Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Summary

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Abstract

Zebrafish sono emerso come un potente modello di varie malattie umane e uno strumento utile per una gamma crescente di studi sperimentali, che abbracciano fondamentale biologia inerente allo sviluppo attraverso agli schermi di genetici e chimici su larga scala. Tuttavia, molti esperimenti, soprattutto quelli legati alla infezione e modelli dello xenotrapianto, si basano su microiniezione e l'imaging di embrioni e le larve, che sono laboriose tecniche che richiedono abilità e competenze. Per migliorare la precisione e la velocità di trasmissione di corrente microiniezione, abbiamo sviluppato una serie di dispositivi microstrutturati per orientare e stabilizzare gli embrioni di zebrafish 2 giorni post fertilizzazione (dpf) nell'orientamento ventrale, dorsale o laterale prima dei procedura. Per facilitare l'imaging di embrioni, abbiamo anche disegnato un semplice dispositivo con canali che orientano 4 zebrafish lateralmente in parallelo contro un vetro vetrino coprioggetti. Insieme, gli strumenti che vi presentiamo qui dimostrano l'efficacia di approcci fotolitografica per generare dispositivi utili per l'ottimizzazione delle tecniche di zebrafish.

Introduction

Zebrafish sono emerse come un potente modello per molti campi, dagli studi di biologia dello sviluppo fondamentale a larga scala genetica e chimica schermi^1,2. Sistematiche manipolazioni genetiche, come la sovraespressione genica, atterramento, CRISPR/Cas9 mutagenesi e transgenesi si basano su microiniezione di materiale genetico in singola cellula zigote, che ha portato allo sviluppo di semplice, facile da usare, nel commercio strumenti disponibili per orientare e stabilizzare le uova per iniezione³. Altri approcci, come il trapianto e l'infezione, spesso richiedono microiniezione in e....

Protocol

Microinjection delle larve è stato approvato dalla Massachusetts General Hospital sottocommissione per ricerca Animal Care sotto protocollo 2011N000127.

1. fabbricazione di dispositivi

Nota: Tutti i assistita da computer (CAD) file di disegno utilizzati per la progettazione di maschere di fotolitografia descritte qui (Figura 1) sono disponibili per il download. Vedi tabella materiali per i collegamenti.

1. Fabbricare il wafer di stampo master in camera bianca classe 1.000 utilizzando tecniche fotolitografiche standard⁷. Per le matrici di microstruttura ....

Results

L'approccio descritto qui di seguito viene illustrato il disegno (Figura 1) e la fabbricazione di dispositivi per l'utilizzo con 2 dpf zebrafish, utilizzando fotolitografica (Figura 2) e tecniche di soft-litografiche (Figura 3). Questo metodo consente di testare rapidamente molte iterazioni di progetto e modifiche, e le alterazioni e l'ottimizzazione delle dimensioni di microstruttura per l'uso con i.......

Discussion

Qui, descriviamo l'uso di dispositivi abbiamo recentemente sviluppato per facilitare 2 dpf zebrafish microiniezione⁵e introdurre un dispositivo semplice montaggio privo di agarosio per imaging conveniente degli embrioni. Questi strumenti evidenziano l'utilità delle tecniche fotolitografiche per la fabbricazione di dispositivi utili per le tecniche di zebrafish.

Abbiamo trovato questo dispositivi MSA particolarmente utile per l'iniezione di cellule o particelle incline a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polidimetilsilossano (PDMS)	Ellsworth Adhsives	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Per la fusione dei dispositivi. Il kit include il monomero PDMS e l'iniziatore
Bassa temperatura di gelificazione dell'agarosio	Sigma Aldrich	A9414-10G	Per la colata di dispositivi di agarosio
PFDTS silano	Sigma Aldrich	448931-10G	Per la colata di stampi PDMS negativi
Tricaina (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-10G	Per anestetizzare il pesce zebra
Destrano di rodamina 70.000 Da	ThermoFisher	D1818	Per tracciare le microiniezioni
Leucotriene B4 (LTB4)	Cayman Chemicals	20110	Chemioattrattivo neutrofilo
N-Formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLP)	Sigma Aldrich	F3506-50MG	Chemioattrattivo neutrofilo
15 cm Piastra di Petri	Fisher scientific	08-757-148	Per la colata dal wafer master
Piastre a 6 pozzetti con fondo di vetro	MatTek	P06G-0-20-F	Per dispositivi di imaging
Microcapillari in vetro borosilicato	World Scientific Instruments	TW-100-4	Per aghi per microiniezione Pipette
di trasferimento	Sigma Aldrich	Z350796	Per il trasferimento di embrioni di pesce zebra Punte
per microloader	Fisher scientific	E5242956003	Per caricare gli aghi per microiniezione
Punzone Harris Uni-Core da 1,5 mm	Ted Pella Inc.	15111-15	Per punzonare le porte nei dispositivi di imaging PDMS
No. 11 Scalpel	Fine Science Tools	10011-00	Per il taglio di PDMS
Dumont No. 5 Pinze	Fine Science Tools	11252-10	Per dechorionare embrioni e rompere le punte degli aghi per microiniezione
Micromanipolatore Marzhauser	ASI	MM33-R	Per manipolare l'ago per microiniezione
Supporto	magneticoMSC	SPI - 87242624	Per il montaggio del micromanipolatore
MPPI-3 Controllore Picopump	ASI	MPPI-3	Per controllare il volume e la temporizzazione della microiniezione
Microscopio a fluorescenza invertita EVOS	ThermoFisher	EVOS FL	Per l'imaging degli embrioni iniettati Microscopio
da dissezione	Nikon	SMZ745	Per la visualizzazione della microiniezione
Software AutoCAD	Autodesk		Scarica i file AutoCAD da: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 e sulla pagina wiki dei protocolli della comunità ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocollo+Wiki