Articolo metodologico

Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule

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DOI:

10.3791/56606

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8 febbraio 2018

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1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Studiando il microambiente tumorale può identificare biomarcatori prognostici o predittivi della risposta clinica all'immunoterapia. Presentato qui, è un metodo innovativo basato su in situ di fluorescenza multispectral imaging per analizzare e contare automaticamente varie sottopopolazioni di CD8+ T cellule. Questa tecnica riproducibile ed affidabile è adatta per analisi di grande gruppo.

Abstract

Le cellule immunitarie sono componenti importanti del microambiente tumorale e influenzano la crescita del tumore e l'evoluzione in tutte le fasi di carcinogenesi. In particolare, è ora ben stabilito che il sistema immunitario si infiltrano in tumori umani possono correlare con prognosi e risposta alla terapia. L'analisi del sistema immunitario infiltrarsi nel microambiente tumorale è diventata una sfida importante per la classificazione dei pazienti e la risposta al trattamento.

La co-espressione di recettori inibitori quali programma delle cellule morte Protein 1 (PD1; anche conosciuto come CD279), citotossica dei linfociti T Associated Protein 4 (CTLA-4), T-cellula immunoglobulina e mucina contenente proteine-3 (Tim-3; anche conosciuto come CD366) e dei linfociti Attivazione genica 3 (Gal-3; anche conosciuto come CD223), è un segno distintivo dell'esaurimento delle cellule T. Abbiamo sviluppato una multiparametrica in situ l'immunofluorescenza che macchia per identificare e quantificare a livello cellulare il co-espressione di questi recettori inibitori. Su una serie retrospettiva di tessuto congelato dei carcinoma delle cellule renali (RCC), utilizzando una tecnologia di imaging multispettrale fluorescenza accoppiato con un software di analisi di immagine, è stato trovato che il co-espressione del PD-1 e Tim-3 il tumore infiltrante CD8+ T cellule è correlata con una prognosi difficile in RCC. A nostra conoscenza, questo rappresenta il primo studio che dimostra che questo automatizzato tecnologia multiplex in situ può avere qualche rilevanza clinica.

Introduzione

Negli ultimi anni, l'immunoterapia è emerso come un trattamento molto promettente per molti tipi di cancri, compreso il controllo delle chiamate remote. In particolare, l'immunoterapia basata sull'inibizione di punti di controllo inibitori come PD-1 e CTLA-4 è stato segnalato per essere clinicamente efficace1,2,3,4,5, 6. anticorpi monoclonali contro CTLA-4, PD-1, o programma morte Ligand 1 (PD-L1) sono già approvati in parecchi cancri e portare a lunga durata le risposte cliniche in oltre il 20% dei pazienti7. Tuttavia, non tutti i pazienti sono di intervento, il costo del trattamento è elevato, e questi trattamenti sono tossici, che conduce a potenziali gravi effetti collaterali autoimmune-come. Pertanto, la sfida attuale consiste nell'identificare marcatori predittivi per quelle nuove immunoterapie. Il tasso di mutazioni nel tumore, l'espressione del PD-L1 o i livelli di intratumoral CD8+ infiltrazione delle cellule di T sono stati segnalati per correlare con la risposta clinica. Tuttavia, questa associazione è ancora troppo debole per raccomandare l'uso di questi biomarcatori clinici nella pratica clinica, ad eccezione del test di compagno per PD-L1 prima dell'amministrazione di Pembrolizumab non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC) pazienti8 ,9,1011,12. È stato dimostrato che la co-espressione di molti recettori inibitori come PD-1, Tim-3, Gal-3, e CTLA-4, induce un fenotipo delle cellule di esaurimento e la resistenza alla terapia13,14,15. Poiché il sangue periferico non è rappresentativo del microambiente tumorale, è di grande interesse per analizzare le caratteristiche fenotipiche delle cellule in situ. Cellule di T di co-espressione PD-1 e Tim-3 sono noti per essere cellule funzionalmente alterate in diversi contesti13,16,17. In questo studio, l'impatto prognostico della co-espressione di recettori inibitori due PD-1 e Tim-3 il CD8+ T cellule è stata valutata.

