Method Article

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

DOI:

10.3791/56474

⸱

November 15th, 2017

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1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono stati compiuti molti progressi eccezionali in spettrometria di massa (MS)-base di proteomica, con il progresso tecnico particolare in cromatografia liquida (LC) accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e capacità di multiplexing etichettatura isobarica. Qui, presentiamo un protocollo di analisi profonda-proteomica che combina i tag massa tandem 10-plex (TMT) etichettatura con un'ampia piattaforma di LC/LC-MS/MS e correzione post-MS computazionale interferenze per quantificare con precisione i proteomi tutto. Questo protocollo comprende le seguenti fasi: estrazione di proteine e digestione, TMT etichettatura, 2-dimensionale (2D) LC, spettrometria di massa ad alta risoluzione e computazionale di elaborazione dei dati. Procedura di controllo qualità è inclusa per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Più di 10.000 proteine in campioni di mammiferi possono essere quantificati con fiducia con questo protocollo. Questo protocollo può essere applicato anche per la quantificazione delle modifiche post traduzionale con modifiche minori. Questo metodo multiplex, robusto fornisce un potente strumento per analisi di proteomica in una varietà di campioni complessi, tra cui la coltura delle cellule, tessuti animali e umani campioni clinici.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli avanzamenti nella tecnologia di sequenziamento di nuova generazione hanno portato ad un nuovo paesaggio per lo studio di sistemi biologici e malattia umana. Questo ha permesso un gran numero di misurazioni del genoma, trascrittoma, proteoma, metaboloma e altri sistemi molecolari a diventare tangibili. Spettrometria di massa (MS) è uno dei metodi più sensibili in chimica analitica, e la sua applicazione in proteomica ha rapidamente ampliato dopo il sequenziamento del genoma umano. Nel campo della proteomica, da alcuni anni hanno prodotto importanti progressi tecnici nella basata su MS-analisi quantitative, tra cui isobarica etichettatura e multiplexing capacità combinata con cromatografia liquida estesa, oltre alla strumentazione avanza, consentendo più veloce, più accurate misurazioni con meno materiale di campione richiesto. Proteomica quantitativa è diventati un approccio tradizionale per la profilatura di decine di migliaia di proteine e modifiche di posttranslational in campioni biologici altamente complessi1,2,3,4 , 5 , 6.

Metodi d'etichettatura isobariche multiplex ad esempio tag Isobarico per quantificazione relativa e assoluta (cioè, iTRAQ) e tag di massa tandem (TMT) MS hanno notevolmente migliorato la produttività del campione e aumentato il numero di campioni che possono essere analizzati in un unico esperimento1,6,7,8. Insieme con altri metodi di quantificazione basati su MS, come quantificazione privo di etichetta ed etichettatura con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (cioè, SILAC), il potenziale di queste tecniche nella proteomica dell'isotopo stabile campo è notevole9 ,10,11. Ad esempio, il metodo TMT permette 10 campioni di proteine da analizzare insieme in 1 esperimento utilizzando reagenti 10-plex. Questi tag TMT strutturalmente identici hanno la stessa massa complessiva, ma isotopi pesanti differenzialmente sono distribuiti su atomi di carbonio o azoto, risultante in un ione unico reporter durante frammentazione MS/MS di ogni tag, consentendo pertanto una quantificazione relativa tra i 10 campioni. La strategia TMT è ordinariamente applicata per studiare vie biologiche, progressione di malattia e di processi cellulari12,13,14.

