Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Sommario

Lo studio presente descrive un metodo semplice per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione dalla leucina-ricche ripetere chinasi 2.

Abstract

Mutazioni in leucina-ricche ripetere chinasi 2 (LRRK2) sono state indicate per essere collegati con la malattia del Parkinson familiare (FPD). Poiché l'attivazione anormale di attività della chinasi di LRRK2 è stato implicato nella patogenesi del PD, è essenziale per stabilire un metodo per valutare i livelli fisiologici di attività della chinasi di LRRK2. Studi recenti hanno rivelato che LRRK2 fosforila membri della famiglia Rab GTPase, tra cui Rab10, in condizioni fisiologiche. Anche se la fosforilazione di Rab10 endogeni di LRRK2 in cellule coltivate potrebbe essere rilevata mediante spettrometria di massa, è stato difficile da rilevare a causa della scarsa sensibilità di anticorpi specifici per fosforilazione attualmente disponibili per immunoblotting Rab10. Qui, descriviamo un semplice metodo per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione di LRRK2 basato su immunoblotting utilizzando elettroforesi dodecilica del sodio solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) combinato con un tag di fosfato-associazione (P-tag), che è N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (piridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Il presente protocollo non solo fornisce un esempio della metodologia che utilizza il tag P ma consente anche la valutazione di come le mutazioni così come inibitore trattamento/amministrazione o altri fattori alterano la segnalazione a valle di LRRK2 in cellule e tessuti .

Introduzione

PD è una delle più comuni malattie neurodegenerative, che interessa principalmente i neuroni dopaminergici nel midbrain, conseguente disfunzione dei sistemi motore in persone anziane¹. Mentre la maggior parte dei pazienti sviluppano PD in maniera sporadica, ci sono famiglie di ereditare la malattia. Mutazioni in diversi geni sono state trovate per essere collegati con FPD². Uno dei geni causativi per FPD è LRRK2, in cui otto mutazioni di senso sbagliato (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T) collegate a un dominante ereditato FPD chiamato PARK8 finora sono stati segnalati^3,4,5. Diversi studi di associazione genome-wide (GWAS) di pazienti sporadici di PD sono identificati varianti genomiche del locus LRRK2 come un fattore di rischio per PD, suggerendo che l'anomalia nella funzione di LRRK2 è una causa comune di neurodegenerazione in entrambi sporadici e PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 è una grossa proteina (2.527 aminoacidi) costituito da un dominio ripetizione leucina-ricche, un Ras GTP-legante del dominio di proteine complesse (ROC), un C-terminale del dominio, un dominio della chinasi serina/treonina proteina e un dominio ripetere di WD40⁹ROC (COR). Le mutazioni di FPD otto individuare in questi domini funzionali; N1437H e R1441C/G/H/S nel dominio di ROC, Y1699C nel dominio COR, G2019S e I2020T nel dominio chinasico. Poiché la mutazione G2019S, che è trovato il più delle volte la mutazione del PD pazienti^10,11,12, aumenta l'attività della chinasi di LRRK2 da 2-3 volte in vitro¹³, è supposto che l'aumento anormale nella fosforilazione di LRRK2 overesprimessero è tossico ai neuroni. Tuttavia, è Impossibile studiare se la fosforilazione di substrati LRRK2 fisiologicamente rilevanti è alterata nei pazienti del palladio familiare/sporadici a causa della mancanza di metodi valutarla nei campioni derivati.

Fosforilazione della proteina viene generalmente rilevata dal immunoblotting o enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) utilizzando anticorpi che riconoscono specificamente lo stato fosforilato di proteine o dall'analisi di spettrometria di massa. Tuttavia, la strategia ex a volte non può essere applicata a causa delle difficoltà nella creazione di anticorpi specifici per fosforilazione. Etichettatura metabolica delle cellule con fosfato radioattivo è un'altra opzione per esaminare i livelli fisiologici di fosforilazione quando fosforilazione specifici anticorpi non sono prontamente disponibili. Tuttavia, esso richiede una grande quantità di materiali radioattivi e quindi comporta alcune attrezzature specializzate per la protezione dalle radiazioni¹⁴. Analisi di spettrometria di massa è più sensibile rispetto a questi metodi immunochimici ed è diventato popolare nell'analizzare la fosforilazione della proteina. Tuttavia, la preparazione del campione è che richiede tempo e costosi strumenti sono necessari per l'analisi.

Un sottoinsieme della famiglia Rab GTPase tra cui Rab10 e Tab8 recentemente è stato segnalato come substrati fisiologici diretti per LRRK2 basano sul risultato di analisi su larga scala fosfoproteomica¹⁵. Abbiamo quindi dimostrato che la fosforilazione Rab10 è stata aumentata da mutazioni di FPD in fibroblasti embrionali di topo e nei polmoni dei topi¹⁶di knockin. In questo rapporto, abbiamo scelto di impiegare un'elettroforesi del gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato (SDS-PAGE)-basato su metodo in cui è co-polimerizzata in gel di SDS-PAGE (tag P SDS-PAGE) per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione, una molecola di tag P perché un anticorpo altamente sensibile di Rab10 fosforilato era ancora carente. Non siamo riusciti a rilevare la fosforilazione di endogeno Tab8 a causa della scarsa selettività di anticorpi attualmente disponibili per Tab8 totale. Pertanto, abbiamo deciso di concentrarsi sulla fosforilazione di Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 alle Thr73 di posizionamento al centro della regione altamente conservata "passare II". Alta conservazione dei siti di fosforilazione tra proteine Rab potrebbe essere uno dei motivi per cui phosphospecific anticorpi riconoscendo distinte proteine Rab sono difficili da fare.