Fino a ora, studiando il co-espressione di marcatori multipli su tumore infiltrante linfociti (TILs) è stata effettuata principalmente dall'analisi di citometria a flusso, rendendo necessario per lavorare su tumori freschi e pertanto senso che osta alla analisi retrospettive. Con la colorazione convenzionale in situ può essere eseguita solo una colorazione in un momento e la caratterizzazione del tipo cellulare che co-esprime i marcatori non è possibile. Ad esempio, PD-L1 è espressa da molti tipi di cellule del microambiente tumorale, che lo rende difficile da definire mediante analisi immunohistochemistry convenzionali quali le cellule che esprimono PD-L1 sono più rilevanti per gli studi correlativi. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo innovativo in situ multiparametrica immunofluorescenza con computer-contando per correlare il co-espressione di PD-1 e Tim-3 da tumore infiltrante CD8 T-cellule+ con i risultati clinici in RCC. Questa tecnica ha diversi vantaggi, tra cui la possibilità di analizzare a livello di singola cellula e marcatori multipli allo stesso tempo utilizzando una macchina fotografica multispettrale che può catturare intervalli limitati > 10 nm attraverso cristalli liquidi filtri18. Inoltre, la procedura è automatica e consente una riproducibilità inter-operatore e un'analisi ridotta rispetto alle tecniche manuali19. Nel campo del cancro, parecchi studi riferito convincente stainings multiple di molecole immuni come PD-1, PD-L1 e CD8 nel carcinoma delle cellule di Merkel, cancro ai polmoni e testa e collo cancro20,21,22, 23. il conteggio delle cellule automatizzato è possibile con la formazione da parte dell'utente (passaggio phenotyping). La fluorescenza è misurata nei compartimenti cellulari differenti (nuclei, citoplasma e membrana).

Qui, diversi sottoinsiemi di tumore-infiltrazione CD8+ T cellule esprimenti PD-1 e/o Tim-3 in un'ampia coorte di RCC sono stati contati e i risultati sono stati correlati con punteggi di gravità clinica e parametri di sopravvivenza. È stato anche possibile analizzare l'intensità di fluorescenza della membrana alla risoluzione del cellulare con i dati di intensità di fluorescenza media (MFI) come in citometria. Per quanto ne sappiamo, questo rappresenta i primi risultati prognostici Report Studio utilizzando questa tecnica di conteggio base imaging multispettrale.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato etico locale (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consenso informato è stato ottenuto dal partecipante incluso nelle coorti.

1. tessuto materiale

  1. Raccogliere campioni di tessuto RCC il giorno dell'intervento. Gestire l'esemplare chirurgico a temperatura ambiente (reparto di patologia).
  2. Raccogliere un campione di tumore di circa 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm taglia in un tubo secco. Snap congelamento in azoto liquido e conservato a-80 ° C.
  3. Rivestire i campioni a temperatura ottimale di taglio composto. Sezione i campioni con un criostato a-20 ° C in 4-6 µm spessore sezioni. Lasciate che i campioni di aria secca su vetrini per 12 h e memorizzarli direttamente a-80 ° C per evitare il disseccamento.
  4. Verificare la qualità del campione visualizzando un ematossilina ed eosina macchiate sezione.