Notevoli miglioramenti tecnici sono migliorati sistemi di cromatografia liquida (LC)-MS/MS, sia in termini di LC separazioni e parametri di MS, per massimizzare l'identificazione della proteina senza sacrificare la precisione di quantificazione. Prima dimensione separazione dei peptidi mediante una tecnica di separazione con alta ortogonalità per la seconda dimensione è fondamentale in questo tipo di metodo di proteomica di fucile da caccia per ottenere i massimi risultati20. Cromatografia liquida a fase inversa ad alta pH (RPLC) offre prestazioni migliori rispetto a convenzionali scambio cationico forte cromatografia20. Quando alto pH RPLC è combinata con una seconda dimensione di basso pH RPLC, sia analitico gamma dinamica e la copertura della proteina sono migliorate, conseguente la capacità di identificare la maggior parte delle proteine espresse durante l'esecuzione di analisi intero proteoma15 ,16,17,18. Altri progressi tecnici includono piccole particelle C18 (1,9 µm) ed esteso lungo colonna (~ 1 m)19. Inoltre, altri miglioramenti importanti sono nuove versioni di spettrometri di massa con velocità di scansione rapida, una migliore sensibilità e risoluzione20e bioinformatica sofisticata pipeline per MS dati mining21.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che incorpora le più recenti metodologie con modifiche per migliorare la sensibilità e la velocità effettiva, mentre ci si concentra sui meccanismi di controllo di qualità in tutto l'esperimento. Il protocollo comprende estrazione di proteine e digestione, TMT 10-plex etichettatura, pH di base e frazionamento RPLC pH acido, ad alta risoluzione MS rilevamento ed elaborazione di dati di MS (Figura 1). Inoltre, realizziamo diversi passaggi di controllo di qualità per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Questo protocollo dettagliato è destinato ad aiutare i ricercatori nuovi al campo ordinariamente identificare e quantificare con precisione migliaia di proteine da un lisato o tessuto.

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Protocol

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Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza pertinenti (cioè, MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriato durante l'esecuzione di questo protocollo.

Nota: viene utilizzato un set di reagente TMT 10-plex isobarica etichetta in questo protocollo per la quantificazione del proteoma di 10 campioni.

1. preparazione di tessuti o cellule

Nota: è fondamentale per raccogliere campioni in tempi brevi a bassa temperatura per mantenere le proteine nel loro stato originale biologica.

  1. Lavare le cellule aderenti (ad es., cellule HEK 293) su una zolla di 10cm due volte con 10 mL di ghiaccio freddo tampone fosfato salino (PBS). Raschiare e raccogliere le cellule (~ 2 x 10 6 cellule) in 1 mL di PBS. Trasferire in provette da 1,5 mL ed eliminare PBS dopo centrifugazione a 600 x g per 5 min a 4 ° pellets di cella C. Conservare a-80 ° C fino a lisi.
    Nota: Un esperimento pilota è spesso eseguito per esaminare il rendimento di proteina. Circa 1 mg di proteine possono essere estratti da 10 x 10 6 cellule di mammifero o da una piastra di 15cm con 80% confluenza.
  2. In alternativa, lisare le cellule aderenti sul loro piatto aggiungendo il tampone di Lisi direttamente alla piastra dopo lavaggio. Raccogliere i lisati in provette da 1,5 mL e utilizzare la descrizione del protocollo nel passaggio 2.5.
  3. Raccogliere cellule in sospensione in provette da 15 mL, lavare due volte con 10 mL di PBS freddo ghiaccio, trasferire in provette da 1,5 mL e centrifugare a 600 x g per rimuovere PBS. Togliere le fasi di lavaggio completamente per mantenere la concentrazione di ingredienti di buffer di lisi di PBS. Memorizzare le palline delle cellule a-80 ° C fino a lisi.
  4. Raccogliere e pesare tessuti rapidamente. Mantenere i tessuti in azoto liquido subito dopo dissezione e store a -80 ° C.
    Nota: La resa di proteine dei tessuti è circa il 5-10% del peso del tessuto
  5. utilizzare dimensioni tessuto omogeneo e regioni anatomiche per 10 campioni per ridurre l'eterogeneità del campione. Rimuovere la contaminazione del sangue risciacquando campioni due volte con 1 mL di PBS freddo ghiaccio per evitare le proteine del sangue molto abbondante che interessano la quantificazione della proteina e l'analisi dei dati a valle.

2. Estrazione della proteina, controllo di qualità Western Blotting, digestione In soluzione e Peptide desalificazione

Nota: utilizzo ciascuno dei 10 campioni allo stesso modo durante qualsiasi passaggio prima che il pool di campioni con etichetta TMT è essenziale per ridurre variazione.