La fosforilazione di Rab8A di LRRK2 inibisce il legame di Rabin8, un fattore di scambio di nucleotide della guanina (GEF) che attiva Rab8A scambiando il PIL associato con GTP¹⁵. Fosforilazione di Rab10 e Rab8A di LRRK2 inibisce anche il legame degli inibitori di PIL-dissociazione (GDIs), che sono essenziali per l'attivazione delle proteine Rab estraendo le proteine Rab PIL associati da membrane¹⁵. Collettivamente, è supposto che la fosforilazione delle proteine Rab di LRRK2 impedisce loro di attivazione anche se il preciso meccanismo molecolare e conseguenze fisiologiche della fosforilazione rimangono poco chiare.

P-tag SDS-PAGE è stato inventato da Kinoshita et nel 2006: In questo metodo, acrilammide in covalenza è stato accoppiato con tag P, una molecola catturando fosfati con alta affinità, che copolymerized in SDS-PAGE gel¹⁷. Poiché le molecole di P-tag in un gel di SDS-PAGE ritardano selettivamente mobilità elettroforetica delle proteine fosforilate, tag P SDS-PAGE possibile separare proteine fosforilate da quelli non-fosforilate (Figura 1). Se la proteina di interesse è fosforilata su residui multipli, sarà osservata una scaletta delle bande corrispondenti alle forme differenzialmente fosforilate. Nel caso di Rab10, osserviamo soltanto una fascia spostata, che indica che Rab10 è fosforilata solo a Thr73. Il vantaggio principale di SDS-PAGE tag P sopra immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione è che Rab10 fosforilata può essere rilevato dall'immunoblotting con gli anticorpi non specifici di fosforilazione (cioè, riconoscendo Rab10 totale) Dopo essere stato trasferito sulle membrane, che è generalmente più specifico, sensibile e disponibile da fonti commerciali/accademico. Un altro vantaggio dell'utilizzo di tag P SDS-PAGE è che si può ottenere una stima approssimativa della stechiometria di fosforilazione, che è impossibile da immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione o mediante marcatura metabolica delle cellule con radioattivo fosfati.

Oltre all'uso di poco costoso tag P acrilammide e alcune piccole modifiche ad esso correlati, il presente metodo per il rilevamento di Rab10 fosforilazione di LRRK2 segue un protocollo generale di immunoblotting.Di conseguenza, dovrebbe essere semplice e facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio dove immunoblotting è una pratica abituale, con tutti i tipi di campioni tra cui proteine purificate, lisati cellulari e degli omogeneati del tessuto.

