Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione non invasiva della competenza di sviluppo dell'oocita eseguita durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale per la fase di metafase II. Questo metodo combina immagini time-lapse con particle image velocimetry (PIV) e analisi di rete neurale.

Abstract

Cliniche per l'infertilità trarrebbe vantaggio dalla possibilità di selezionare inerente allo sviluppo competente vs incompetente ovociti utilizzando procedure non invasive, migliorando così il risultato complessivo di gravidanza. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di classificazione basato sull'osservazione diretta al microscopio oocytes del mouse durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale (GV) per la fase di metafase II, seguita dall'analisi dei movimenti citoplasmatici che si verificano durante questo periodo di time-lapse. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di questa procedura. Gli ovociti sono isolati da follicoli antrali adulte e coltivati per 15 h all'interno di un microscopio equipaggiato per l'analisi time-lapse a 37 ° C e 5% CO₂. Immagini sono prese ad intervalli di 8 min. Le immagini vengono analizzati utilizzando il metodo di Particle Image Velocimetry (PIV) che calcola, per ogni prelievo di ovociti, il profilo delle velocità di movimento citoplasmatica (CMVs) che si verificano durante tutto il periodo di cultura. Infine, il CMVs di ogni singolo ovocita sono alimentati attraverso uno strumento di classificazione matematica (rete neurale Feed-forward, FANN), che predice la probabilità di un gamete essere inerente allo sviluppo competente o incompetente con una precisione di 91.03%. Questo protocollo, impostare per il mouse, potrebbe ora essere testato su ovociti di altre specie, compreso gli esseri umani.

Introduction

Infertilità femminile è una patologia che colpisce un numero crescente di donne. Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, circa il 20% delle coppie sono infertili, con un 40% a causa di infertilità femminile. In aggiunta, un terzo delle donne che subiscono trattamenti contro il cancro (300.000/anno e 30.000/anno negli USA o in Italia, rispettivamente) sviluppare insufficienza ovarica prematura.

Una strategia per prevenire l'infertilità in malati di cancro è l'isolamento e la crioconservazione dei follicoli ovarici prima del trattamento oncologico, seguita da maturazione in vitro (IVM) di ovociti GV alla fase MII (transizione GV-a-MII). La disponibilità di marcatori non invasivi di competenza di sviluppo dell'ovocita migliorerebbe la fertilizzazione e processi di sviluppo e il generale gravidanza successo^1,2.

Basato sulla loro configurazione cromatinica osservato dopo colorazione con fluorocromo supravital Hoechst 33342, mammiferi adulti ovociti sono classificati come un nucleolo circondato (SN) o un nucleolo non circondato (NSN)³. Oltre a loro nell'organizzazione cromatinica diversi, questi due tipi di ovociti visualizzano molte differenze morfologiche e funzionali^{3,4,5,6,7,8 ,9}, tra cui la loro competenza meiotica e inerente allo sviluppo. Quando isolato dall'ovaia e maturato in vitro, entrambi tipo di ovociti raggiungono la fase MII e dopo l'inseminazione di spermatozoi, sviluppare alla fase 2 celle, ma solo quelli con un'organizzazione della cromatina SN può sviluppare a termine⁹. Anche se buono come un metodo di classificazione per la selezione competente vs incompetente ovociti, lo svantaggio principale è l'effetto mutageno che il fluorocromo stesso e, soprattutto, la luce UV utilizzato per la sua individuazione potrebbe avere sulle cellule.

Per tutte queste ragioni, abbiamo cercato altri marcatori non invasivi associati con la conformazione cromatinica SN o NSN che potrebbe sostituire l'uso di Hoechst pur mantenendo la stessa accuratezza di classificazione alta. L'osservazione di time-lapse di citoplasmico velocità di movimento (CMVs) sta emergendo come una caratteristica distintiva dello stato della cella. Ad esempio, recenti studi hanno dimostrato che l'associazione fra CMVs registrato al momento della fecondazione e la capacità di mouse e zigoti umani di preimpianto completo e pieno-termine sviluppo^10,11.