Buffer di lisi
  1. make (50 mM HEPES [pH 8.5], urea 8 M e 0,5% sodio desossicolato) il giorno dell'esperimento.
    Nota: Denaturazione proteica parziale durante la lisi del campione influenza l'efficienza di digestione di proteine.
  2. Aggiungi lysis buffer affinché il rapporto di buffer per volume di campione è 10:1 e ~ 20% del volume finale di perle di vetro (diametro 0,5 mm) per palline delle cellule o tessuti (ad es., volume 10: 1 rapporto tra buffer e campioni) per ottenere una concentrazione finale di proteine della 5 a 10 mg/mL. Tenere tutti i 10 campioni la stessa concentrazione considerando il numero di celle utilizzate o peso del tessuto di ogni campione.
  3. Concentrazione nell'urea Maintain a 8 M con l'aggiunta di urea solida al campione. Ricordatevi di prendere in considerazione il volume del pellet cellulare o tessuto nel calcolare la quantità di urea solida per aggiungere al campione per ottenere la concentrazione di 8 M.
    Nota: ONU-fresco urea buffer può introdurre modificazione chimica artificiale (cioè, la carbamilazione) e influire negativamente sul numero di peptidi identificati. Urea occupa un volume considerevole (100 mg di urea occupa ~ 73 µ l di soluzione).
  4. Mantenere i detriti insolubili in lisato per permettere la digestione delle proteine insolubili 23.
  5. Lyse i campioni in un frullatore a 4 ° C a velocità 8 per 30 s, resto per 5 s e ripetere per 5 volte o fino a quando i campioni sono omogeneizzati. I campioni possono anche essere lisati nel Vortex per 30 s a temperatura ambiente (TA) con un 30 s periodo sul ghiaccio per ~ 10 cicli di raffreddamento. Adeguare le condizioni di lisi come necessario, a seconda del tipo di campione.
  6. Mescolare il lisato bene senza centrifugazione e fare 2 piccole aliquote (~ 15 µ l ciascuna). Utilizzare 1 aliquota a misura di concentrazione di proteine e 1 aliquota per eseguire la convalida del controllo positivo eseguendo analisi western blot. Mantenere la restante aliquota Grande per l'analisi proteomica.
  7. Concentrazione di proteina di misura da un'analisi di quantificazione della proteina standard o da un macchiato di Coomassie breve sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide (10%) 22 con albumina di siero bovino (BSA) come standard. Utilizzare uno standard di BSA con un alto grado di precisione di concentrazione nota. Per raggiungere il massimo livello di precisione, eseguire analisi dell'amminoacido dello standard BSA.
    Nota: Altri precisi standard potrebbe essere disponibile. Le concentrazioni di proteina possono essere stimate anche dai numeri delle cellule o del tessuto pesi. Sebbene sia consigliabile 1 mg di proteina (100 µ g/campione), l'analisi può essere eseguito con meno di 100 µ g di proteina (10 µ g/campione).
  8. Aggiungi 100% acetonitrile (ACN) per ottenere una concentrazione finale di 10% della proteasi ACN e LysC ad un rapporto di enzima-substrato di 1: 100 (w/w) per digerire le proteine sotto altamente denaturare le condizioni a temperatura ambiente per 2 h 1. Aggiungere ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 1 mM per ridurre i legami disolfuro nelle proteine e incubare per 1 h. eseguire LysC digestione ad una concentrazione finale di urea 7,2 M.