Protocollo

1. preparazione del campione per il tag P SDS-PAGE

1. Rimuovere e scartare i media dai piatti di 10 cm in cui le cellule sono coltivate con un'aspirazione e lavare le cellule con soluzione tampone fosfato di 5ml Dulbecco (DPBS) dal primo DPBS aggiunta al lato dei piatti per non disturbare lo strato delle cellule e manualmente i piatti indietro e indietro più volte.
2. Rimuovere e scartare il DPBS utilizzando un'aspirazione e aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% (p/v) diluita in DPBS e scuotere delicatamente i piatti per coprire lo strato delle cellule. Mettere i piatti in un incubatore a CO₂ (37 ° C, aria umidificata, 5% CO₂) per 5 min.
3. Dopo il pipettaggio su e giù usando una pipetta monouso per rompere le cellule di staccato, raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e misurare la densità delle cellule usando un hematocytometer sotto un microscopio¹⁸.
4. Diluire le cellule a 2,5 × 10⁵ cellule/mL con il mezzo di Eagle per di Dulbecco modificato (DMEM) completate con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Aggiungere 2 mL (5 × 10⁵ cellule) della sospensione delle cellule diluito in ciascun pozzetto di piastre da 6 pozzetti.
5. Crescere le cellule durante la notte in un incubatore a CO₂ (37 ° C, aria umidificata, 5% CO₂).
6. Trasfezione in cellule HEK293
   Nota: Se la fosforilazione di Rab10 endogeni deve essere esaminato, procedere al punto 1.7. Plasmidi utilizzati nel presente protocollo possono essere ottenuti dagli autori su richiesta. Vedere Tabella materiali per brevi informazioni e Figura S1 per il loro DNA sequenze.
   1. Aliquotare 200 µ l di DMEM in provette da 1,5 mL.
   2. In ogni provetta, aggiungere entrambi 0,266 µ g (concentrazione finale di 1,33 µ g/mL) di un plasmide che codifica HA-Rab10 e 1,066 µ g (concentrazione finale di 5,33 µ g/mL) di un plasmide codifica 3 × bandiera-LRRK2 dalle scorte di plasmide 500 µ g/mL. Quindi 4 µ l di soluzione 1 mg/mL di polyethyleneimine (disciolto in 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0) e miscelare immediatamente la soluzione nel Vortex per 5 s.
   3. Lasciare decantare le provette riposare a temperatura ambiente per 10 min e aggiungere il contenuto di un tubetto goccia a goccia per un bene usando una micropipetta. Delicatamente e manualmente rock le piastre di coltura avanti e indietro più volte per lasciare che la miscela di transfezione di diffondere in modo uniforme in tutto il pozzo.
7. Lasciate che le cellule crescono per altri 24-36 h in un incubatore a CO₂ (37 ° C, aria umidificata, 5% CO₂).
8. Se la fosforilazione di Rab10 endogeni deve essere esaminato, è possibile trattare le cellule con e senza LRRK2 inibitori per 1 h prima di lisi di cellule.
   1. Preparare soluzioni di riserva di LRRK2 inibitori sciogliendo gli inibitori in dimetilsolfossido (DMSO) a 10 mM. Si consiglia di utilizzare MLi-2 e GSK2578215A, che sono altamente specifici e potenti inibitori di LRRK2. Soluzioni di riserva archivio a-80 ° C.
   2. Preparare scorte di lavoro degli inibitori diluendo le soluzioni madri con DMSO: per MLi-2, preparare 10 µM e 30 µM per endogena e overexpressed LRRK2, rispettivamente. Per GSK2578215A, preparare 1 mM e 3 mM per endogena e overexpressed LRRK2, rispettivamente.
   3. Aggiungere 2 µ l delle scorte lavoro di MLi-2 o GSK2578215A al centro di uno bene usando una micropipetta e scuotere delicatamente la piastra manualmente avanti e indietro più volte per consentire gli inibitori diffusa in modo uniforme in tutto il pozzo.
   4. Aggiungere 2 µ l di DMSO per un ben diverso come controllo negativo in modo simile all'inibitore nel passaggio 1.8.3.
   5. Ricollocare le piastre per l'incubatrice e cultura le cellule per 1 h.
9. Lisare le cellule.
   1. Mettere le piastre di coltura sul ghiaccio. Rimuovere e scartare i media. Lavare le cellule di primo aggiungendo 2 mL DPBS al lato dei piatti per non disturbare la cella di strato e manualmente i piatti della roccia avanti e indietro parecchie volte.
   2. Rimuovere e scartare il DPBS e aggiungere le cellule 100 µ l di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 1% (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl etere, 1 mM EGTA (glicole etilenico-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico), 1 mM sodio ortovanadato, 50 mM fluoruro di sodio, β-glicerofosfato di 10mm, pirofosfato di sodio di 5 mM, 0,1 µ g/mL microcistina-LR, saccarosio 270mm, inibitore della proteasi cocktail).
   3. Inclinare le piastre sul ghiaccio e raschiare le celle utilizzando un raschietto di cella per raccogliere quanto più lysate possibile delle cellule. Raccogliere i lisati mediante una micropipetta in provette da 1,5 mL (pre-refrigerate sul ghiaccio).
      Attenzione: Microcistina-LR può essere fatale se ingerito o a contatto con la pelle.
10. Lasciare le provette in ghiaccio per 10 min per lisi completa. Chiarire i lisati mediante centrifugazione (20.000 × g, 10 min a 4 ° C) e trasferire i surnatanti in nuove provette da 1,5 mL pre-refrigerate sul ghiaccio.
11. Misurare la concentrazione di proteina (µ g / µ l) dei lisati sgomberati da analisi di Bradford.
    1. Preparare l'albumina di siero bovino (BSA) gli standard (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1 mg/mL) diluendo la soluzione di riserva con acqua distillata. Diluire i lisati di cella cancellata da 20 volte con acqua distillata.
    2. Mettere 5 µ l/pozzetto degli standard di BSA, blank (acqua distillata) e ogni cella diluito lisato in una piastra a 96 pozzetti in triplice copia.
    3. Aggiungere 150 µ l/pozzetto del reagente di analisi di Bradford utilizzando 12 canali micropipetta e lasciate la piastra riposare a temperatura ambiente per 5 min.
    4. Misurare l'assorbanza a 595 nm su un lettore di piastre e confrontare con gli standard di BSA.
12. Preparare 100 µ l di campioni per SDS-PAGE. La concentrazione di proteine dei campioni è di 1 µ g / µ l per iperespresso HA-Rab10 e 2 µ g / µ l per Rab10 endogena.
    1. Utilizzando le concentrazioni quantificate dal passaggio 1.11.4, calcolare il volume (µ l) dei lisati cellulari equivalenti a 100 µ g (iperespresso HA-Rab10) o di 200 µ g (endogeno Rab10) dividendo la quantità di proteine (100 µ g o 200 µ g) della concentrazione nella proteina di lisati (µ µ g/l).
    2. Aggiungere 25 µ l di tampone di Laemmli 4 × SDS-PAGE (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% (p/v) SDS, 40% (v/v) glicerolo, blu di bromofenolo 0.02% (p/v), 4% (v/v) β-mercaptoetanolo) in nuove provette da 1,5 mL conservate a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere il volume calcolato della cella lisati a ciascuna provetta e mescolano nel Vortex per 5 s a temperatura ambiente.
    4. Portare il volume totale a 100 µ l con il buffer di lisi e mescolare nel Vortex per 5 s a temperatura ambiente.
13. Supplemento con 10mm MnCl₂ per placare l'agente chelante. Aggiungere 1 µ l di 500mm MnCl₂. Mix nel Vortex per 5 s a temperatura ambiente.
    Nota: Campioni contenenti MnCl₂ potrebbero non essere adatti per normale SDS-PAGE.

