Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione non invasiva della competenza di sviluppo dell'oocita eseguita durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale per la fase di metafase II. Questo metodo combina immagini time-lapse con particle image velocimetry (PIV) e analisi di rete neurale.

Abstract

Cliniche per l'infertilità trarrebbe vantaggio dalla possibilità di selezionare inerente allo sviluppo competente vs incompetente ovociti utilizzando procedure non invasive, migliorando così il risultato complessivo di gravidanza. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di classificazione basato sull'osservazione diretta al microscopio oocytes del mouse durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale (GV) per la fase di metafase II, seguita dall'analisi dei movimenti citoplasmatici che si verificano durante questo periodo di time-lapse. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di questa procedura. Gli ovociti sono isolati da follicoli antrali adulte e coltivati per 15 h all'interno di un microscopio equipaggiato per l'analisi time-lapse a 37 ° C e 5% CO₂. Immagini sono prese ad intervalli di 8 min. Le immagini vengono analizzati utilizzando il metodo di Particle Image Velocimetry (PIV) che calcola, per ogni prelievo di ovociti, il profilo delle velocità di movimento citoplasmatica (CMVs) che si verificano durante tutto il periodo di cultura. Infine, il CMVs di ogni singolo ovocita sono alimentati attraverso uno strumento di classificazione matematica (rete neurale Feed-forward, FANN), che predice la probabilità di un gamete essere inerente allo sviluppo competente o incompetente con una precisione di 91.03%. Questo protocollo, impostare per il mouse, potrebbe ora essere testato su ovociti di altre specie, compreso gli esseri umani.

Introduction

Infertilità femminile è una patologia che colpisce un numero crescente di donne. Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, circa il 20% delle coppie sono infertili, con un 40% a causa di infertilità femminile. In aggiunta, un terzo delle donne che subiscono trattamenti contro il cancro (300.000/anno e 30.000/anno negli USA o in Italia, rispettivamente) sviluppare insufficienza ovarica prematura.

Una strategia per prevenire l'infertilità in malati di cancro è l'isolamento e la crioconservazione dei follicoli ovarici prima del trattamento oncologico, seguita da maturazione in vitro (IVM) di ovociti GV alla fase MII (transizione....

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso e comitati etici presso Università di Pavia. Animali sono stati mantenuti in condizioni di 22 ° C, umidità 60 %) e un ciclo luce/buio di 12:12 h.

1. ovaia isolamento

1. Iniettare per via intraperitoneale 2 quattro a undici settimana-vecchio femminili topi CD1 con 10 U di ormone follicolo-stimolante con una siringa da insulina 1 mL sterile.
2. Attendere 46-48 h.
3. Pesare il mouse e anestetizzare con un'iniezione intramuscolare di 50 mg/kg di Zoletil (Tiletamina e Zolazepan cloridrato). Eutanasia di dislocazione cervic....

Results

La figura 2 Mostra un rappresentanza ovocita inerente allo sviluppo competente e incompetente, rispettivamente all'inizio (GV) e alla fine della procedura IVM (MII). IVM di ovociti di topo adulto si verifica durante la coltura di 15 h. L'osservazione di time-lapse registra la progressione della meiosi e rileva gli eventi meiotici principali, tra cui il GVBD e l'estrusione del primo corpo polare.

L'a.......

Discussion

Ci sono diversi passaggi critici uno dovrebbe prendersi cura di durante l'esecuzione di questo protocollo con oocytes del mouse nonché con quelle di altre specie. Una volta isolato dai loro follicoli, ovociti dovrebbero essere immediatamente trasferiti nelle gocce di registrazione, come la separazione del cumulus compagno cellule trigger l'inizio della transizione GV-a-MII. Un'eventuale modifica del presente protocollo potrebbe essere l'aggiunta di 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) al M2 mezzo utilizzato per l'isolament.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Trattamento ormonale
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Per la colorazione dell'eterocromatina degli ovociti
Coltura cellulare Petri-dish 35 mm x 10 mm	Corning	430165	Per l'isolamento di COC
EmbryoMax M2 Medium (1X), liquido, con rosso fenolo	Merck-Millipore	MR-015-D	Per l'isolamento di COC
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	Per la maturazione in vitro degli ovociti
Coltura cellulare Piastra di Petri 35 mm con fondo di vetro	WillCo	GWSt-3522	Per esperimenti di imaging
BioStation IM-LM	Nikon	MFA91001	Sistema di screening delle cellule vive
Pipetta Pasteur	Delchimica Scientific Vetreria	6709230	Per la manipolazione dei follicoli
Olio minerale	Sigma-Aldrich	M8410	Per prevenire la contaminazione e l'evaporazione media
Penicillina / Streptomicina	Life Technologies	15070063	Per prevenire la contaminazione del mezzo...
Siero Fetale Bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	Per il trucco & alfa; MEM medio
L-glutammina	Life Technologies	25030	Per il trucco e l'alfa; MEM medio
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Per il trucco e l'alfa; MEM medio
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	Per il trucco e l'alfa; Terreni MEM
Piruvato di sodio	Sigma-Aldrich	P4562	Per il trucco e l'alfa; MEM media
Zoletil (Tiletamina e Zolazepan cloridrate)	Virbac Srl	QN01AX9	Per l'anestesia dei topi
Cell_PIV software	Gentilmente fornito dal Dr. Shane Windsor, Università di Bristol, Regno Unito	-	-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	Per il calcolo numerico multi-paradigma