  9. Diluire ulteriormente il digest campioni con tripsina a RT per 3 h e all'urea 2 M con 50 mM HEPES (pH 8.5) o pernottamento in una tripsina rapporto proteina di 01:50 (w/w). Uso circa 2 µ g di tripsina per 100 µ g di proteine e una concentrazione di tripsina di circa 10 ng / µ l.
    Nota: I fattori che possono condurre alla digestione della tripsina inefficiente sono problemi di pH, tripsina inattiva o l'uso di un rapporto inappropriato dell'enzima al substrato.
  10. Aggiungere DTT a cedere 1mm e ridurre ulteriormente i peptidi per 2 h a RT.
  11. Aggiungi iodoacetamide (IAA) per raggiungere 10 mM. Incubare 30 min al buio per alchilare Cys-contenenti peptidi a RT.
  12. Placare non reagito IAA aggiungendo DTT per raggiungere 30mm e incubare per 30 minuti a TA.
  13. Controllare l'efficienza della digestione della tripsina esaminando una piccola aliquota di ciascun campione. Desalificare utilizzando una punta di pipetta 10 µ l con cromatografia media incorporati nello spazio morto, secondo il produttore ' protocollo s. Analizzare ogni campione di LC-MS/MS. LC-MS/MS parametri sono gli stessi come nel passaggio 5, con l'eccezione che il gradiente è 10 min 23.
  14. Eseguire una ricerca nel database per i dati grezzi di MS (vedere più in dettaglio nel passaggio 6) utilizzando 4 fenditure perse come parametro di ricerca.
    Nota: Se il numero di perso fenditure è > 10%, può indicare digestione della tripsina incompleta. Questo influenzerà negativamente i risultati a valle. Questo è un passo critico controllo qualità (QC).
  15. Digerire campioni nuovamente se la mancata segmentazione è > 10% con l'aggiunta di un ulteriore 10 µ l di tripsina ai campioni.
  16. Acidificare i campioni con l'aggiunta di acido trifluoroacetico (TFA) per raggiungere l'1% di concentrazione. Misurare il pH usando una striscia di pH. Verificare che il pH è scommessatra 2 e 3. Aggiungere più TFA goccia saggio (1 µ l) esigenze finché non si ottiene il corretto pH.
  17. Centrifuga a 20.000 x g a RT per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
  18. Lavare 0,5 a 60 µ g capacità spin colonne contenente resina fase inversa C18 con 0,25 mL di metanolo, se viene utilizzato 100 µ g campioni. Lavare 0,03 a 30 µ g capacità spin colonne con 0,25 mL di 60% TFA ACN/0.1% se utilizzando campioni di 10 µ g. Centrifugare le colonne di spin a 500 x g per 30 s.
  19. Equilibrare colonne con 0,5 mL di 0,1% TFA e rimuovere mediante centrifugazione a 500 x g per 30 s.
  20. Caricare campioni su colonne e associare i campioni alle colonne mediante centrifugazione a 100 x g per 3 minuti o fino a quando tutto il campione è passato attraverso la colonna.
  21. Aggiungere 0,5 mL di 0,1% TFA alle colonne e centrifugare a 500 g per 30 s.
  22. Aggiungere 125 µ l di 60% TFA ACN/0.1% a ogni colonna ed eluire mediante centrifugazione a 100 x g per 3 min verificare tutta la soluzione è passato attraverso la colonna.
  23. a secco gli eluenti a un concentratore a vuoto. Assicurarsi che i campioni siano resti completamente asciutti e non liquidi nei tubi. Conservare a-80 ° C fino a ulteriori analisi.

