Studiando il microambiente tumorale può identificare biomarcatori prognostici o predittivi della risposta clinica all'immunoterapia. Presentato qui, è un metodo innovativo basato su in situ di fluorescenza multispectral imaging per analizzare e contare automaticamente varie sottopopolazioni di CD8+ T cellule. Questa tecnica riproducibile ed affidabile è adatta per analisi di grande gruppo.
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Articolo metodologico
Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule immunitarie sono componenti importanti del microambiente tumorale e influenzano la crescita del tumore e l'evoluzione in tutte le fasi di carcinogenesi. In particolare, è ora ben stabilito che il sistema immunitario si infiltrano in tumori umani possono correlare con prognosi e risposta alla terapia. L'analisi del sistema immunitario infiltrarsi nel microambiente tumorale è diventata una sfida importante per la classificazione dei pazienti e la risposta al trattamento.
La co-espressione di recettori inibitori quali programma delle cellule morte Protein 1 (PD1; anche conosciuto come CD279), citotossica dei linfociti T Associated Protein 4 (CTLA-4), T-cellula immunoglobulina e mucina contenente proteine-3 (Tim-3; anche conosciuto come CD366) e dei linfociti Attivazione genica 3 (Gal-3; anche conosciuto come CD223), è un segno distintivo dell'esaurimento delle cellule T. Abbiamo sviluppato una multiparametrica in situ l'immunofluorescenza che macchia per identificare e quantificare a livello cellulare il co-espressione di questi recettori inibitori. Su una serie retrospettiva di tessuto congelato dei carcinoma delle cellule renali (RCC), utilizzando una tecnologia di imaging multispettrale fluorescenza accoppiato con un software di analisi di immagine, è stato trovato che il co-espressione del PD-1 e Tim-3 il tumore infiltrante CD8+ T cellule è correlata con una prognosi difficile in RCC. A nostra conoscenza, questo rappresenta il primo studio che dimostra che questo automatizzato tecnologia multiplex in situ può avere qualche rilevanza clinica.
Introduzione
Negli ultimi anni, l'immunoterapia è emerso come un trattamento molto promettente per molti tipi di cancri, compreso il controllo delle chiamate remote. In particolare, l'immunoterapia basata sull'inibizione di punti di controllo inibitori come PD-1 e CTLA-4 è stato segnalato per essere clinicamente efficace1,2,3,4,5, 6. anticorpi monoclonali contro CTLA-4, PD-1, o programma morte Ligand 1 (PD-L1) sono già approvati in parecchi cancri e portare a lunga durata le risposte c....
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato etico locale (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consenso informato è stato ottenuto dal partecipante incluso nelle coorti.
1. tessuto materiale
- Raccogliere campioni di tessuto RCC il giorno dell'intervento. Gestire l'esemplare chirurgico a temperatura ambiente (reparto di patologia).
- Raccogliere un campione di tumore di circa 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm taglia in un tubo secco. Snap congelamento in azoto liquido e conservato a-80 ° C.
- Rivestire i campioni a temperatura ottimale di taglio composto. Sezio....
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Risultati
Mediante il protocollo generale descritto sopra, abbiamo mirato a quantificare intratumoral CD8+ T cellule cheesprimono recettori inibitori PD-1 e Tim-3 nei tessuti congelati da pazienti con RCC e di correlare i risultati con gli esiti clinici25.
Ottimizzazione della colorazione CD8/PD-1/Tim-3:
Diverse specie di antic.......
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Discussione
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
La qualità del tessuto è un parametro importante; può essere facilmente controllato tramite colorazione ematossilina ed eosina.
Uno dei vantaggi della tecnica è la possibilità di stainings multiplex, ma per evitare fluoroforo spillover, consiglia di scegliere lunghezze d'onda di emissione con delta di minimo 10 nm. Qui, perché abbiamo avuto 4 stainings compreso DAPI, abbiamo scelto stendere le lunghezze d'.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Labex Immuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET), Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Parigi Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET). EdG è stato finanziato da una borsa di studio della Fondation ARC. EV e CD sono stati finanziati da un sodalizio di APHP (bourse année recherche). ChB è finanziato da una borsa di studio dell'Université Sorbonne Parigi Cité (contrat doctoral). Gli autori ringraziano la Bristol Myers Squibb per il loro finanziamento in questo progetto. Gli autori ringraziano il reparto di patologia dell'Hôpital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurian....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vectra 3 Imaging patologico quantitativo automatizzato | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| analisi cellulare inForm 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen penna di delimitazione | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Compresse | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 compresse |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7,6 100 compresse |
| Sistema di blocco della biotina | Dako | X0590 | Avidin 0,1% e Biotina 0,01% |
| siero d'asino normale | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentrazione |
| Fluoroshield con DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1,5 &; concentrazione g/mL |
| Vetrino coprioggetti in vetro Knittel | Glä ser,100039 | 24x60 mm 100 vetrini coprioggetto | |
| Coniglio anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | utilizzo a 4µ g/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | uso a 2 µ g/mL |
| Capra anti-Tim-3 | R& D | AF2365 | utilizzo a 3 & micro; g/mL |
| Coniglio anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | utilizzare a 1 µ g/mL |
| Topo AF647 marcato pan- Clone di cheratina C11 | Segnalazione cellulare | 4528 | utilizzare a 0,5 &; micro; g/mL |
| Capra anti-umano gal9 | R& D | AF2045 | utilizzo a 0,3 µ g/mL |
| Cyan 5 asino coniugato anti-coniglio | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | uso a 5 µ g/mL |
| di F(ab' biotinilato 2) asino anti-topo IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | uso a 3 µ g/mL |
| Alexa Fluor488 asino coniugato anti-capra IgG | abcam | ab150133 | uso a 5 µ g/mL |
| di streptavidina marcata con Cy3 | Amersham | PA43001 | l'uso a 3 µ g/mL |
| mouse a controllo negativo IgG1 | Dako | X0931 | uso a 2 µ g/mL |
| di IgG dal siero di capra | Sigma-aldrich | I5256 | uso a 3 µ g/mL |
| di IgG dal siero di coniglio | Sigma-aldrich | I5006 | uso a 4µ g/mL |
Riferimenti
- Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
- Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37
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