2. colorazione di immunofluorescenza in Situ di TILs

  1. Linee guida procedurale
    1. Eseguire tutte le fasi sperimentali a temperatura ambiente.
    2. Per tutti i passaggi, eseguire le diluizioni con tampone Tris salino (TBS; Vedi Tabella materiali).
    3. Eseguire il lavaggio in TBS per tutti i passaggi tranne dopo l'incubazione dell'anticorpo primario. Per quest'ultimo, utilizzare Tris Buffer Saline Tween20 (TBST, Vedi Tabella materiali). Per la composizione di buffer e ricostituzione vedere supplementare nella tabella 1.
    4. Utilizzare una camera umida per le incubazioni dell'anticorpo e una vaschetta di colorazione per il lavaggio.
    5. La sezione non lasciare asciugare durante la procedura.
  2. Pretrattamento
    1. Scongelare la diapositiva contenente il campione di tessuto e asciugare accuratamente la diapositiva attorno al campione con un tovagliolo di carta. Delimitare l'area di reazione contenente il tessuto con una penna di barriera idrofoba (Vedi Tabella materiali). A secco per 2 min.
    2. Difficoltà i campioni in 100% di acetone per 5 min, secco per 2 min e lavare con TBS per 10 min.
  3. Saturazione e blocco
    1. Pretrattare i vetrini per 10 min con 3 gocce di avidina 0,1%, rubinetto e/o flick la diapositiva per distribuire l'avidina e rimuovere le bolle d'aria e quindi trattare per 10 min con 3 gocce di biotina 0,01% (Vedi Tabella materiali), toccare, e/o flick. Lavare con TBS.
    2. Eseguire un blocco di recettori Fc. Applicare 100 µ l di un 5% volume/volume del normale siero diluito in siero di TBS. uso delle stesse specie di host come l'anticorpo marcato secondario o terziario (Vedi Tabella materiali); qui, asino siero è stato utilizzato. Incubare per 30 min.
    3. Durante l'incubazione, brevemente gira la anti-CD8, PD-1 e gli anticorpi Tim-3 (Tabella materiali). Preparare la miscela di anticorpi primari in TBS come descritto nella tabella supplementare 2.
  4. Immunocolorazione per CD8, PD-1 e Tim-3
    1. Preparare la miscela di anticorpo primario. Riferimento alla Tabella materiali e supplementare tabella 2 per gli anticorpi utilizzati (anti-CD8, PD-1, Tim-3 e loro corrispondenti anticorpi secondari) e le relative concentrazioni.
    2. Toccare e/o scorri il rimanente siero di asino (aggiunto nel passaggio 2.3.2). Incubare i vetrini con 100 µ l della miscela non marcato gli anticorpi primari per 1h in una camera umidificata.
    3. Durante l'incubazione, brevemente spin la cianina 5 anti-coniglio AF488-anti-capra e anticorpi biotinilati anti-topo e preparare la miscela di anticorpi secondari, come descritto nella tabella supplementare 2.
    4. Lavare i vetrini in TBST per 5 min. a secco le diapositive.
    5. Incubare i vetrini con 100 µ l di anticorpi secondari per 30 min in una camera umidificata.
    6. Preparare la miscela di anticorpo terziario contenente Cy3-streptavidina, come descritto nella tabella supplementare 2.
    7. Lavare i vetrini in TBS per 10 min. a secco le diapositive.
    8. Incubare i vetrini con 100 µ l della miscela dell'anticorpo terziario per 30 min.
    9. Lavare i vetrini in TBS per 10 min. a secco le diapositive.
  5. Montaggio delle cellule
    1. Montare i vetrini in un 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dicloridrato DAPI-contenente mezzo (1,5 µ g/mL DAPI) con un vetrino coprioggetto compatibile per microscopia di fluorescenza di montaggio (vedere Tabella materiali).
      Nota: Come controllo negativo per ogni esperimento, è stata utilizzata una diapositiva con anticorpi isotipo-abbinato alla stessa concentrazione come corrispondenti anticorpi. Per la colorazione, abbiamo usato IgG1 di topo, coniglio IgG e gli anticorpi controllo negativo IgG di capra (Vedi Tabella materiali). Come controllo positivo, abbiamo usato la tonsilla iperplasiche umana che è noto per essere positivo per i marcatori testati, per ogni esperimento. Una tipica colorazione è descritto nei risultati (Figura 1). Mono-macchiatura di CD8, PD-1 e Tim-3 deve essere eseguita individualmente (una colorazione per vetrino) con lo stesso pre- trattamento e senza DAPI. Deve essere eseguita anche una diapositiva nelle stesse condizioni sperimentali senza alcun anticorpo e il solo mezzo di montaggio DAPI. Una diapositiva dovrebbe essere imaged con identiche condizioni sperimentali senza alcun anticorpo e senza DAPI.