3. Etichettatura di peptidi TMT

Nota: è fondamentale per garantire che tutti i campioni sono completamente etichettati dai reagenti TMT. Diversi fattori (ad es., quantità di reagenti TMT, valore pH e precisione di quantificazione della proteina) possono influenzare TMT etichettatura di efficienza, che modificherà negativamente tutti i risultati a valle.

  1. Ricostituire ogni campione dissalate peptide in 50 µ l di tampone HEPES 50 mM (pH 8.5). Controllare il pH e assicurarsi che è tra 7 e 8.
    Nota: Il campione può essere acida se non completamente asciugato dopo la fase di dissalazione, che influenzerà l'efficienza d'etichettatura.
  2. Tenere ~ 1 µ g di ogni campione senza etichetta per un test in efficienza d'etichettatura e TMT successivo, come descritto al punto 3.3.
  3. Sciogliere i reagenti TMT in ACN anidro ed etichettare i campioni del peptide seguendo il produttore ' s istruzioni. Incubare i reagenti a temperatura ambiente per 1 h.
  4. Eseguire un test di efficienza d'etichettatura QC TMT dissalazione ~ 1 µ g di ogni campione con etichetta TMT e - senza etichetta utilizzando 10 puntali µ l con supporti incorporati cromatografia secondo il produttore ' protocollo s. Analisi di campioni di TMT-etichettati e senza etichetta di LC-MS/MS.
    Nota: I parametri di LC-MS/MS sono lo stesso come descritto in sezione 5, con l'eccezione che il gradiente è 10 min.
  5. Esaminare i dati grezzi per garantire che i peptidi senza etichetta non vengono rilevate nei campioni etichettati, garantendo efficienza etichettatura completa ( Figura 2). Fare questo per 6 a 10 peptidi separati verificare l'efficienza d'etichettatura.
  6. Placare la reazione aggiungendo 4 µ l di 5% idrossilammina e incubare per 15 min.
  7. Mescolare un'aliquota di volumi uguali e piccole (2 µ l) di ciascun campione con etichetta TMT. Desalificare utilizzando 10 puntali µ l con supporti incorporati cromatografia. Analizzare i campioni mediante LC-MS/MS, come descritto al punto 3.4. Utilizzare il programma di software di salto (un algoritmo di ricerca database open-source che converte i file raw di tandem MS in un elenco di peptidi e proteine) per determinare il rapporto di concentrazione relativa di tutti i 10 campioni delle intensità di tag TMT di tutti identificati peptidi.
    Nota: Questa prova di rapporto di premiscela QC è utile per determinare il corretto rapporto per miscelazione uguale prima la condivisione finale, come possono verificarsi errori di pipettaggio che cambierà le concentrazioni e il passo di quantificazione della proteina potrebbe non essere sempre accurato. È anche il modo migliore per garantire che l'importo di ciascuno dei 10 campioni utilizzati per il mixaggio finale sono tutti a un rapporto di parità, come descritto al punto 3.5.
  8. Ripetere tante volte quanto necessario per garantire un rapporto di 1:1 tra tutte le 10 campioni.
  9. Mescolare ugualmente i 10 campioni secondo i risultati del test rapporto premix. Utilizzare l'esempio con la concentrazione più bassa come base di riferimento per regolare i volumi degli altri 9 esempi.
  10. Rimuovere i sottoprodotti della reazione d'estinzione del pool TMT-etichettato campione di desalificazione.
    11. Bossoli di estrazione
  11. solido-fase di lavaggio da 1 mL contiene 50 mg di sorbente per colonna con 1 mL 0,25 mL di metanolo se utilizza 100 µ g campioni. Lavare 0,5 a 60 µ g capacità C18 spin colonne con 1 mL 0,25 mL di 60% TFA ACN/0.1% se utilizzando campioni di 10 µ g. Centrifugare le colonne a 500 x g per 30 s.
  12. Equilibrare colonne con 0,5 mL di 0,1% TFA e rimuovere mediante centrifugazione a 500 x g per 30 s.
  13. Caricare campioni su colonne e associare mediante centrifugazione a 100 x g per 3 minuti o fino a quando tutto il il campione è passato attraverso la colonna.
  14. Aggiungere 0,5 mL di 0,1% TFA alle colonne e centrifugare a 500 g per 30 s.
  15. Aggiungere 125 µ l di 60% TFA ACN/0.1% a ogni colonna ed eluire mediante centrifugazione a 100 x g per 3 min verificare tutta la soluzione è passato attraverso la colonna.
  16. a secco gli eluenti a un concentratore a vuoto. Assicurarsi che i campioni siano resti completamente asciutti e non liquidi nei tubi. Conservare a-80 ° C fino a ulteriori analisi.

4. Estesa ad alta risoluzione, base pH LC Prefractionation

  1. Set 2 colonne C18 collegate contenente particelle di ibrido di etilene con bridging (4,6 mm x 25 cm, per un totale di 50 cm; 3,5 µm granulometria) e utilizzare una pompa di LC microliter flusso ad alte prestazioni per frazionamento.
    Nota: L'uso di 2 colonne aumenta il carico del peptide e non migliora necessariamente la cromatografia. Per campioni contenenti ≤ 200 µ g di peptidi, 1 colonna è sufficiente.
  2. Lavare il ciclo di 100-µ l con aggiunte successive di 300 µ l di tampone A metanolo e acqua (Formiato di ammonio 10 mM, pH 8.0).
  3. Lavare le colonne con 100 µ l di altrettanto misto isopropanolo, metanolo, acqua e ACN ed equilibrare la colonna nel buffer di 95% per 2 h.
  4. Solubilizzare il campione dissalate pool TMT-etichetta del peptide in 65 µ l di tampone A. Verificare che il pH del campione è ~ 8.0. Se ancora acida, utilizzare idrossido di ammonio per aggiustare il pH a 8.0.
  5. Fractionate campione utilizzando il seguente gradiente con buffer B (tampone un plus 90% ACN): 15% al 20% per 15 min, 20% al 35% per 100 min e 35% al 50% per un minimo di 30 Set al collector frazione di raccogliere le frazioni ogni 2 min compreso il tempo di caricamento. Impostare la portata a 0,4 mL/min. Vedere riferimento 29 e Figura 1 per un rappresentanza cromatogramma.
  6. Raccogliere un totale di 80 frazioni e asciugare 40 frazioni (ogni altra frazione) con un concentratore a vuoto a completo essiccamento.
  7. Utilizzare i 40 campioni secchi per analisi LC-MS/MS.
  8. Analizzare 80 tutte le frazioni di LC-MS/MS per ottenere copertura ultra profonde proteome.

