Articolo metodologico

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

DOI:

10.3791/56761

⸱

16 giugno 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un modello animale è necessario per decifrare il ruolo di fare circolare le cellule del tumore (CTCs) nel promuovere la colonizzazione del polmone durante la metastasi del cancro. Qui, abbiamo stabilito ed effettuato con successo un in vivo analisi specificamente prova il requisito dell'Assemblea polimerici fibronectina (polyFN) su CTCs per colonizzazione del polmone.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metastasi è la principale causa di morte per cancro. Il ruolo di fare circolare le cellule del tumore (CTCs) nel promuovere la metastasi del cancro, in cui la colonizzazione del polmone da CTCs criticamente contribuisce ai primi processi metastatici del polmone, è stato studiato vigorosamente. Come tale, modelli animali sono l'unico approccio che cattura il processo completo sistemico della metastasi. Dato che i problemi si verificano a precedenti progetti sperimentali per l'esame i contributi di CTCs allo stravaso del vaso sanguigno, abbiamo stabilito un dosaggio di colonizzazione del polmone in vivo in cui un lungo-termine-fluorescenza cellulare-elemento tracciante, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), è stato utilizzato per marcare le cellule del tumore sospesi e perfusione polmonare è stato effettuato per deselezionare non specifico intrappolati CTCs prima della rimozione del polmone, imaging confocale e quantificazione. Polimerica fibronectina (polyFN) montata su superfici CTC è stata trovata per mediare la colonizzazione del polmone nello stabilimento finale dei tessuti del tumore metastatico. Qui, per verificare in particolare il requisito dell'Assemblea polyFN su CTCs per colonizzazione del polmone e dello stravaso, abbiamo effettuato brevi saggi di colonizzazione del polmone in cui sospensione di cellule di carcinoma del polmone di Lewis (LLC) che esprimono FN-shRNA (shFN) o Scramble-shRNA (shScr) e pre-etichettata con 20 μM di CFSE per via endovenosa sono state inoculate in topi C57BL/6. Abbiamo dimostrato con successo che le abilità delle cellule LLC shFN a colonizzare i polmoni del mouse sono state diminuite significativamente rispetto alle cellule LLC di shScr. Pertanto, questa metodologia a breve termine può essere ampiamente applicata per specificamente dimostrare la capacità di CTCs all'interno la circolazione di colonizzare i polmoni.

Introduzione

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La metastasi è la causa principale di cancro morte1,2. Le cellule tumorali derivate da tessuti primari entrano nella circolazione in sospensione e sopravvivono varie sfide ematogena, ad es., anoikis, immuni assalti e danni dovuti a sollecitazione di taglio da pressione sanguigna o vincoli geometrici, prima che siano in grado di colonizzare organi distanti, un passo fondamentale dettare il successo di metastasi3,4,5,6. Pertanto, attualmente sono stati compiuti sforzi vigorosi nella caratterizzazione di cellule tumorali circolanti (CTC) e la correlazione di queste caratteristiche con malignità del tumore, metastasi e tassi di sopravvivenza del cancro pazienti7,8 , 9. dal momento che il processo della metastasi del cancro in particolare rappresenta un evento in vivo , modelli animali sono l'unico approccio che cattura il processo completo sistemico di metastasi10,11,12 .

CTCs diventano tessuti del tumore metastatico attraverso molteplici eventi cellulari tra cui la colonizzazione di organi distanti1,2. Tuttavia, le metastasi più comunemente utilizzati saggi13,14,15 non forniscono un modo per osservare la colonizzazione di CTC di organi distanti. Pertanto, un progetto di assay in vivo per la visualizzazione di colonizzazione del CTC è urgentemente necessaria. Sebbene diversi in vivo ed ex vivo breve svantaggi, problemi e colonizzazione del polmone di termine sono state progettate le analisi rimangono. Per esempio, mentre la proteina fluorescenza verde (GFP)-overesprimenti tumore le cellule sono state utilizzate in questi saggi22,23, ci vuole tempo per stabile transfect e clonare le cellule del tumore con sufficiente intensità di fluorescenza di GFP sotto il microscopio. Allo stesso modo, anche se transitoria macchiatura delle cellule del tumore con il tracciante di cella di lungo termine CFSE è stata impiegata per sostituire le cellule del tumore che esprimono GFP, rimane difficile giudicare se le cellule del tumore con etichetta CFSE sono allegate o semplicemente presente all'interno del vascolarizzazione del asportato organi distanti16,17.