Basato su questi studi precedenti, descriviamo qui una piattaforma per il riconoscimento del mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente ovociti adulto^5,6,7,8. La piattaforma è basata su tre fasi principali: 1) ovociti isolati da follicoli antrali prima vengono classificati in base alla loro configurazione della cromatina sia come un nucleolo circondato (SN) o un nucleolo non-circondato (NSN); 2) time-lapse immagini di CMVs che si verificano durante la transizione di GV-a-MII di ogni singolo ovocita vengono presi ed analizzati con particle image velocimetry (PIV); e 3) i dati ottenuti con PIV sono analizzati con un Feed-forward artificiale Neural Network (FANN) per classificazione cieco^12,13. Diamo dettagli delle fasi più critiche della procedura progettata per il mouse per renderlo pronto disponibile per essere testato e utilizzato per altre specie di mammiferi (ad es., bovino, scimmie e gli esseri umani).

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso e comitati etici presso Università di Pavia. Animali sono stati mantenuti in condizioni di 22 ° C, umidità 60 %) e un ciclo luce/buio di 12:12 h.

1. ovaia isolamento

1. Iniettare per via intraperitoneale 2 quattro a undici settimana-vecchio femminili topi CD1 con 10 U di ormone follicolo-stimolante con una siringa da insulina 1 mL sterile.
2. Attendere 46-48 h.
3. Pesare il mouse e anestetizzare con un'iniezione intramuscolare di 50 mg/kg di Zoletil (Tiletamina e Zolazepan cloridrato). Eutanasia di dislocazione cervicale.
4. Afferrare la pelle che copre la parete addominale usando un paio di pinze per dissezione. Tagliare la pelle e la parete del corpo con un paio di forbici e aprite l'incisione con il forcipe.
5. Utilizzando un paio di pinzette, spostare le budella a parte, i corni uterini di individuare e localizzare le ovaie alle loro estremità.
6. Delicatamente tenere l'ovaia usando pinze orologiaio e usare le forbici per tagliare il legamento all'utero. Ripetere con l'altra ovaia.
7. Trasferire le ovaie raccolte in una capsula di Petri cultura 35 mm cella contenente 1 mL di M2 isolamento medio pre-riscaldato a 37 ° C, 5% CO₂ presente nell'aria.
8. Rimuovere il grasso e l'ovidotto utilizzando forbici bene sotto un microscopio stereoscopico.

2. isolamento di complessi cumulo degli ovociti

1. Perforare la superficie ovarica utilizzando pinzette sterili e un ago da insulina sterile 1G fino a complessi di antral cumulo degli ovociti (COC) passivamente vengono rilasciati.
2. Raccogliere i contraccettivi orali combinati con più di tre strati di cellule del cumulo utilizzando una controllata bocca tirata a mano Pasteur micropipetta (200 µm di diametro) e trasferirli in una goccia di 300 µ l di terreno di M2 nuovo.
3. Rimuovere le cellule del cumulo che circondano gli ovociti utilizzando una micropipetta Pasteur tirata a mano (80 µm di diametro) pipettando delicatamente dentro e fuori per alcuni secondi,
4. Ripetutamente trasferire ovociti da una goccia di 20 µ l di M2 medium ad un altro, fino a quando le cellule del cumulo sono completamente eliminate.