5. Preparazione di LC-MS/MS e parametri

Nota: quantificazione In TMT-base, ioni del peptide sono isobarico e appaiono come 1 massa in un'esplorazione MS1. Tuttavia, essi sono quantificati secondo l'intensità di ioni reporter (10 unico reporter ioni) durante la scansione di MS/MS dopo lo ione del peptide è stato frammentato con dissociazione di più alta energia collisione (HCD). I rapporti di TMT reporter dello ione possono essere soppressa da co-eluizione di ioni con etichetta TMT 24. Restringimento dello ione isolamento finestra 25, fase gassosa purificazione 26, il MultiNotch MS3 metodo 27 o vasto frazionamento con LC multidimensionali e lunghi gradienti (4-8 h) 28 sono approcci alternativi.

  1. Pack 75 µm di diametro interno (ID) svuotare colonne con 1,9 µm di C18 resina a 30-40 centimetri di lunghezza (~1.3 µ l di letto).
  2. Riscaldare le colonne a 65 ° C con un riscaldatore del portfolio di farfalla per ridurre la contropressione e impedire l'eccessiva pressione della ultra-alto-pressione sistema di cromatografia in fase liquida (UPLC). Bobina della colonna 2 o 3 volte all'interno del riscaldatore di farfalla per garantire che la lunghezza del letto intera colonna è riscaldata. Nastro della colonna all'interno del riscaldatore facendo attenzione a non nastro sopra il sensore di temperatura all'interno del riscaldatore.
    Nota: Il riscaldatore di portfolio di farfalla è montato e registrato su un pezzo su misura di plexiglass associato alla fase dello strumento XYZ.
  3. Preparare una (3% dimetil solfossido e 0,2% acido formico) nel buffer e B del buffer (buffer un plus 67% ACN) e lavare le colonne accuratamente con buffer di 95% B. Quindi, completamente equilibrare colonne in 95% tampone A (volumi di almeno 3 colonne). Utilizzare una portata di ~0.25 µ l/min e contropressione di 280 a 320 bar
  4. Esaminare la qualità del sistema LC-MS/MS eseguendo 100 ng di ratto cervello peptidi (o standard della nostra scelta) due volte prima di analizzare i campioni di TMT-etichettati. Verificare i seguenti parametri frequentemente per garantire la raccolta di dati di alta qualità: sondaggio MS l'intensità del segnale (tra e8 ed e9 per intensità di picco base), qualità degli spettri MS/MS (una buona rappresentanza di ioni y e b), larghezza del picco (12-22 s), tempo di ritenzione complessivo, Pressione di sistema LC (aumento di pressione > 50 barre indica una colonna sporco o intasato emettitore punta) e variabilità Assay (picchi identici dovrebbero essere < 30 s tra le esecuzioni).
    Nota: Per risolvere gli ioni vicino isobarica reporter dei reagenti TMT 10-plex (6.32 mDa differenza), la risoluzione di MS/MS deve essere impostata su almeno 30.000 a 400 m/z. HCD viene in genere utilizzato per frammentazione di ioni TMT10-plex reporter, in quanto non è soggetto alla regola di un terzo che si applica alla dissociazione indotta da collisione (CID) in trappola ionica strumenti.
  5. Pulire e tarare lo strumento MS regolarmente e utilizzare i freschi LC buffer per migliorare le prestazioni del sistema.
  6. Ricostituire i peptidi secchi dalla separazione pH di base in 5% TFA.
  7. Caricare ~0.2 µ g sulla colonna mentre fluenti buffer di 5% r.
  8. Elute con il 15% e il 45% del buffer B in 150 min. Come punto di partenza, utilizzare il seguente gradiente: tempo 0, buffer B 5%; tempo 2, tampone B 15%; 135, tampone B 45% del tempo, tempo 145, tampone B 70%; e 150, tampone B 95% del tempo. Regolare la sfumatura leggermente per frazioni RPLC pH di base precoce e tardiva dopo aver esaminato i cromatogrammi di picco base.
  9. Operano lo spettrometro di massa in modalità dati-dipendente con una scansione di analisi nell'analizzatore di massa della presa dello ione (400-1600 m/z; 60.000 Risoluzione; 1 x 10 6 guadagno automatico controllo (AGC) target; 50 ms tempo di massima dello ione; e modalità centroide). Eseguire scansioni ad alta risoluzione di 20 MS/MS (60.000 ad alta risoluzione, obiettivo AGC 1 x 10 5, ~ 100 ms tempo di massima dello ione, 35 energia di collisione di HCD normalizzato, 0,4 m/z isolamento finestra ed esclusione dinamica di 20 s).
    Nota: Dissociazione per trasferimento dell'elettrone (ETD) non è consigliabile per i reagenti TMT10-plex siti di fenditura ETD sono diversi da HCD, conseguente sovrapposizione dello ione reporter. Inoltre, ETD non è efficace come HCD perché peptidi triptici in genere generano stati caricati + 2 ed ETD è più efficiente a stati di carica superiori.