Questo passaggio è necessario a causa della presenza dell'agente chelante (ad esempio acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), EGTA, ecc.) nel buffer di lisi. In caso contrario, Mn^{2 +} ioni accoppiati all'acrilammide tag P verranno dissociati dagli agenti chelanti, e tag P SDS-PAGE non funzionerà correttamente.

Fate bollire tutti i campioni a 100 ° C per 5 min e conservare i campioni sotto i-20 ° C fino all'utilizzo. I bollito campioni possono essere conservati fino a 6 mesi.

2. colata gel per tag P SDS-PAGE

Nota: Gel dovrebbe essere effettuate nello stesso giorno in esecuzione i gel. Gel può essere fatta in condizioni di luce ambientali.

1. Preparare soluzione stock di acrilammide 5mm tag P sciogliendo prima il 10 mg di polvere/solido tag P acrilammide completamente con 100 µ l di metanolo e quindi portare a 3,3 mL aggiungendo acqua distillata doppia.
   Nota: L'acrilammide tag P è sensibile alla luce. La soluzione preparata deve essere conservata al buio a 4 ° C fino all'utilizzo.
2. Pulito semplice e dentellate piastre spruzzando etanolo al 70% e asciugare con un tovagliolo di carta. Montare le piastre di gel. Le dimensioni delle lastre di gel utilizzate nel presente protocollo particolare sono 80 o 100 mm di lunghezza di 100 mm di larghezza. Distanziali di silicio pulito sono messo tra pianura e dentellate tavole e le tavole assemblate vengono fissate con clip legante.
   Nota: Può essere utilizzato qualsiasi tipo di lastre di gel che funzionano per ordinaria SDS-PAGE.
3. Mettere un pettine da utilizzare (pettine di plastica 17-ben) in lastre di gel di assemblati e mark la piastra di gel la posizione del fondo dei pozzetti con un pennarello indelebile.
4. Preparare 10 mL di miscela di gel di acrilamide 10% (10% (p/v) di acrilammide (acrylamide:bis-acrilammide = 29: 1), 375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 0,1% (p/v) SDS) in una provetta da 15 mL.
   Nota: La concentrazione ottimale di acrilamide può variare a seconda dei reagenti utilizzati. Tetrametiletilendiammina (TEMED) e ammonio persolfato (APS) non deve essere aggiunte a questo punto.
5. Aggiungere 100 µ l di acrilammide tag P 5 mM e 10 µ l di 1 M MnCl₂ soluzioni alle concentrazioni finali di 50 µM e 100 µM, rispettivamente.
   Nota: Le concentrazioni ottimale di acrilammide tag P e MnCl₂ potrebbero anche variare a seconda dei reagenti utilizzati.
6. Aggiungere 15 µ l di TEMED per la miscela di gel ad una concentrazione finale di 0,15% (v/v) e poi 50 µ l di 10% (p/v) APS ad una concentrazione finale di 0,05% (p/v). Miscelare accuratamente agitando delicatamente il tubo per 5 s e versare nelle piastre assemblate immediatamente fino ad un'altezza di 2 mm sotto la posizione contrassegnata al punto 2.3.
7. Delicatamente strato 2-propanolo sulla soluzione di gel per appiattire la parte superiore del gel di separazione.
8. Lasciate i gel a riposare per 30 min a temperatura ambiente. Non è necessario proteggere il gel dalla luce.
   Nota: Potrebbe richiedere più tempo per gel impostare sotto temperatura ambiente fredda. La miscela di gel di degassamento prima aggiunta di TEMED e APS consente di accelerare questo passaggio. Per questo scopo, la miscela di gel può essere preparata in una beuta da 100-200 mL connesso a un'aspirazione. Degassare la soluzione per 10 min.
9. Rimuovere gli strati 2-propanolo assorbendo con un tovagliolo di carta.
10. Lavare lo spazio superiore dei gel, riempiendo lo spazio con acqua distillata da una bottiglia di lavaggio e gettare l'acqua versando fuori nel bacino. Ripetere 3 volte di lavaggio.
11. Rimuovere l'acqua residua rimasta nello spazio superiore dei gel assorbendo con un tovagliolo di carta.
12. Preparare 3 mL di miscela di gel di acrilamide 4% (4% (p/v) di acrilammide (r: crylamide:bis-acrilammide = 29: 1), 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 0,1% (p/v) SDS) in una provetta da 15 mL.
    Nota: Non aggiungere tag P acrilammide o MnCl₂ soluzione per la miscela di gel di impilamento.
13. Aggiungere 7,5 µ l di TEMED e 24 µ l di 10% (p/v) APS alle concentrazioni finali di 0,25% (v/v) e 0,08% (p/v), rispettivamente. Miscelare bene agitando delicatamente il tubo per 5 s e versare il composto sulla superficie del gel di separazione. Immediatamente mettere pettini appropriati (pettini in plastica 17-pozzo che ospitare fino a 25 µ l di campioni, ad esempio).
14. Lasciate i gel a riposare per 30 min a temperatura ambiente. Non è necessario proteggere il gel dalla luce. Dopo il gel di impilamento impostato, è possibile eseguirli senza ulteriore deposito.