3. classificazione basata sull'organizzazione degli ovociti cromatina

1. Preparare soluzione colorante Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 0,05 µ g/mL in M2 media a partire da una soluzione madre di 5 mg/mL diluito in PBS 1X.
2. Posizionare 3,5 µ l micro gocce di Hoechst macchiatura soluzione nella parte inferiore di un coperchio di scatola di Petri di 35 mm.
3. Trasferire ogni singolo ovocita in una goccia di colorazione di Hoechst, posizionare il piatto su una piastra di riscaldamento pre-riscaldata (37 ° C) e coprire con un coperchio scuro per evitare esposizione luce.
4. Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, è necessario osservare gli ovociti con un microscopio a fluorescenza a 10 ingrandimenti alla luce UV (330-385 nm), per non più di 1-2 s.
5. Classificare gli ovociti come un nucleolo circondato (SN) (Figura 1A), se presentano un anello della cromatina di Hoechst-positiva che circonda il nucleolo.
6. Classificare gli ovociti come un nucleolo non circondato (NSN), se loro nucleolo non è circondato da cromatina Hoechst-positivo e spettacoli disperdono heterochromatic macchie all'interno del nucleo (Figura 1B).

4. neural Network-Based ovocita classificazione

1. Preparare quattro 2 µ l gocce di medium di α-MEM supplementato con siero bovino fetale inattivati 5%, 2 mM L-Glutammina, taurina di 5 mM, penicillina U/mL 100, 75 µ g/mL di streptomicina e 23,5 µ µ g/l sodio piruvato in un bicchiere da 35 mm inferiore di Petri e coprirli con pre-riscaldata (37 ° C) e l'olio minerale pre-equilibrato per evitare l'evaporazione media.
   Nota: Se si utilizza un sistema di screening cellulare dal vivo, mantenere le gocce a una distanza specifica utilizzando una griglia disegnata di 7 x 7 mm come linea guida.
2. Trasferimento 3 - 4 ovociti ad ogni goccia.
3. Inserire il fondo di vetro di Petri in un sistema cellulare-proiezione live, dotato di software di registrazione time-lapse (Vedi Tabella materiali), che permette l'osservazione di maturazione degli ovociti in un ambiente con temperatura stabile (37 ° C) e CO₂ concentrazione (5%).
4. Aprire il software di registrazione time-lapse. Sullo schermo viene visualizzata una finestra con una ripresa dal vivo dell'ovocita sul lato sinistro e tutti i pulsanti di impostazione sul lato destro.
5. Selezionare il centro dell'ovocita per posizionarlo al centro dello schermo. Se necessario, regolare la messa a fuoco.
6. Selezionare il pulsante di Ph e impostata la Lampada diametro 192; il tempo di esposizione di 1/125 s; il guadagno - 1,99; e la risoluzione di 1600 x 1200.
7. Selezionare FL2 e impostare la Lampada diametro a 5; il tempo di esposizione di 3 s; il guadagno - 2,37; e la risoluzione di 1600 x 1200.
8. Selezionare il pulsante New punto al fine di registrare la posizione di ovocita all'interno della goccia di cultura. Ripetere la stessa routine per ogni ovocita all'interno della goccia di cultura.
9. Selezionare ora e impostare il ciclo di acquisizione a 8 min e il tempo totale di 15 h.
10. Selezionare Start Time-lapse per avviare il ciclo di registrazione.
11. Aprire il software MATLAB e scrivere >>cell_piv; e quindi selezionare lo Strumento di PIV.
12. Scegliere la cartella contenente il film registrato e selezionare i file. jpeg per caricare la sequenza intera immagine. Per ogni ovocita, selezionare la regione di interesse (ROI) facendo lo strumento selezione area.
13. Nel menu File, selezionare Processo PIV . Selezionare il pulsante Strumento Visualizzatore .
    Nota: Il programma consente di calcolare i vettori di velocità all'interno il ROI e produce automaticamente un file di dati salvato in un file. mat.
14. Selezionare il file. mat da aprire. Selezionare il pulsante strumento ROI selezionare e disegnare un cerchio attorno al contorno dell'ovocita. Scegliere Salva dal menu File.
    Nota: I vettori in questa regione sono ora visualizzati e i dati di media grandezza nella finestra del grafico aggiornato per questo nuovo ROI.
15. Aperto i dati raccolti in magnitudine dei frame intero time-lapse registrati in un foglio di calcolo, con le righe, la sequenza di fotogrammi e, sulle colonne, ogni singolo ovocita analizzato.
16. Organizzare i dati degli ovociti sia NSN e SN in 10 sottogruppi.
17. Utilizzare 9 sottogruppi per addestrare la rete neurale feed-forward artificiale in modo iterativo (FANN) e 1 sottogruppo per blind test.
    1. Ripetere un altro 9 volte, cambiando il campione di prova cieco (10 volte la convalida incrociata).
18. Aprire MATLAB, eseguire script su misura principale e, su richiesta, inserire il nome del file con i dati di training (train.txt), il numero di ovociti NSN e SN utilizzato per la formazione e l'intervallo di time-lapse da analizzare (in genere, da telaio n. 1-2 al telaio n. 112-113).
19. Premere immettere per effettuare la formazione.
20. Inserire il nome del file con i dati di prova (test. txt).
21. Aprire il vettore test_outputs_cyt nell'area di lavoro MATLAB.
    Nota: Viene visualizzata una finestra sullo schermo che mostra, in prima fila, la probabilità di ottenere veri positivi (TP o vero NSN) e falsi positivi (FP o False NSN) per ovociti NSN e SN, rispettivamente; invece, nella seconda riga, la probabilità di ottenere falsi negativi (FN o SN False) e veri negativi (TN o vero SN) per ovociti NSN e SN, rispettivamente.
22. Utilizzare la formula: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), per calcolare la precisione FANN, espressa in percentuale.