3. fluorescenza analisi e conteggio delle cellule automatizzato

  1. Acquisizione di immagini con il microscopio automatizzato
    1. Creare un protocollo.
      1. Attivare il software automatizzato microscopio e l'illuminatore a fluorescenza.
      2. Nella barra dei menu, fare clic su "File", "creare il protocollo," selezionare "DAPI," "FITC" e "TRITC."
      3. Fare clic su "Next", "Sezione di tessuto" e fare clic su "Avanti", "Nome del protocollo." Scegliere un nome, ad esempio, "CD8-PD-1-Tim-3," fare clic "Next" e "Salva".
      4. Inserire manualmente una diapositiva sul palco.
      5. Nella barra dei menu, fare clic su "setup", "Impostazioni". Fare clic su "set casa Z" nella nuova finestra.
      6. Regolare il tempo di esposizione con un controllo positivo slide cioè un CD8, PD-1 e Tim-3 triple-macchiato con il campione DAPI.
      7. Nella barra di controllo, fare clic su "imposta l'esposizione".
      8. Regolare il tempo di esposizione per ogni filtro fino ad ottenuta un segnale sufficiente ma non saturante.
      9. Per formazione immagine monocromatica, eseguire le seguenti operazioni:
      10. Selezionare acquisizione e sotto 'autofocus' scegliere filtro DAPI.
      11. Nel "limite di zona di scansione", spostare l'obiettivo superiore all'angolo superiore sinistro della diapositiva. Fare clic su "Mark". Fare lo stesso per l'angolo inferiore destro.
        Nota: Questo passaggio delimita l'area di bassa potenza imaging (imaging LP) 4x; essere consapevoli di pignoramento e quindi il marchio circondano tutti i campioni della serie.
      12. Per alta potenza (HP) di imaging, eseguire le seguenti operazioni:
      13. Sotto "Autofocus", scegliere "DAPI".
      14. In band «Acquisizione», scegliere "DAPI", "FITC", "Cy3" e "Cy5". Fare clic su "OK". Sulla barra dei menu fare clic su "File", "Salva protocol".
    2. Scansione di diapositive.
      1. Caricare il protocollo facendo clic su "File", "caricare il protocollo" dalla barra dei menu. Cliccare su "Start".
      2. Immettere 'Lab ID' (percorso della cartella per la memorizzazione delle immagini). Inserisci diapositiva ID per identificare la diapositiva. Fare clic su "Avanti".
      3. Fare clic su "Bianco e nero Imaging" (per acquisire l'intera diapositiva sotto la luce del campo luminoso e acquisire immagini in sequenza utilizzando un obiettivo 4x).
        Nota: Questo produce una panoramica in scala di grigi della diapositiva.
      4. Clicca su "Cerca esemplare". Selezionare l'area di tessuto da sottoporre a scansione a bassa risoluzione (4x): tenere premuto il tasto 'Ctrl' e fare clic su un campo utilizzando il cursore per selezionare o deselezionare i campi (Figura 2A).
      5. Fare clic su "LP Imaging" (4 x imaging) per acquisizione di immagine rosso blu verde fluorescente di ogni campo.
      6. Per la selezione del campo di HP, tenere premuto il tasto 'Ctrl' e fare clic su un campo utilizzando il cursore per selezionare o deselezionare i campi che corrispondono alla zona di tessuti da sottoporre a scansione ad alta risoluzione (20x). Selezionare 5 campi (Figura 2B).
      7. Fare clic su "HP Imaging" (20 x imaging) per un'acquisizione di immagini multispettrali di ogni campo (Figura 2).
      8. Fare clic su "Dati archiviazione" per memorizzare le immagini nella cartella che è stata selezionata all'inizio in Labella.
        Nota: Il processo è ricapitolato e illustrato nella Figura 2. Per ogni passaggio (rilevamento di tessuto, selezione del campo) un algoritmo può essere incrementato e addestrato dall'utente per un processo di digitalizzazione di tutto automatizzato.
  2. Analisi di immagine di fluorescenza e cella automatizzata contando con software di analisi accoppiata
    1. Compilare la libreria spettrale.