6. Analisi di dati di MS

Nota: Descriviamo l'analisi dei dati con il programma di software di salto. Tuttavia, l'analisi dei dati può essere eseguita con altri programmi commercialmente disponibili o free.

  1. Motore salto 21, che combina una ricerca di database basato su reticolo e un sequenziamento basato su tag de novo per migliorare la sensibilità e la specificità di ricerca i file raw di processo dallo spettrometro di massa con l'ibrido basato su tag.
  2. Convertire dati grezzi per mzXML formattare e ricerca MS2 spettri contro il database umano di UniProt destinazione-decoy (o altri database appropriato specie-specifico) per calcolare il tasso di falsi scoperta (FDR).
  3. Eseguire le ricerche utilizzando una tolleranza di 10 ppm di massa per gli ioni precursore e di frammento. Impostare altri parametri di ricerca completamente triptico restrizione con 2 fenditure perse massimi, 3 massimo modifica siti al peptide e l'assegnazione di un, b e y ioni di segnare i peptidi. Impostare statiche modifiche ai tag TMT sui residui di Lys e N termini (+229.162 Da) e carbamidomethylation di residui di Cys (+57.021 Da). Impostare modifiche dinamiche per includere l'ossidazione Met (+15.994 Da), che è un artefatto di peptide comuni derivanti dalla manipolazione del campione.
  4. Filtrare i dati dai seguenti criteri: 7 dell'amminoacido peptide minima lunghezza, precisione m/z (ad es., 5ppm) e corrispondenti punteggi (score J e deltaCn). Peptidi secondo la lunghezza del peptide, trypticity, di gruppo e stato di carica.
  5. Utilizzare un ulteriore livello di filtraggio abbinando Spartiti per ridurre proteina FDR a inferiore all'1%. Proteine identificate da un singolo conteggio spettrale richiedono un punteggio più alto corrispondente.
  6. Per condiviso da più membri di una famiglia di proteine, peptidi cluster i membri corrispondenti proteine in 1 gruppo.
    Nota: Secondo il principio di parsimonia, il gruppo è rappresentato dalla proteina con il maggior numero di peptidi assegnate e altre proteine accompagnati da peptidi unica 1.
  7. Quantitate proteine sommando reporter dello ione conteggi attraverso tutte le partite di spettro del peptide abbinati (PSMs) utilizzando un programma che integrato la suite di software salto.
  8. Per ciascuna accettato PSM, estrarre e correggere le intensità di ioni del reporter TMT secondo la distribuzione isotopica di etichettatura reagenti e la polarizzazione di caricamento, che è calcolata dai dati di quantificazione del PSM globali. Filtro PSMs con intensità bassa ed alta rumorosità con soglie definite dall'utente durante la quantizzazione.
  9. Calcolare un segnale relativo tra ciascuno ione di reporter e la media di tutti gli ioni 10 reporter. Sommare i relativi segnali del PSMs per proteine identificate. Convertire questi segnali relativi ai segnali assoluti moltiplicando l'intensità di ione Media reporter del PSMs top 3 in corrispondenti proteine.
  10. Utilizzare un approccio computazionale post-MS interferenza. Supponendo che l'intensità di ioni 1 y è proporzionale all'intensità di ioni di reporter, calcolare il rapporto lineare da scansioni pulite e derivare il livello di interferenza dall'intensità y1ion contaminati in scansioni rumoroso 23.
    Nota: Per i peptidi triptici TMT-etichettati, residui di K-TMT e R sono 2 tipi di ioni y 1 (Da 376.27574 e Da 175.11895, rispettivamente) in scansioni MS2. Se solo 1 y 1 ione viene rilevato ed è coerenza con il peptide identificato, il MS2 è considerata pulita scansione ( Figura 3A). Se vengono rilevati sia y1ions, la MS2 è ritenuto una scansione rumorosa.
  11. Esportare i valori di quantificazione della proteina in un programma di software di foglio di calcolo per ulteriori analisi. Utilizzare confronti a coppie o un'analisi della varianza per identificare proteine differenzialmente espressi.