3. SDS-PAGE e Immunoblotting

1. Rimuovere i pettini dai gel. Quindi rimuovere i distanziali di silicio e quindi clip dai gel.
2. Mettere il gel colato in serbatoi di gel e fissare il gel al serbatoio di bloccaggio con la clip di legante.
3. Versare il buffer in esecuzione (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% (p/v) SDS) nella parte inferiore e superiore dei gel. Pulito pozzi di svuotamento del buffer in esecuzione utilizzando una siringa da 5 mL e un ago 21G per rimuovere pezzi di gel.
4. Rimuovere le bolle d'aria dallo spazio inferiore dei gel utilizzando un ago piegato collegato a una siringa. Per rendere un ago piegato, piegare manualmente un ago 21G al centro l'ago in modo che l'angolo tra la punta e la base dell'ago diventa 30-45 °.
5. Rotazione verso il basso precipitati causati dall'aggiunta di MnCl₂ a 20.000 × g per 1 min a temperatura ambiente per ottenere campioni chiari.
6. Caricare 10 µ g proteine per la rilevazione la fosforilazione di Rab10 iperespresso e 30 µ g proteine per Rab10 endogena.
   Nota: È fondamentale per caricare un volume uguale di campioni in tutti i pozzetti. Corsie vuote devono essere caricate con tampone di 1 × Laemmli SDS-PAGE. Se i campioni contengono MnCl₂, aggiungere la stessa concentrazione di MnCl₂ i campioni fittizi.
7. Il bene caricato con un marcatore di peso molecolare (MWM) dovrebbe anche essere completato con tampone di Laemmli 1 × SDS-PAGE: il volume dei campioni caricati è lo stesso in tutti i pozzetti.
   Nota: Ancora una volta, se i campioni contengono MnCl₂, aggiungere la stessa concentrazione di MnCl₂ per la MWM. In alternativa, può essere utilizzato un MWM privo di EDTA.
8. Eseguire gel a 50 V per l'accatastamento (circa 30 min) fino a quando la parte anteriore della tintura attraversa il gel di separazione.
9. Dopo i campioni impilare, cambiare la tensione a 120 V per la separazione, fino a quando la parte anteriore della tintura raggiunge il fondo del gel (circa 50 e 80 min per 80 e 100 mm di lunghezza gel, rispettivamente).
   Nota: Il modello di migrazione della MWM dovrebbe essere diversa da quella normale gel di SDS-PAGE. Esso non deve essere utilizzato per stimare il peso molecolare delle proteine su gel di SDS-PAGE tag P ma può essere utilizzato per verificare la riproducibilità dei gel P-tag. Per dettagli, fare riferimento alla discussione .
10. Lavare il gel per rimuovere MnCl₂ dai gel.
    1. Versare il trasferimento buffer (48 mM Tris, 39 mM glicina, 20% (v/v) metanolo) contenente 10 mM EDTA e lo 0,05% (p/v) SDS in un contenitore (ad esempio, grandi barche di pesatura).

Il volume del buffer deve essere sufficiente a coprire un gel.

Rimuovere il gel di separazione delle placche di gel e mettere un gel in un contenitore. Scartare il gel d'impilamento.

Lasciare il gel su un agitatore oscillante (~ 60 rpm) per 10 min a temperatura ambiente.

Ripetere i passaggi di lavaggio in totale 3 volte.
Nota: Utilizzare buffer fresco per ogni lavaggio.

Lavare il gel una volta per 10 min con il buffer di trasferimento contenente 0,05% (p/v) SDS per rimuovere EDTA. Il volume del buffer deve essere sufficiente a coprire un gel.

Electro-trasferimento a nitrocellulosa o polivinilidene difluoruro (PVDF) membrane utilizzando vasche di bagnato.

1. Collocare un filtro di carta (10 x 7 cm) su un tampone di spugna per il trasferimento. Collocare il gel su carta da filtro. Assicurarsi che non vi siano senza bolle d'aria tra la carta da filtro e il gel.
2. Mettere una membrana (10 x 7 cm) sul gel e assicurarsi che non siano senza bolle d'aria tra la membrana e il gel.
3. Mettere un altro filtro di carta (10 x 7 cm) sulla membrana e, ancora una volta, assicurarsi di bolle d'aria tra la membrana e la carta da filtro.
4. Mettere un altro tampone di spugna su carta da filtro. Mettere la pila di documenti/filtro a membrana in una cassetta per il trasferimento.
5. Mettere la cassetta in un serbatoio di trasferimento, assicurandosi che la membrana si trova tra il gel e l'anodo positivamente caricato.
6. Collegare il serbatoio alla rete di alimentazione e collocare il serbatoio in una scatola di schiuma di stirolo riempita con acqua ghiacciata. Avviare il trasferimento a 100 V per 180 min.
   Nota: Trasferimento prolungato è necessaria poiché il trasferimento delle proteine dal gel di SDS-PAGE tag P non sono efficienti come quello dai normali gel di SDS-PAGE. Raffreddamento efficiente è essenziale per evitare la fusione gel durante il trasferimento.

