Trappole extracellulari del macrofago sono un'entità recentemente descritta. In questo articolo si concentrerà sui metodi di microscopia confocale e come essi sono visualizzati in vitro e in vivo da campioni del polmone.
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Articolo metodologico
Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un metodo primario impiegato per definire la presenza di trappole extracellulari del neutrofilo (reti) è la microscopia confocale. Abbiamo modificato i metodi di microscopia confocale stabilito per visualizzare trappole extracellulari del macrofago (METs). Queste trappole extracellulari sono definite dalla presenza di cromatina extracellulare con co-espressione di altri componenti quali le proteasi del granello, citrullinato istoni e peptidilico arginasi deiminasi (PAD). L'espressione di METs è generalmente misurata dopo l'esposizione ad uno stimolo e confrontato ai campioni non-stimolati. I campioni inoltre sono inclusi per controllo di sfondo e isotype. Le cellule sono analizzate utilizzando software di analisi di immagine ben definita. Microscopia confocale può essere utilizzata per definire la presenza di METs sia in vitro che in vivo nel tessuto polmonare.
Introduzione
Trappole extracellulari del neutrofilo (reti), furono descritti per la prima volta da Brinkmann et al. 1 essi sono principalmente prodotte in risposta all'infezione (soprattutto ai batteri) e hanno un ruolo importante nella difesa ospite1,2. Sono stati descritti anche per verificarsi in risposta a malattie non infettive, compreso vasculitis ed eritematoso di lupus sistematico (SLE); e al mitogene phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente è stato riconosciuto che altri tipi delle cellule possono anche produrre trappole extracellulari, tra cui i macrofagi. Trappole extracellulari del macrofago (METs) non sono ancora un'entità ben definita in letteratura4,5. Recentemente abbiamo stabilito i metodi per rilevare la presenza di METs sia in vitro che in vivo6,7. In questo articolo, descriveremo la misurazione dei METs usando la microscopia confocal.
Caratteristiche principali di NETosis che lo distinguono dalle altre vie cellulari (ad esempio apoptosi8) sono l'estrusione della cromatina in collaborazione con: (1) citrullination di istoni (H3Cit)9, (2) co-espressione delle proteasi granello10 e (3) coinvolgimento del peptidil arginina deiminasi (PAD) 411,12. I macrofagi esprimono anche H3Cit, proteasi granello e PAD, e queste caratteristiche possono essere utilizzate per definire la presenza dei METs.
METs può avere un ruolo particolarmente importante nel polmone, come il macrofago è la cella dominante presente nelle vie aeree del polmone e gli alveoli e ha il ruolo iniziale nel dirigere la risposta immunitaria cellulare all'infezione/infiammazione. Inoltre, mentre gran parte del polmone è spazio vuoto (per esempio, all'interno di alveoli), i METs sono potenzialmente in grado di espandersi nello spazio disponibile, in contrasto con gli organi solidi.
Il metodo più utilizzato per definire la presenza di reti è mediante microscopia confocale. Non c'è ancora un modo chiaramente definito per misurare METs. La tecnica per la misurazione delle reti è stata adattata per misurare la presenza dei METs in questo protocollo. I requisiti principali per questo metodo sono accesso alla microscopia confocale e appropriato software di imaging per l'analisi.
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Protocollo
questo protocollo segue esperimenti approvati: (1) gli esseri umani dal comitato etico del Monash Medical Centre e (2) animali dal comitato etico dell'Università di Melbourne.
1. lavaggio broncoalveolare (BAL) macrofagi
- BAL di uso per ottenere i macrofagi del polmone in: (1) umani soggetti di broncoscopia 6 e (2) topi mediante aspirazione endotracheale 13 .
Nota: Acquisizione dei macrofagi causa generalmente alcuni attivazione di queste cellule. I macrofagi sono ottenuti da pazienti che richiedono una broncoscopia per indagare un potenziale problema medico e non tutti i soggetti possono essere adatti per l'analisi dei METs (questo dovrà essere determinata per ogni singolo progetto).- Prendere la soluzione BAL e spin-down (500 x g per 10 min) per formare una pallina, lavare due volte con terreno di coltura (Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) con 5% di siero fetale di vitello e 1% L-Glutammina) a temperatura ambiente e poi diluire le cellule in 4 mL di cultura medi um.
- Se necessario, richiedere una formale conteggio differenziale; la maggior parte delle cellule (generalmente > 80%) sarà macrofagi 6.