7. Convalida dei dati MS

Nota: per valutare la qualità dei dati di MS, almeno 1 metodo di convalida deve essere eseguita prima di procedere con gli esperimenti biologici che richiede tempo.

  1. Esaminare manualmente gli spettri MS/MS di proteine di interesse per convalidare la sequenza del peptide e la quantificazione dello ione TMT reporter.
  2. Uso conosciuto dati di quantificazione della proteina per confermare i risultati di MS.
  3. Verificare cambiamenti della proteina con approcci basati su anticorpi (ad es., westeRN analisi immunohistochemistry e della macchia).
  4. Chimicamente sintetizzare i peptidi di interesse e li usa come interni standard per confermare l'identificazione dei peptidi nativi.
    Nota: I loro modelli di MS/MS e il tempo di ritenzione durante LC-MS/MS dovrebbe essere identiche.
  5. Verificare le modifiche di proteine con un approccio mirato di MS.

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Results

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Abbiamo usato un mix di peptide cross-specie precedentemente descritte per analizzare sistematicamente l'effetto di compressione rapporto in 3 passi principali del protocollo, tra cui frazionamento pre-MS, MS impostazioni e correzione post-MS23. Il frazionamento di pre-MS è stato valutato e ottimizzato utilizzando una combinazione di pH di base RPLC e pH acido RPLC. Per l'analisi di post-MS, sono stati considerati solo specie-peptidi. Abbiamo usato questo modello d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un protocollo ad alta velocità per la quantificazione delle proteine con una strategia di etichettatura isobarica 10-plex, che è stata implementata con successo in diverse pubblicazioni12,13,14,32 . In questo protocollo, possiamo analizzare fino a 10 campioni biologici differenti della proteina nell'1 esperimento. Ordinariamente possiamo identificare e quantificare ben oltre 10.000 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano tutti gli altri membri lab e impianto per utile discussione. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NI H concede ALSAC, R01AG047928, R01AG053987 e R01GM114260. L'analisi di MS è stata eseguita in Research Hospital proteomica Facility di St. Jude Children, parzialmente sostenuto da NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Gli autori ringraziano Nisha Badders per aiuto con il manoscritto di editing.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sistema LC 1220AgilentG4288B
50% IdrossilamminaThermo Scientific90115
AcetonitrileBurdick & JacksonAH015-4
Frullatore a proiettileNext AdvanceBB24-AU
Riscaldatore a farfallaPhoenix S & Punte TPST-BPH-20
C18Harvard Apparatus74-4607
Ditiotreitolo (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Acido formicoSigma94318
Fraction CollectorGilsonFC203B
Perle di vetroNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
Iodoacetamide (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
MetanoloBurdick & JacksonAH230-4
Kit per il dosaggio delle proteine BCA PierceThermo Scientific23225
Spettrometro di massaThermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 resina, 1,9 umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Colonne Self PckNuovo obiettivoPF360-75-15-N-5
Desossicolato di sodioSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex Reagente per etichette isobaricheThermo Scientific90110
Acido trifluoroacetico (TFA)Applied Biosystems400003
TripsinaPromegaV511C
UreaSigmaU5378
Xbridge Column C18 colonnaWaters186003943
Ziptips C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960

References

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