Verifica il trasferimento

1. Rimuovere le membrane dai gel con pinzette e immergere le membrane in una soluzione di Ponceau S (0,1% (p/v) Ponceau S, acido acetico al 5% (v/v)) per macchiare le proteine trasferite su membrane in un contenitore di plastica. Il volume della soluzione dovrebbe essere sufficiente a coprire una membrana.
2. Incubare le membrane per 1 min a temperatura ambiente da dondolo manualmente.
   Nota: Una scala delle bande dovrebbe diventare visibile in ogni corsia.
3. Ritirare la membrana dalla soluzione di macchiatura con pinzette e vedere se la scala delle bande ha modello uniforme e intensità in ogni corsia dove i campioni sono stati caricati.
4. Dopo aver controllato la colorazione, è necessario rimuovere la soluzione colorante e aggiungere tampone TBST (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurato). Il volume del buffer deve essere sufficiente a coprire una membrana.
   Nota: La soluzione di Ponceau S possa essere raccolta e riutilizzati più volte.
5. Roccia, le membrane in TBST su un agitatore oscillante (~ 60 giri/min) a temperatura ambiente finché non rimangono senza bande visibili sulle membrane.
6. Ripetere la fase di lavaggio con TBST fresco per 5 min.

Rimuovere e gettare il TBST. Bloccare aggiungendo latte scremato 5% (p/v) dissolto in TBST e a dondolo su un agitatore (~ 60 rpm) per 1 h a temperatura ambiente. Il volume della soluzione blocco dovrebbe essere sufficiente a coprire una membrana.

Preparare soluzioni di anticorpo primario diluendo gli anticorpi primari (anticorpo anti-Rab10 per Rab10 endogeno) e anticorpo anti-HA per HA-Rab10 overexpressed in 10 mL su membrana di soluzione bloccante (Vedi Tabella materiali per le concentrazioni).

Rimuovere e scartare la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo primario. Incubare le membrane su un agitatore oscillante (~ 60 rpm) per una notte a 4 ° C.

Rimuovere la soluzione di anticorpo primario e aggiungere TBST per lavare le membrane. Il volume del buffer deve essere sufficiente a coprire una membrana.

Incubare le membrane per 5 minuti su un agitatore oscillante (~ 60 giri/min) a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio (passo 3.16) in totale 3 volte usando TBST fresco ogni volta.

Preparare soluzioni di anticorpo secondario di diluizione anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano (HRP) in 10 mL su membrana della soluzione bloccante. Utilizzare l'anticorpo di IgG anti-coniglio marcato con HRP per membrane sondate con l'anticorpo anti-Rab10 e anticorpo di IgG anti-topo marcato con HRP per quelli sondato con l'anti-HA dell'anticorpo (Vedi Tabella materiali per concentrazione).

Rimuovere e gettare il TBST dopo il terzo lavaggio e aggiungere la soluzione di anticorpo secondario. Incubare le membrane su un agitatore oscillante (~ 60 rpm) per 1 h a temperatura ambiente.

Lavare le membrane in TBST per 10 min. Ripetere il lavaggio passo in totale 3 volte, simile al passaggio 3.17.

Sviluppare le membrane mediante chemiluminescenza (ECL).
Nota: Tempo di esposizione potrebbe variare a seconda della soluzione di ECL e il sistema usato per rilevazione di chemiluminescenza.

1. Accendere un imager dotato di una fotocamera di charge coupled device (CCD) e un computer collegato al dispositivo di imaging. Avviare il software di controllo per il dispositivo di imaging. Attendere che la temperatura della telecamera CCD ha raggiunto-25 ° C.
2. Mettere 1 mL della soluzione di ECL per una membrana in un involucro di plastica si sono diffuse su una panchina.
3. Mettere un membrana gel-side-up sulla soluzione ECL e quindi rapidamente capovolgerla modo che entrambi i lati della membrana sono rivestiti con la soluzione.
4. Prendere la membrana e scolarla lasciando un lato del tocco membrana un tovagliolo di carta per 5 s.
5. Reinserire la membrana tra pellicole trasparenti (ad es., carta chiaro tasche).
   Nota: Involucro di plastica non è raccomandato per avvolgere le membrane. Le pellicole trasparenti utilizzate per avvolgere la membrana devono essere piano il più possibile senza rughe visibili per evitare fondo irregolare.
6. Posizionare la membrana su un vassoio nero. Inserire il vassoio nella stampante e chiudere la porta.
7. Fare clic sul pulsante "Focusing" nella finestra del software di controllo. Controllare che la membrana sia posizionata correttamente. Fare clic sul pulsante "Return".
8. Selezionare "Precisione" per "Tipo di esposizione". Selezionare "Manuale" per "Tempo di esposizione" e impostare il tempo di esposizione di 1 s.
9. Selezionare "Alto" per "Sensibilità/risoluzione". "Aggiungi immagine di digitalizzazione" lasciare deselezionata. Fare clic sul pulsante "Start" per prendere un'immagine.
10. Salvare l'immagine che apparsa sul display nel computer come file TIFF.
11. Ripetere immagini che con il tempo di esposizione da 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s e fino a 180 s. Quando prende l'ultima immagine, controllare "Aggiungi immagine di digitalizzazione" così l'immagine digitale, non la chemiluminescenza, della membrana può essere assunto contemporaneamente.
12. Selezionare l'immagine migliore con la più ampia gamma dinamica e senza eventuali pixel saturante (mostrato in rosso) nelle bande di interesse.
    Nota: Le pellicole di raggi x convenzionali possono essere utilizzati anche per rilevamento¹⁹.