Nota: Questo in genere viene eseguito da un servizio di istologia clinica utilizzando l'aspetto morfologico delle cellule differenti tipi 6. - Eseguire una cellula macrofagica praticabile contare sulla soluzione BAL utilizzando esclusione in Trypan blue e un emocitometro.
Nota: Soluzione di BAL è ottenuta dagli esseri umani e topi come indicato al punto 1.1. - Add 1-4 x 10 5 macrofagi a 24 pozzetti sulle lamelle in 500 µ l di terreno di coltura per bene e lasciare tutta la notte a 37 ° C; le cellule si atterranno alle lamelle. Per campioni umani, aggiungere antibiotici (ad es., penicillina e streptomicina, 10 4 U/mL) per prevenire la contaminazione batterica.
2. Etichettatura/microscopia di immunofluorescenza dei macrofagi BAL
Nota: cellule siano rispettate su vetrini coprioggetti, come accennato in precedenza.
- Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS). Difficoltà cellule nel fissativo di paraformaldeide/periodato/lisina (PLP) del 2% per un minimo di 10
- Lavare le cellule brevemente in PBS e quindi permeabilize in 0,2% Tween 20 in PBS per 20 min.
- Cellule di blocco con i sieri di pollo 10% a 5% albumina di siero bovino (BSA) diluito in PBS per 30 min. Gli anticorpi
- incubare con controllo primario e isotype per 1 h a temperatura ambiente a concentrazioni di 1: 100 (dettagli più specifici sono elencati in Tabella materiali) a 37 ° C.
Nota: Per i campioni di BAL, un marcatore specifico di macrofagi di solito non è necessario. - Dopo l'aggiunta di anticorpi primari, lavare le cellule in PBS e incubare ulteriormente con i corrispondenti anticorpi secondari per 40 min a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni nel PBS e montare con il mezzo di montaggio a base DAPI per visualizzazione utilizzando un microscopio confocale (come detto sopra) al laser eccitazioni 405, 488, 561 e 647 nm e 40 X, 1,0 NA olio obiettivo.
3. Campioni di tessuto polmonare
Nota: per studi in vivo del tessuto polmonare, studiare i campioni dopo l'esposizione pertinente (ad es., come descritto da O ' Sullivan et al. 7). l'esposizione più pertinente per questo esperimento sono microrganismi infettivi, soprattutto batteri. Diversi ceppi di topi che potrebbero essere utilizzati per questo metodo sono topi C57BL/6 o BALB/c, 10-12 settimane di età, peso 25-30 g e uomo.
- Euthanize topi, tramite un'iniezione intraperitoneale di ketamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Aprire la cavità toracica ed esporre i polmoni e il cuore utilizzando forbici e pinze chirurgiche.
- Infondere PBS caldo usando un ago da 21 gauge nel ventricolo destro per lavare il sangue dai vasi per 30 s, poi infondere 10 mL di fissativo PLP di 2% per 30 s (nel ventricolo destro).
- Utilizzare calda PBS (42 ° C) per il lavaggio della cavità toracica aperta. Intubare la trachea con un ago da 21 gauge e un pezzo di tubo di 0,8 mm tagliato a misura e iniettare 800 µ l di pre-riscaldato (a 42 ° C), basso punto di fusione punto soluzione di agarosio 3%.
- Cravatta fuori la trachea con seta intrecciato (4.0 USP). Mettere il filo intorno alla trachea, appena sotto il punto di inserimento della cannula e fissarlo tramite un semplice nodo alla marinara. Per solidificare l'agarosio, amministrare ghiacciata PBS intorno ai polmoni. Rimuovere i polmoni e il cuore come un blocco dalla cavità toracica mediante dissezione smussa e forbici. Rimuovere ciascun polmone individualmente e quindi correggerli per 16 h a 2% PLP o formalina al 4 ° C.
- Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino al tessuto di sezionamento. Questi metodi per ottenere il tessuto del polmone sono stati descritti in precedenza 13.
- Per preparare il tessuto polmonare campioni attenersi alla seguente procedura.
- Fix del tessuto polmonare tessuti (resecati in fase 3.1) in 10% formalina tamponata naturale per 24 h a temperatura ambiente. Trasferimento al 75% di etanolo e messo in un processatore di tessuti su un ciclo di 12 h, (2,5 h in 75% EtOH, 3h in EtOH assoluto, 3,5 h in solvente 3B e per 3 h in paraffina).