Results

La figura 2 Mostra un rappresentanza ovocita inerente allo sviluppo competente e incompetente, rispettivamente all'inizio (GV) e alla fine della procedura IVM (MII). IVM di ovociti di topo adulto si verifica durante la coltura di 15 h. L'osservazione di time-lapse registra la progressione della meiosi e rileva gli eventi meiotici principali, tra cui il GVBD e l'estrusione del primo corpo polare.

L'a...

Discussion

Ci sono diversi passaggi critici uno dovrebbe prendersi cura di durante l'esecuzione di questo protocollo con oocytes del mouse nonché con quelle di altre specie. Una volta isolato dai loro follicoli, ovociti dovrebbero essere immediatamente trasferiti nelle gocce di registrazione, come la separazione del cumulus compagno cellule trigger l'inizio della transizione GV-a-MII. Un'eventuale modifica del presente protocollo potrebbe essere l'aggiunta di 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) al M2 mezzo utilizzato per l'isolament...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Trattamento ormonale
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Per la colorazione dell'eterocromatina degli ovociti
Coltura cellulare Petri-dish 35 mm x 10 mm	Corning	430165	Per l'isolamento di COC
EmbryoMax M2 Medium (1X), liquido, con rosso fenolo	Merck-Millipore	MR-015-D	Per l'isolamento di COC
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	Per la maturazione in vitro degli ovociti
Coltura cellulare Piastra di Petri 35 mm con fondo di vetro	WillCo	GWSt-3522	Per esperimenti di imaging
BioStation IM-LM	Nikon	MFA91001	Sistema di screening delle cellule vive
Pipetta Pasteur	Delchimica Scientific Vetreria	6709230	Per la manipolazione dei follicoli
Olio minerale	Sigma-Aldrich	M8410	Per prevenire la contaminazione e l'evaporazione media
Penicillina / Streptomicina	Life Technologies	15070063	Per prevenire la contaminazione del mezzo...
Siero Fetale Bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	Per il trucco & alfa; MEM medio
L-glutammina	Life Technologies	25030	Per il trucco e l'alfa; MEM medio
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Per il trucco e l'alfa; MEM medio
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	Per il trucco e l'alfa; Terreni MEM
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P4562	Per il trucco e l'alfa; MEM media
Zoletil (Tiletamina e Zolazepan cloridrate)	Virbac Srl	QN01AX9	Per l'anestesia dei topi
Cell_PIV software	Gentilmente fornito dal Dr. Shane Windsor, Università di Bristol, Regno Unito	-	-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	Per il calcolo numerico multi-paradigma