      1. Aprire il software di analisi di immagine.
      2. Sul pannello di sinistro, aprire "Costruire biblioteche". In 'carica immagine', clicca su "Sfoglia" e selezionare un'immagine di mono-macchiato (ad es., CD8/cianina 5).
      3. Selezionare il fluoroforo, (ad es., cianina 5). Fare clic su "Estrai". Fare clic su "Salva" per memorizzare nella libreria. Fare clic su "Salva".
      4. Ripetere lo stesso processo per PD-1, Tim-3 e vetrini colorati mono DAPI al fine di integrare lo spettro di ogni fluoroforo di interesse.
        Nota: Compilazione della libreria spettrale si integra lo spettro per ogni fluoroforo utilizzato per il tessuto specifico (qui, rene), ma possono essere utilizzate "sintetiche" librerie già esistenti. Come lo spettro di autofluorescenza è strettamente relativa del tessuto, è importante eseguire un auto-fluorescenza e libreria spettrale per ogni progetto.
    2. Creare un nuovo progetto.
      1. Dalla barra dei menu, fare clic su "File", "Nuovo progetto". Nella scheda "Funzionalità di ricerca", selezionare "segmentazione delle cellule". Nella scheda 'Phenotyping', selezionare "fenotipi". Clicca su "Crea".
      2. Integrare le immagini rappresentative nel progetto.
        1. Nella scheda 'File', fare clic su "Apri immagine". Scegliere 10 a 30 immagini rappresentative di tutta la serie. Aggiungere la diapositiva non macchiato per rimuovere autofluorescenza. Sul pannello di destra: origine selezionare libreria. Selezionare fluoroforo e scegliere quelli corrispondenti alla libreria spettrale precedentemente costruita.
      3. Per rimuovere il tessuto autofluorescenza, fare clic sul pulsante"AF" e quindi selezionare l'area di autofluorescenza sulla diapositiva vuota.
      4. Trattamento dell'immagine e la generazione di immagine composita.
        1. Fare clic su "Preparare tutti" per integrare la libreria di fluorescenza e gli spettri di autofluorescenza per generare l'immagine composita (Figura 3). Fare clic sull'icona 'occhio' per aprire il pannello 'editor visualizza' e selezionare i dati visualizzati: selezionare i marcatori CD8, PD-1, Tim-3 e DAPI. Rimuovere l'autofluorescenza. Seguire la procedura presentata dal software.
      5. Le cellule del segmento.
        1. Per segmentare le cellule, in 'Vano', scegli "Nuclei" e "Membrana". Nella scheda "Nuclei", è possibile impostare DAPI come il colorante di contrasto nucleare.
        2. Nella scheda 'Massimo e dimensioni minime (px)' immettere "40" e "176" come dimensioni minime e massime, rispettivamente. Per segnale 'Minimo', impostare "0,13". Nella scheda "Split", impostare "2.60". Nella scheda "Nuclei", impostare "0,81". Seleziona "utilizza il segnale di membrana per segmentazione di aiuto".
        3. Fare clic su "Cellule del segmento" nella parte inferiore dello schermo. Controllare la segmentazione dei nuclei e membrane delle cellule e riprovare con parametri diversi, se non corrisponde la fluorescenza DAPI e membrana delle cellule.
          Nota: Il software riconosce le cellule con il nucleare DAPI macchiatura e sulla base delle dimensioni della cella. Regolare i parametri di cella (dimensione, Spalato, pixel) secondo il progetto.
      6. Fenotipo delle cellule.
        1. Nella scheda 'Fenotipo', cliccare su "Aggiungi". Creare delle cellule fenotipo Categorie: CD8 (punto blu) / CD8-PD-1 (punto rosso) / CD8-PD-1-Tim-3 (punto verde) / altri (puntino nero) (Figura 4).
        2. Selezionare più di 5 esempi di celle di ogni categoria. Fare clic su "Classificatore in treno".
          Nota: Questo genera un algoritmo di classificazione statistica dal software.
        3. Fare clic su "Fenotipo tutti" per ottenere il fenotipo di ogni cella.
          Nota: Il software dà il fenotipo di una cellula con un intervallo di confidenza (CI) di precisione.