- Embed in paraffina standard per creare formalina-fisse, paraffina-incastonato blocchi (FFPE) che sono immagazzinati a temperatura ambiente.
Nota: In questa fase, è generalmente opportuno tagliare le sezioni di polmone per diapositive standard. - Tagliare le sezioni di polmone FFPE alle 4-5 µm spessore utilizzando un microtomo e montare sulla carica, come precedentemente descritti da O rivestito di diapositive ' Sullivan et al. 7
- per montare diapositive, mettere 3 gocce di mezzo di montaggio sulle lamelle 60 x 24 mm (misura 1,5), invertire la diapositiva il coprivetrino e spingere fuori l'eccesso del prodotto. Ermeticamente sigillare con smalto e conservare a temperatura ambiente.
4. Preparazione/microscopia dei campioni di tessuto polmonare
- de-cera, reidratare e pretrattare il campione di tessuto FFPE polmonare con soluzione di smascheramento dell'antigene.
- Forno asciutto il FFPE diapositive per 60 min a 60 ° C. Poi mettere i vetrini nella soluzione di xilene per 30 min e trasferimento alla soluzione di etanolo 70% per 5 min a temperatura ambiente. Risciacquo in acqua di rubinetto.
- Posto in involucro di plastica resistente al calore e soggetti a recupero HIER-antigene in una pentola a pressione per 10 min a 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0. Raffreddare per 20 min. lavare due volte in acqua corrente per 5 minuti su un agitatore meccanico, poi una volta con PBS su rocker.
- Blocco con siero di pollo 10% a 5% BSA/PBS per 30 min a temperatura ambiente.
- Macchiare il tessuto.
- Per definire METs in macrofagi, aggiungere gli anticorpi primari (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 1% BSA/PBS per 16 h a 4 ° C a diluizione 1/100 (informazioni dettagliate sulla quantità di anticorpo sono elencati in Tabella materiali). Lavare due volte con PBS per 5 minuti su un agitatore meccanico. Anticorpi di
- raggiungere rilevazione fluorescente tramite incubazione con secondario corrispondente in 1% BSA/PBS per 40 min a temperatura ambiente. Gli anticorpi sono: (1) pollo anti-mouse 488 (verde), anti-capra pollo (2) 594 (rosso) e (3) asino anti-mouse (lontano rosso) 647.
- Lavare le sezioni in PBS e montaggio con DAPI-contenente di mezzo di montaggio per la macchiatura della cromatina.
- Ottenere immagini fluorescenti utilizzando un laser confocale scansione testa collegata ad un microscopio invertito.
Laser:
- Excite la preparazione con 405, 488, 561 e 647 nm. Catturare immagini a 512 x 512 pixel singolo aereo facendo clic sulla linea-sequenziale, livellamento button (2 in linea media) utilizzando 20 X 0,1 NA aria e 40 X 1.0 NA olio obiettivi.
- Ottenere almeno dieci campi di vista per profilato per analisi e dati per ogni risultato (vale a dire, 10 campi di vista ad alta potenza (HFOV) per il controllo, 10 per il campione stimolato, ecc., per ogni mouse).
Nota: Per ottenere un campione rappresentativo di tutto il campo, può essere utilizzato un sistema a matrice in cui il campo è diviso in diverse sezioni per ogni campione diversi la stessa matrice viene utilizzata per selezionare i campi di vista (ad esempio, il campo può essere diviso in 9 sezioni, e dal centro e 4 angoli, sono presi due HFOV).
5. Tridimensionale (3D) Imaging di METs
Nota: come METs sono strutture 3-d, prendendo più z-stack di immagini, che vengono ricostituiti, possono dare informazioni preziose.
- Sezione gli esemplari del polmone da blocchetti di paraffina, a 200 µm usando una vibratome ad un'ampiezza impostata a 1,8 mm e velocità di 0,1-0,5 mm/s.
- Bloccare tessuto polmonare con il 20% del rispettivo siero (10% di siero fetale di vitello e pollo 10% siero) e poi permeabilize in PBS completati e al 3,75% Triton-X100 per 7 h a temperatura ambiente sotto agitazione delicata.
- Macchia le sezioni per 16 h a 4 ° C con gli anticorpi primari pertinenti (MMP-9, H3Cit e F4/80) in 200 volumi di µ l in microcentrifuga (concentrazioni anticorpali sono elencate in Tabella materiali).
- Lavare le sezioni in PBS, 3 volte per 10 min prima incubazione con gli anticorpi secondari pertinenti a temperatura ambiente per 1 h.
