Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule

Summary

Studiando il microambiente tumorale può identificare biomarcatori prognostici o predittivi della risposta clinica all'immunoterapia. Presentato qui, è un metodo innovativo basato su in situ di fluorescenza multispectral imaging per analizzare e contare automaticamente varie sottopopolazioni di CD8⁺ T cellule. Questa tecnica riproducibile ed affidabile è adatta per analisi di grande gruppo.

Abstract

Le cellule immunitarie sono componenti importanti del microambiente tumorale e influenzano la crescita del tumore e l'evoluzione in tutte le fasi di carcinogenesi. In particolare, è ora ben stabilito che il sistema immunitario si infiltrano in tumori umani possono correlare con prognosi e risposta alla terapia. L'analisi del sistema immunitario infiltrarsi nel microambiente tumorale è diventata una sfida importante per la classificazione dei pazienti e la risposta al trattamento.

La co-espressione di recettori inibitori quali programma delle cellule morte Protein 1 (PD1; anche conosciuto come CD279), citotossica dei linfociti T Associated Protein 4 (CTLA-4), T-cellula immunoglobulina e mucina contenente proteine-3 (Tim-3; anche conosciuto come CD366) e dei linfociti Attivazione genica 3 (Gal-3; anche conosciuto come CD223), è un segno distintivo dell'esaurimento delle cellule T. Abbiamo sviluppato una multiparametrica in situ l'immunofluorescenza che macchia per identificare e quantificare a livello cellulare il co-espressione di questi recettori inibitori. Su una serie retrospettiva di tessuto congelato dei carcinoma delle cellule renali (RCC), utilizzando una tecnologia di imaging multispettrale fluorescenza accoppiato con un software di analisi di immagine, è stato trovato che il co-espressione del PD-1 e Tim-3 il tumore infiltrante CD8⁺ T cellule è correlata con una prognosi difficile in RCC. A nostra conoscenza, questo rappresenta il primo studio che dimostra che questo automatizzato tecnologia multiplex in situ può avere qualche rilevanza clinica.

Introduction

Negli ultimi anni, l'immunoterapia è emerso come un trattamento molto promettente per molti tipi di cancri, compreso il controllo delle chiamate remote. In particolare, l'immunoterapia basata sull'inibizione di punti di controllo inibitori come PD-1 e CTLA-4 è stato segnalato per essere clinicamente efficace^{1,2,3,4,5, 6}. anticorpi monoclonali contro CTLA-4, PD-1, o programma morte Ligand 1 (PD-L1) sono già approvati in parecchi cancri e portare a lunga durata le risposte c....

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal comitato etico locale (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consenso informato è stato ottenuto dal partecipante incluso nelle coorti.

1. tessuto materiale

1. Raccogliere campioni di tessuto RCC il giorno dell'intervento. Gestire l'esemplare chirurgico a temperatura ambiente (reparto di patologia).
2. Raccogliere un campione di tumore di circa 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm taglia in un tubo secco. Snap congelamento in azoto liquido e conservato a-80 ° C.
3. Rivestire i campioni a temperatura ottimale di taglio composto. Sezio....

Results

Mediante il protocollo generale descritto sopra, abbiamo mirato a quantificare intratumoral CD8⁺ T cellule cheesprimono recettori inibitori PD-1 e Tim-3 nei tessuti congelati da pazienti con RCC e di correlare i risultati con gli esiti clinici²⁵.

Ottimizzazione della colorazione CD8/PD-1/Tim-3:

Diverse specie di antic.......

Discussion

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:

La qualità del tessuto è un parametro importante; può essere facilmente controllato tramite colorazione ematossilina ed eosina.

Uno dei vantaggi della tecnica è la possibilità di stainings multiplex, ma per evitare fluoroforo spillover, consiglia di scegliere lunghezze d'onda di emissione con delta di minimo 10 nm. Qui, perché abbiamo avuto 4 stainings compreso DAPI, abbiamo scelto stendere le lunghezze d'.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vectra 3 Imaging patologico quantitativo automatizzato	Perkin Elmer	CLS142338
analisi cellulare inForm 2.1.	Perkin Elmer	CLS135781
R software	https://www.r-project.org
Dakopen penna di delimitazione	Dako	S2002
Tris Buffer Salin TBS Compresse	Takara, Bio Inc.	TAKT9141Z	pH7.6 100 compresse
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)	Takara, Bio Inc.	TAKT9142Z	pH 7,6 100 compresse
Sistema di blocco della biotina	Dako	X0590	Avidin 0,1% e Biotina 0,01%
siero d'asino normale	Jackson Immunoresearch	017-000-001	5% vol./vol. concentrazione
Fluoroshield con DAPI	Sigma-aldrich	F6057	1,5 &; concentrazione g/mL
Vetrino coprioggetti in vetro Knittel	Glä ser,100039		24x60 mm 100 vetrini coprioggetto
Coniglio anti-CD8 Clone P17-V	novus	NBP1-79055	utilizzo a 4µ g/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NAT	abcam	ab52587	uso a 2 µ g/mL
Capra anti-Tim-3	R& D	AF2365	utilizzo a 3 & micro; g/mL
Coniglio anti-PD-L1 Clone SP142	Roche	7309457001	utilizzare a 1 µ g/mL
Topo AF647 marcato pan- Clone di cheratina C11	Segnalazione cellulare	4528	utilizzare a 0,5 &; micro; g/mL
Capra anti-umano gal9	R& D	AF2045	utilizzo a 0,3 µ g/mL
Cyan 5 asino coniugato anti-coniglio	Jackson Immunoresearch	711-175-152	uso a 5 µ g/mL
di F(ab' biotinilato 2) asino anti-topo IgG	Jackson Immunoresearch	715-066-150	uso a 3 µ g/mL
Alexa Fluor488 asino coniugato anti-capra IgG	abcam	ab150133	uso a 5 µ g/mL
di streptavidina marcata con Cy3	Amersham	PA43001	l'uso a 3 µ g/mL
mouse a controllo negativo IgG1	Dako	X0931	uso a 2 µ g/mL
di IgG dal siero di capra	Sigma-aldrich	I5256	uso a 3 µ g/mL
di IgG dal siero di coniglio	Sigma-aldrich	I5006	uso a 4µ g/mL