        4. Migliorare l'algoritmo di formazione il software fino a quando la differenza tra occhio e conteggio automatizzato è concorda (errore < 5%). Scegliere un IC che è accettabile per le celle di interesse.
          Nota: Abbiamo scelto di fare l'addestramento sulla base di 55% CI come accettabile.
      7. Salvare il progetto e l'algoritmo.
      8. Selezionare 'File' "progetto". Il nome e fare clic su "Salva".
    3. Eseguire analisi dei lotti della serie.
      1. Selezionare "Batch analysis". Selezionare il progetto. Aggiungere le immagini da analizzare. Selezionare una cartella di archiviazione per i dati. Fare clic su "Esegui". Controllare la qualità dell'immagine composita. Verificare la fenotipizzazione per tutte le immagini della serie.
        Nota: Il software di analisi di immagine accoppiato integra tutti i segnali di scomparti (membrana/citoplasma/nuclei) delle cellule. Il passo di fenotipizzazione è fondamentale anche se l'addestramento dell'algoritmo può essere un passo che richiede tempo. Tutti i dati di ogni immagine sono in un file con estensione txt. Tutti i dati di una cella (particolarmente relativo fenotipo dato con suo CI) sono in una sola riga. Per ogni diapositiva, l'acquisizione di immagini e conteggi successivi sono stati effettuati su 5 campi.
  3. Integrazione dei dati grezzi e generazione del conteggio delle cellule automatizzato
    1. Calcolare i dati con un programma statistico.
      1. Calcolare tutti i dati da 5 immagini corrispondenti ai 5 settori analizzati per 1 paziente. Utilizzare una piattaforma di statistica e avere un esperto statistico, data manager o scienziato dati eseguire l'analisi. Costruire uno script che automaticamente conta le celle a seconda del loro fenotipo, selezionando il CI > 55%.
      2. Mettere tutti i file. txt della serie nella stessa cartella.
    2. Estrarre i dati.
      1. Mettere tutti i file. txt in una cartella. Eseguire lo script automatico costruito al punto 3.3.1. Aprire il file CSV di output generato dallo script R. Salvare come formato di XL. L'output raccoglie il numero di celle per ogni fenotipo (cioè, CD8 da solo, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) per ogni paziente.
      2. Calcolare il numero medio di cellule per ogni paziente per ogni campo: dividere il numero di cellule per il numero di campi (cioè, 5) per normalizzare il numero di celle per ogni paziente per ogni campo.
      3. Calcolare la percentuale delle cellule di PD-1+ tra CD8 totale+ T cellule e cellule di PD-1+ Tim-3+ tra CD8 totale+ T cellule. Vedere la Figura 5 per la sintesi di questo passaggio.
        Nota: Linguaggio R (o altri software di programmazione di scelta) è necessario creare e eseguire i comandi correttamente, e quindi un utente esperto o scienziato statistico/dati è essenziale. Il programma di R in grado di calcolare i dati dello stesso paziente, ma il nome dei 5 file. txt di un paziente dovrebbe avere un inizio identico, corrispondente a un identificatore univoco di paziente.
  4. Analisi statistica
    1. Utilizzare software statistico per l'analisi statistica dei risultati.
    2. Eseguire analisi statistiche appropriate con l'aiuto di uno statistico.
      1. Uso il Wilcoxon non parametrica firmato rank test per il confronto di PD-1 MFI tra due fenotipi cellulari (Figura 6). Correlare la covariata e le caratteristiche istologiche con test chi quadrato di Pearson, un.
      2. Utilizzare un metodo di Kaplan-Meier per stimare la sopravvivenza libera da progressione e modelli di regressione di Cox per stimare gli effetti di covariata sui risultati di tempo all'evento, come la sopravvivenza globale e sopravvivenza libera da malattia.
      3. Considera p-valori inferiori a 0.05 come significativi.

