10-12 settimane di età, peso 25-30 g e uomo.
- Euthanize topi, tramite un'iniezione intraperitoneale di ketamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Aprire la cavità toracica ed esporre i polmoni e il cuore utilizzando forbici e pinze chirurgiche.
- Infondere PBS caldo usando un ago da 21 gauge nel ventricolo destro per lavare il sangue dai vasi per 30 s, poi infondere 10 mL di fissativo PLP di 2% per 30 s (nel ventricolo destro).
- Utilizzare calda PBS (42 ° C) per il lavaggio della cavità toracica aperta. Intubare la trachea con un ago da 21 gauge e un pezzo di tubo di 0,8 mm tagliato a misura e iniettare 800 µ l di pre-riscaldato (a 42 ° C), basso punto di fusione punto soluzione di agarosio 3%.
- Cravatta fuori la trachea con seta intrecciato (4.0 USP). Mettere il filo intorno alla trachea, appena sotto il punto di inserimento della cannula e fissarlo tramite un semplice nodo alla marinara. Per solidificare l'agarosio, amministrare ghiacciata PBS intorno ai polmoni. Rimuovere i polmoni e il cuore come un blocco dalla cavità toracica mediante dissezione smussa e forbici. Rimuovere ciascun polmone individualmente e quindi correggerli per 16 h a 2% PLP o formalina al 4 ° C.
- Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino al tessuto di sezionamento. Questi metodi per ottenere il tessuto del polmone sono stati descritti in precedenza 13.
- Per preparare il tessuto polmonare campioni attenersi alla seguente procedura.
- Fix del tessuto polmonare tessuti (resecati in fase 3.1) in 10% formalina tamponata naturale per 24 h a temperatura ambiente. Trasferimento al 75% di etanolo e messo in un processatore di tessuti su un ciclo di 12 h, (2,5 h in 75% EtOH, 3h in EtOH assoluto, 3,5 h in solvente 3B e per 3 h in paraffina).
- Embed in paraffina standard per creare formalina-fisse, paraffina-incastonato blocchi (FFPE) che sono immagazzinati a temperatura ambiente.
Nota: In questa fase, è generalmente opportuno tagliare le sezioni di polmone per diapositive standard.
- Tagliare le sezioni di polmone FFPE alle 4-5 µm spessore utilizzando un microtomo e montare sulla carica, come precedentemente descritti da O rivestito di diapositive ' Sullivan et al. 7
- per montare diapositive, mettere 3 gocce di mezzo di montaggio sulle lamelle 60 x 24 mm (misura 1,5), invertire la diapositiva il coprivetrino e spingere fuori l'eccesso del prodotto. Ermeticamente sigillare con smalto e conservare a temperatura ambiente.
4. Preparazione/microscopia dei campioni di tessuto polmonare
- de-cera, reidratare e pretrattare il campione di tessuto FFPE polmonare con soluzione di smascheramento dell'antigene.
- Forno asciutto il FFPE diapositive per 60 min a 60 ° C. Poi mettere i vetrini nella soluzione di xilene per 30 min e trasferimento alla soluzione di etanolo 70% per 5 min a temperatura ambiente. Risciacquo in acqua di rubinetto.
- Posto in involucro di plastica resistente al calore e soggetti a recupero HIER-antigene in una pentola a pressione per 10 min a 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Raffreddare per 20 min. lavare due volte in acqua corrente per 5 minuti su un agitatore meccanico, poi una volta con PBS su rocker.
- Blocco con siero di pollo 10% a 5% BSA/PBS per 30 min a temperatura ambiente.
- Macchiare il tessuto.
- Per definire METs in macrofagi, aggiungere gli anticorpi primari (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 1% BSA/PBS per 16 h a 4 ° C a diluizione 1/100 (informazioni dettagliate sulla quantità di anticorpo sono elencati in Tabella materiali). Lavare due volte con PBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.
Anticorpi di - raggiungere rilevazione fluorescente tramite incubazione con secondario corrispondente in 1% BSA/PBS per 40 min a temperatura ambiente. Gli anticorpi sono: (1) pollo anti-mouse 488 (verde), anti-capra pollo (2) 594 (rosso) e (3) asino anti-mouse (lontano rosso) 647.
- Lavare le sezioni in PBS e montaggio con DAPI-contenente di mezzo di montaggio per la macchiatura della cromatina.
- Ottenere immagini fluorescenti utilizzando un laser confocale scansione testa collegata ad un microscopio invertito.
Laser:
- Excite la preparazione con 405, 488, 561 e 647 nm. Catturare immagini a 512 x 512 pixel singolo aereo facendo clic sulla linea-sequenziale, livellamento button (2 in linea media) utilizzando 20 X 0,1 NA aria e 40 X 1.0 NA olio obiettivi.
- Ottenere almeno dieci campi di vista per profilato per analisi e dati per ogni risultato (vale a dire, 10 campi di vista ad alta potenza (HFOV) per il controllo, 10 per il campione stimolato, ecc., per ogni mouse).