Risultati

Sistema di sovraespressione: Fosforilazione di HA-Rab10 da 3 × bandiera-LRRK2 in HEK293 celle:

Cellule HEK293 transfected con 0,266 µ g di HA-Rab10 wild-type e 1,066 µ g di 3 × bandiera-LRRK2 (wild-type, chinasi-inattivo mutante (K1906M), o FPD mutanti). Fosforilazione di Rab10 è stata esaminata da tag P. SDS-PAGE seguita da immunoblotting utilizzando un anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g di proteine...

Discussione

Qui, descriviamo un metodo facile e robusto di rilevazione Rab10 fosforilazione di LRRK2 a livelli endogeni basata sulla metodologia P-tag. Poiché l'anticorpo attualmente disponibile contro fosforilato Rab10 funziona solo con proteine overexpressed¹⁵, il presente metodo utilizzando tag P SDS-PAGE è l'unico modo per valutare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione. Inoltre, il presente metodo consente la stima della stechiometria di Rab10 fosforilazione nelle cellule. Perché la metodologia P-tag...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	fatto in casa		150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in acqua MilliQ e sterilizzato in autoclave
Cloruro di sodio	Nacalai Tesque	31320-34
Sodio disodico idrogenofosfato 12-Acqua	Wako	196-02835
Cloruro di potassio	Wako	163-03545
Potassio diidrogeno fosfato	Wako	169-04245
2,5% Tripsina (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	Diluire 10 volte con DPBS sterile per la preparazione della soluzione
di lavoroDulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Siero fetale bovino	BioWest	S1560	Inattivato a caldo a 56 ° C per 30 min
Penicillina-Streptomicina (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Idrossido di sodio	Wako	198-13765
Polietilenimmina HCl MAX, lineare, Mw 40.000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	soluzione madre è stata preparata in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 a 1 mg/mL e il pH è stato quindi regolato a 7.0 con NaOH
Dimetil solfossido	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Acido cloridrico	Wako	080-01066
Poliossietilene(10) Ottilfenil etere	Wako	160-24751	Equivalente a Triton X-100
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)	Wako	346-01312
Ortovanadato di sodio(V)	Wako	198-09752
Fluoruro di sodio	Kanto Chemical	37174-20
β-Acido glicerofosforico Sale disodico Pentaidrato	Nacalai Tesque	17103-82
Sodio pirofosfato decaidrato	Kokusan Chemical	2113899
Microcystin-LR	Wako	136-12241
Saccarosio	Wako	196-00015
Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche	11873580001	Sciogliere una compressa in 1 ml di acqua, che può essere conservata a -20 ° C per un mese. Usalo a diluizione 1:50 per la lisi cellulare
Kit di analisi delle proteine Pierce Coomassie (Bradford)	Thermo Fisher Scientific	23200
Sodio dodecil solfato	Nacalai Tesque	31607-65
Glicerolo	Wako	075-00616
Blu di bromofenolo	Wako	021-02911
β-mercaptoetanolo	Kanto Chemical	25099-00
Etanolo	Wako	056-06967
Metanolo	Wako	136-01837
Etichetta legante il fosfato acrilammide	Wako	AAL-107	P-tag acrilammide
40% (p/v) soluzione acrilammidica	Nacalai Tesque	06119-45	Acrilammide:Bis = 29:1
Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
persolfato di ammonio (APS)	Wako	016-08021	al 10% (p/v) è stata preparata sciogliendo la polvere di persolfato di ammonio in acqua MilliQ
2-propanolo	Wako	166-04831
Cloruro di manganese tetraidrato	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	Marcatore di peso molecolare utilizzato nel protocollo
WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0.45	GE Healthcare	10600007	Membrana in nitrocellulosa
Filtro a membrana Durapore	EMD Millipore	GVHP00010	Membrana PVDF
Carte filtranti n. 1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
Acido acetico	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	poliossietilenesorbitano monolaurato
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Wako	345-01865
Latte scremato in polvere	Difco Laboratories	232100
Immunostar	Wako	291-55203	Soluzione ECL (sensibilità normale)
Immunostar LD	Wako	290-69904	Soluzione ECL (Alta sensibilità)
Soluzione colorante CBB	fatta in casa		1 g CBB R-250, metanolo al 50% (v/v), acido acetico al 10% (v/v) in 1 litro di acqua MilliQ
CBB R-250	Wako	031-17922
Decolorazione CBB soluzione	fatta in casa		12% (v/v) metanolo, 7% (v/v) acido acetico in 1 L MilliQ acqua
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpi
anti-HA anticorpo	Sigma-Aldrich	11583816001	Usato a 0,2 μ g/mL per l'immunoblotting.
anti-Rab10 anticorpo	Cell Signaling Technology	#8127	Utilizzato a 1:1000 per l'immunoblotting. La specificità è stata confermata da CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.
anticorpo anti-pSer935	Abcam	ab133450	Usato a 1 μ g/mL per l'immunoblotting.
anticorpo anti-LRRK2	Abcam	ab133518	Usato a 1 μ g/mL per l'immunoblotting.
anticorpo anti-&alfa;-tubulina	Sigma-Aldrich	T9026	Usato a 1 μ g/mL per l'immunoblotting.
anticorpo anti-GAPDH	Santa-Cruz	sc-32233	Usato a 0,02 μ g/mL per l'immunoblotting.