- Macchia le sezioni del polmone per DAPI (1:5, 000) in soluzione per 20 minuti, prima di aggiungere i vetrini al microscopio le diapositive in PBS.
- Ottenere immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio confocale invertito (40 x 1.3 NA) dotato di 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm e 635 nm laser.
- Registrare 3D z-pile di 0,54 µm spessore con z-sezionamento ottimo per l'obiettivo di olio NA 40 x 1.3.
Nota: Il software utilizzato variano a seconda il microscopio individuo. Un esempio di come il software può essere utilizzato per uno microscopio viene fornito in File supplementari 1.
6. Analisi dell'immagine
Nota: l'analisi dei campioni richiede l'utilizzo di specifici software di analisi di imaging ed esempi sono elencati nella Tabella materiali. Mentre l'analisi dei risultati dipenderà il programma specifico utilizzato, i punti elencati qui sotto sono importanti.
- Campioni di analisi di BAL
- definire il numero di macrofagi selezionando il canale blu per DAPI e assegnando una dimensione minima per le celle (ad es., > 18 µm di diametro). Misurare con il relativo software, il numero totale dei macrofagi per ogni campo.
- Contare il numero di cellule che hanno le caratteristiche di un MET dalla presenza di cromatina extracellulare rilevata da DAPI con co-espressione di altri marcatori (ad es., MMP12, PAD2 e H3Cit).
Nota: Il numero di marcatori che possono essere analizzati dipende dal numero di laser disponibili, ma idealmente oltre DAPI, almeno due altri indicatori dovrebbero essere inclusi. Altri meno parametri specifici per espressione di MET (ad es., numero di cellule con cromatina extracellulare e un nucleo allargato) può essere utilizzato. - Per confrontare l'espressione di MET in BAL campioni (tra il controllo, fumo e fumo/dnasi trattata gruppi), analizzare un minimo di 100 macrofagi BAL per esempio.
- Per misurare anticorpo secondario e isotype controllare i livelli di fluorescenza; misurare un minimo di 100 cellule in ogni campione per loro fluorescenza. Misurare il livello medio di fluorescenza di fondo per ogni indicatore (ad esempio, H3Cit) utilizzando software standard.
- Per definire l'espressione di MET, contare le cellule con il fenotipo tipico (ad es., cromatina extracellulare con co-espressione di H3Cit e MMP9) e per ogni MET, misurare il livello di fluorescenza degli indicatori (ad es., H3Cit e MMP9). Escludere le cellule che producono METs se loro colorazione non era sopra controllo di sfondo e isotype.
- Per campioni umani di BAL, analizzare un minimo di 100 celle per ogni campione per la percentuale dei macrofagi che rendono METs. Per esempi di murini, come le cellule sono più piccole e METs sono più difficili da definire, analizzare un numero maggiore di celle per ogni campione (ad es., 200 macrofagi).
- Analisi dei campioni di tessuto polmonare
- per determinare la presenza di METs nel tessuto polmonare, utilizzare indicatore specifico del macrofago come F4/80.
- Definire la presenza di METs nel tessuto polmonare utilizzando la co-localizzazione di F4/80 in cellule che esprimono extracellulare della cromatina con altri parametri, come indicato nella sezione 6.1.
- Determinare i livelli di fluorescenza di fondo nei campioni con anticorpo secondario e i controlli di isotipo. METs di escludere dall'analisi che non sono sopra sfondo.
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Risultati
METs può essere visualizzato da campioni BAL, nel tessuto polmonare e nelle sezioni più spesse del polmone con immagini 3D. Nella Figura 1è riportato un esempio di METs visualizzati in un campione di BAL. La morfologia dei METs varierà secondo la loro fase di maturazione. La prima caratteristica rilevabile su microscopia è il movimento del nucleo al bordo della cella. Questa è seguita da extracellulare della cromatina con altri mediatori co-espressi, quali le...