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Risultati

Mediante il protocollo generale descritto sopra, abbiamo mirato a quantificare intratumoral CD8+ T cellule cheesprimono recettori inibitori PD-1 e Tim-3 nei tessuti congelati da pazienti con RCC e di correlare i risultati con gli esiti clinici25.

Ottimizzazione della colorazione CD8/PD-1/Tim-3:

Diverse specie di antic...

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Discussione

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:

La qualità del tessuto è un parametro importante; può essere facilmente controllato tramite colorazione ematossilina ed eosina.

Uno dei vantaggi della tecnica è la possibilità di stainings multiplex, ma per evitare fluoroforo spillover, consiglia di scegliere lunghezze d'onda di emissione con delta di minimo 10 nm. Qui, perché abbiamo avuto 4 stainings compreso DAPI, abbiamo scelto stendere le lunghezze d'...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Labex Immuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET), Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Parigi Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET). EdG è stato finanziato da una borsa di studio della Fondation ARC. EV e CD sono stati finanziati da un sodalizio di APHP (bourse année recherche). ChB è finanziato da una borsa di studio dell'Université Sorbonne Parigi Cité (contrat doctoral). Gli autori ringraziano la Bristol Myers Squibb per il loro finanziamento in questo progetto. Gli autori ringraziano il reparto di patologia dell'Hôpital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e Gisèle Legall). Gli autori ringraziano la piattaforma di istologia del PARCC, Hôpital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vectra 3 Imaging patologico quantitativo automatizzato Perkin ElmerCLS142338
analisi cellulare inForm 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen penna di delimitazioneDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS CompresseTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 compresse
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7,6 100 compresse
Sistema di blocco della biotinaDakoX0590Avidin 0,1% e Biotina 0,01%
siero d'asino normaleJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. concentrazione
Fluoroshield con DAPISigma-aldrichF60571,5 &; concentrazione g/mL
Vetrino coprioggetti in vetro KnittelGlä ser,10003924x60 mm 100 vetrini coprioggetto
Coniglio anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055utilizzo a 4µ g/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NATabcamab52587uso a 2 µ g/mL
Capra anti-Tim-3R& DAF2365utilizzo a 3 & micro; g/mL
Coniglio anti-PD-L1 Clone SP142Roche7309457001utilizzare a 1 µ g/mL
Topo AF647 marcato pan- Clone di cheratina C11Segnalazione cellulare4528utilizzare a 0,5 &; micro; g/mL
Capra anti-umano gal9R& DAF2045utilizzo a 0,3 µ g/mL
Cyan 5 asino coniugato anti-coniglioJackson Immunoresearch711-175-152uso a 5 µ g/mL
di F(ab' biotinilato 2) asino anti-topo IgGJackson Immunoresearch715-066-150uso a 3 µ g/mL
Alexa Fluor488 asino coniugato anti-capra IgGabcamab150133uso a 5 µ g/mL
di streptavidina marcata con Cy3AmershamPA43001l'uso a 3 µ g/mL
mouse a controllo negativo IgG1DakoX0931uso a 2 µ g/mL
di IgG dal siero di capraSigma-aldrichI5256uso a 3 µ g/mL
di IgG dal siero di coniglioSigma-aldrichI5006uso a 4µ g/mL

Riferimenti

  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
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