Perossidasi AffiniPuro IgG di Pecora Anti-Topo (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	Usato a 0,16 μ g/mL per l'immunoblotting.
Perossidasi AffiniIgG anti-coniglio di capra pura (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Utilizzato a 0,16 μ g/mL per l'immunoblotting.
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Inibitori
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	è stata preparata in DMSO a 10 mM e conservata a -80 ° C
MLi-2	Fornito dal Dott. Dario Alessi (Università di Dundee)		La soluzione madre è stata preparata in DMSO a 10 mM e conservata a -80 gradi; C
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Plasmidi
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA	Fornito dal Dr. Dario Alessi (Università di Dundee)		Questo plasmide esprime Rab10 umano marcato con HA amino-terminale.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Ito et al., Biochimica, 46: 1380– 1388 (2007). Questo plasmide esprime amino-terminale 3xFLAG-taged wild-type umano LRRK2.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Ito et al., Biochimica, 46: 1380– 1388 (2007). Questo plasmide esprime un mutante inattivo della chinasi K1906M marcato con 3xFLAG amino-terminale di LRRK2 umano.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			Questo documento. Questo plasmide esprime il mutante FPD N1437H marcato con 3xFLAG amino-terminale di LRRK2 umano.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963– 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale 3xFLAG-taged R1441C FPD di LRRK2 umano.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963– 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale 3xFLAG-taged R1441G FPD di LRRK2 umano.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963– 10975 (2013). Questo plasmide esprime amino-terminale il mutante R1441H FPD marcato con 3xFLAG di LRRK2 umano.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			Questo documento. Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale R1441S FPD marcato con 3xFLAG di LRRK2 umano.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal Dr Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963– 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Y1699C FPD amino-terminale marcato con 3xFLAG di LRRK2 umano.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal dottor Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963– 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante FPD G2019S marcato con 3xFLAG amino-terminale di LRRK2 umano.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Fornito dal dottor Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochimica, 48: 10963– 10975 (2013). Questo plasmide esprime il mutante Amino-terminale 3xFLAG-taged I2020T FPD di LRRK2 umano.
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Equipments
CO2 incubatore	Thermo Fisher Scientific Forma	Series II 3110 Pipetta automatica con rivestimento
	Drummond	Pipet-Aid PA-400
Micropipetta P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5– 10 μ
L Micropipetta P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20– 200 μ
L Micropipetta P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100– 1000 μ
L Puntali per micropipetta P10	STAR	RST-481LCRST	Puntali sterili
per micropipetta P200	FUKAEKASEI	1201-705YS	Puntali sterili
per micropipetta P1000	STAR	RST-4810BRST	Pipetta monouso sterile
da 5 mL	Greiner	606180	Pipetta monouso sterile
da 10 mL	Greiner	607180	Pipetta sterile
da 25 mL		Falcon	357535
	Sunlead Glass	A126	Microscopio Neubeuer migliorato
	Olympus	CKX53
Piastre da 10 cm	Falcon	353003	Per coltura tissutale
Piastre a 6 pozzetti	AGC Techno Glass	3810-006	Per coltura
tissutaleMiscelatore a vortice	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
raschiatori cellulari	Sumitomo bachelite	MS-93100
Provette da 1,5 mL	STAR	RSV-MTT1.5
Provette da 15 mL	AGC Techno Glass	2323-015
Provette da 50 mL	AGC Techno Glass	2343-050
Centrifughe	TOMY	MX-307
piastre a 96 pozzetti	Greiner	655061	Non per coltura tissutale
Lettore di piastre	Molecular Devices	SpectraMax M2e
SDS– Serbatoi PAGE	Nihon Eido	NA-1010
Serbatoi di trasferimento	Nihon	Eido NA-1510B
Piastre in gel (dentellate)	Nihon Eido	NA-1000-1
Piastre in gel (piatte)	Nihon Eido	NA-1000-2
Distanziatori in silicone	Nihon Eido	NA-1000-16
pettini a 17 pozzetti	Nihon Eido	Su
Clip per legante	Nihon Eido	NA-1000-15
Siringa da 5 ml	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Centrale elettrica 1000 VC	ATTO	AE-8450	Alimentatore per SDS– PAGINA e trasferimento
Grandi barche di pesatura	Ina Optika	AS-DL
Contenitori in plastica	COME UNA	VALIGETTA PS N.4	10 x 80 x 50 mm
Agitatore a dondolo	Titech	NR-10
Scatola in schiuma di stirene	generica		Le dimensioni interne devono contenere un serbatoio di trasferimento (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		Un imager dotato di una telecamera CCD raffreddata per il rilevamento dell'ECL