Nota: Per ottenere un campione rappresentativo di tutto il campo, può essere utilizzato un sistema a matrice in cui il campo è diviso in diverse sezioni per ogni campione diversi la stessa matrice viene utilizzata per selezionare i campi di vista (ad esempio, il campo può essere diviso in 9 sezioni, e dal centro e 4 angoli, sono presi due HFOV).
5. Tridimensionale (3D) Imaging di METs
Nota: come METs sono strutture 3-d, prendendo più z-stack di immagini, che vengono ricostituiti, possono dare informazioni preziose.
- Sezione gli esemplari del polmone da blocchetti di paraffina, a 200 µm usando una vibratome ad un'ampiezza impostata a 1,8 mm e velocità di 0,1-0,5 mm/s.
- Bloccare tessuto polmonare con il 20% del rispettivo siero (10% di siero fetale di vitello e pollo 10% siero) e poi permeabilize in PBS completati e al 3,75% Triton-X100 per 7 h a temperatura ambiente sotto agitazione delicata.
- Macchia le sezioni per 16 h a 4 ° C con gli anticorpi primari pertinenti (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 200 volumi di µ l in microcentrifuga (concentrazioni anticorpali sono elencate in Tabella materiali).
- Lavare le sezioni in PBS, 3 volte per 10 min prima incubazione con gli anticorpi secondari pertinenti a temperatura ambiente per 1 h.
- Macchia le sezioni del polmone per DAPI (1:5, 000) in soluzione per 20 minuti, prima di aggiungere i vetrini al microscopio le diapositive in PBS.
- Ottenere immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio confocale invertito (40 x 1.3 NA) dotato di 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm e 635 nm laser.
- Registrare 3D z-pile di 0,54 µm spessore con z-sezionamento ottimo per l'obiettivo di olio NA 40 x 1.3.
Nota: Il software utilizzato variano a seconda il microscopio individuo. Un esempio di come il software può essere utilizzato per uno microscopio viene fornito in File supplementari 1.
6. Analisi dell'immagine
Nota: l'analisi dei campioni richiede l'utilizzo di specifici software di analisi di imaging ed esempi sono elencati nella Tabella materiali. Mentre l'analisi dei risultati dipenderà il programma specifico utilizzato, i punti elencati qui sotto sono importanti.
- Campioni di analisi di BAL
- definire il numero di macrofagi selezionando il canale blu per DAPI e assegnando una dimensione minima per le celle (ad es., > 18 µm di diametro). Misurare con il relativo software, il numero totale dei macrofagi per ogni campo.
- Contare il numero di cellule che hanno le caratteristiche di un MET dalla presenza di cromatina extracellulare rilevata da DAPI con co-espressione di altri marcatori (ad es., MMP12, PAD2 e H3Cit).
Nota: Il numero di marcatori che possono essere analizzati dipende dal numero di laser disponibili, ma idealmente oltre DAPI, almeno due altri indicatori dovrebbero essere inclusi. Altri meno parametri specifici per espressione di MET (ad es., numero di cellule con cromatina extracellulare e un nucleo allargato) può essere utilizzato.
- Per confrontare l'espressione di MET in BAL campioni (tra il controllo, fumo e fumo/dnasi trattata gruppi), analizzare un minimo di 100 macrofagi BAL per esempio.
- Per misurare anticorpo secondario e isotype controllare i livelli di fluorescenza; misurare un minimo di 100 cellule in ogni campione per loro fluorescenza. Misurare il livello medio di fluorescenza di fondo per ogni indicatore (ad esempio, H3Cit) utilizzando software standard.
- Per definire l'espressione di MET, contare le cellule con il fenotipo tipico (ad es., cromatina extracellulare con co-espressione di H3Cit e MMP9) e per ogni MET, misurare il livello di fluorescenza degli indicatori (ad es., H3Cit e MMP9). Escludere le cellule che producono METs se loro colorazione non era sopra controllo di sfondo e isotype.
- Per campioni umani di BAL, analizzare un minimo di 100 celle per ogni campione per la percentuale dei macrofagi che rendono METs. Per esempi di murini, come le cellule sono più piccole e METs sono più difficili da definire, analizzare un numero maggiore di celle per ogni campione (ad es., 200 macrofagi).
- Analisi dei campioni di tessuto polmonare
- per determinare la presenza di METs nel tessuto polmonare, utilizzare indicatore specifico del macrofago come F4/80.
- Definire la presenza di METs nel tessuto polmonare utilizzando la co-localizzazione di F4/80 in cellule che esprimono extracellulare della cromatina con altri parametri, come indicato nella sezione 6.1.
- Determinare i livelli di fluorescenza di fondo nei campioni con anticorpo secondario e i controlli di isotipo. METs di escludere dall'analisi che non sono sopra sfondo.