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Discussione
Il metodo descritto in questa recensione è basato su quello utilizzato per definire la presenza di reti14. I macrofagi sono di gran lunga il tipo di cella dominante in campioni BAL e questo metodo di raccolta è particolarmente adatto per lo studio di METs. Se i globuli rossi sono presenti nel BAL, queste cellule dovrebbero essere lisate utilizzando cloruro di ammonio. La procedura di BAL generalmente attiva i macrofagi e pertanto si prevede che ci saranno METs presenti in campioni non-stimolati. I...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative per rendere in relazione a questo lavoro.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal Monash University, National Health Medical Research Council e del polmone Monash e sonno Institute. Gli autori vorrei ringraziare lo staff di immunologia clinica presso Monash salute, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo di Monash Micro Imaging (MMI) per aiuto con la formazione immagine di microscopia confocale, e gli autori riconoscono le strutture MMI della Monash University. Gli autori riconoscono le strutture e assistenza scientifica e tecnica della piattaforma istologia Monash.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Campioni umani: Anticorpi primari | |||
| Rabbit anti-human H3Cit (Citrullina R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Rabbit anti-human MMP12 | Novus Biological | NB110-57214 | :100 concentrazione non quantificabile |
| Topo anti-umano MMP9 | Novus Biological | AB119906 | ascite 1:200, nessuna concentrazione dato |
| Coniglio anti-umano PADI2/PAD2 | Abcam | AB16478 | 7 ug/ml |
| Topo anti-umano PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10.1 ug/ml |
| Pecora anti-umano NE | LifeSpan Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Campioni di topi: Anticorpi primari | |||
| Anti-topo di capra MMP9 | Abcam | AF909 | 10 ug/ml |
| Anti-topo di coniglio H3Cit (Citrullina R26) | Abcam | AB5103 | 10 ug/ml |
| Anti-topo di ratto F4/80 | In-house (ibridoma) | In-house | 20 ug/ml |
| Pecora anti-umano Anti-HNE /NE | Sapphire Bioscience | LS-B4244 | 25 ug/ml |
| Topo anti-umano &timido; &timido; &timido; &timido; PADI4/PAD4 | Abcam | AB128086 | 10,1 ug/ml |
| Vetrini Super-frost plus | Menzel | S41104A | |
| Dapi-prolong gold | Sonde molecolari | P36931 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 85111 | |
| Cloruro di ammonio | Sigma-Aldrich | E9434 | |
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Anticorpi secondari | |||
| Pollo anti-coniglio AF 488/ | Life technologies | A-21441 | |
| Pollo anti-coniglio AF 594 | Life technologies | A-21442 | |
| Pollo anti-capra AF 594 | Life tecnologie | a-21468 | |
| Pollo anti-topo AF488 | Tecnologie di vita | A-21200 | |
| Asino anti-pecora AF 594 | Tecnologie di vita | A-11018 | |
| Pollo anti-topo AF 647 | Tecnologie di vita | A-21463 | |
| Asino anti-pecora AF 594 | Tecnologie di vita | A-11016 | |
| Controllo isotipico | |||
| IgG di coniglio | IgG domestiche | ||
| coniglio IgG | domestiche | ||
| IgG di topo 550878 | |||
| Bioscience IgG di coniglio IgG | domestiche | ||
| IgG2a | BioLegend | 400201 | |
| IgG di pecora IgG | domestiche | ||
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Software Programs | |||
| Imaris | Bitplane | ||
| Image J | NIH | ||
| Per l'intensità media dei fluorfori è possibile utilizzare un'applicazione per ufficio standard come Microsoft Excel | |||
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Microscopi | |||
| C1 Microscopio a scansione confocale | Nikon | ||
| FV1200 Microscopio a scansione confocale | Olympus | ||
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Fonti tissutali | |||
| Campioni di BAL umano dalla suite di broncoscopia del Monash Medical Center | |||
| Campioni di BAL di topo e tessuto polmonare dal Dipartimento di Farmacologia dell'Università di Melbourne. | |||
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Media | |||
| RPMI | Sigma-Aldrich | r8758 | |
| Siero fetale di vitello | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| L-glutammina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Nome | Azienda | >Numero di catalogo | Comments |
| Altri reagenti | |||
| Sudan black | Sigma-Aldrich | 199664 | |
| fissativo paraformaldeide/periodato/lisina (PLP) | Sigma-Aldrich | 27387 | |
| Xilene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ketamina | Sigma-Aldrich | K2753 | |
| Formalina naturale | Sigma-Aldrich | 42904 | |
| Paraffina | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A2576 | |
| Solvente 3B | Hi-Chem | 2026 | |
| Vetrini coprioggetti 12 ml | Sigma-Aldrich | S1815 | |
| Vetrini coprioggetti 60 x 24 ml | Sigma-Aldrich | C6875 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Mice | |||
| c57 nero 6 | Monash piattaforma di ricerca animale (MARP) | ||
| BALB/c | MARP |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