Polimerica fibronectina (polyFN) montata su superfici di CTCs è stata trovata per contribuire criticamente alla creazione finale di tumore metastatico tessuti18,19,20,21,22 . Qui, abbiamo effettuato brevi saggi di colonizzazione del polmone in cui cellule di carcinoma del polmone (LLC) Lewis sospese stabilmente esprimendo FN-shRNA (shFN) o scramble-shRNA (shScr) e pre-etichettata con CFSE per via endovenosa sono state inoculate in topi C57BL/6. Dopo 2-3 giorni, i polmoni del mouse in primo luogo sono stati irrorati con tamponato fosfato salino (PBS) per rimuovere completamente slegato CTCs all'interno del vasculature prima di essere sottoposto a microscopia confocal e quantificazione di colonizzazione del polmone LLCs. Abbiamo chiaramente dimostrato che i numeri di colonizzazione del polmone shFN LLCs e noduli del tumore sono stati ridotti significativamente in confronto con shScr LLCs, sostanzialmente che confermano il ruolo dell'Assemblea polyFN su CTCs nel facilitare la colonizzazione e la crescita di CTCs nella polmoni. Il nostro studio necessita di ulteriore indagine per il ruolo di polyFN nella metastasi del cancro.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti secondo le linee guida del nostro Istituto (la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, NCKU Medical College).

1. preparazione di strumenti, mezzi di coltura e piatti

  1. Prima di iniziare i protocolli sperimentali, ottenere le suture chirurgiche sterili, siringhe da 1 mL con ago 26G/0,5 cm (per l'iniezione della vena della coda), 3 mL siringhe con ago 24G/3 cm (per perfusione polmonare), per volta Eagle Media (DMEM di Dulbecco), soluzione di tripsina-EDTA (5 g/L tripsina e 0,53 mM), siero bovino fetale (FBS), 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2PHO4e 1,8 mM KH2PO4) e piastre di coltura di 6 cm.

2. preparazione e recupero delle cellule del tumore in sospensione

  1. Preparare per volta Eagle Media (DMEM di Dulbecco sterile) contenente 10% o 20% FBS e aggiungere appena 2 mM L-Glutammina, 1x PBS e 0.05% tripsina-EDTA.
  2. Coltura le cellule in DMEM supplementato con 10% FBS a 37 ° C e farle crescere fino a quando c'è il 70-80% confluenza nella piastra di coltura.
  3. Rimuovere il supporto di cultura (DMEM) dai piatti, seguiti da due lavaggi con 2 mL di PBS 1X sterile.
  4. Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina-EDTA nei piatti per coprire completamente tutte le celle. Immediatamente rimuovere 800 μL di soluzione e lasciare solo 200 μL nei piatti. Incubare le piastre a 37 ° C per 30 s a 1 min (a seconda del tipo di cella) e attendere che la maggioranza delle cellule è in stato di sospensione.
  5. Aggiungere 1 mL di fresco DMEM contenente 10% FBS direttamente nei piatti per interrompere l'attività enzimatica della tripsina e vigorosamente pipetta la sospensione cellulare su e giù con una pipetta di 1000 µ l per preparare una sospensione di singola cellula.
  6. Trasferire le cellule dal piatto una microcentrifuga da 1,5 mL e rotazione verso il basso le celle a temperatura ambiente a 162 x g per 3 min.
  7. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule del tumore in 1,5 mL DMEM contenente 20% FBS e over fine ruotare le cellule in sospensione a 37 ° C per 2 h.
    Nota: Se il mezzo diventa giallo durante il recupero, scambiare il vecchio mezzo con medium fresco contenente 20% FBS.

3. fluorescenza macchiatura e l'analisi delle cellule del tumore in sospensione con Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

  1. Dopo il recupero delle cellule in sospensione, contare il numero di cellule vitali appropriato con Trypan Blue in un Neubauer camera per titolazione fluorescenza macchiatura dosi di conteggio e per coda venosa iniezione.
  2. Rotazione verso il basso le cellule a 162 x g a temperatura ambiente per 3 min e risospendere che le cellule pellettate in 1 mL di sterilizzato 1X PBS, seguita da centrifugazione di temperatura ambiente a 162 x g per 3 min.
  3. Risospendere le cellule pellettate in 500 µ l di 1X PBS contenente 10% FBS e 0, 5, 10, 20 o 40 µM CFSE per titolazione della dose e incubare la sospensione cellulare a 37 oC per 10 min al buio.
  4. Rotazione verso il basso le cellule a 162 x g a temperatura ambiente per 3 min e risospendere le cellule pellettate con 4 mL di DMEM contenente 1% FBS. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte di più. Risospendere le cellule pellettate con 4 mL di DMEM da solo per il lavaggio finale.
  5. Le cellule di CFSE-etichettato ad fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS) per quantificare l'intensità di fluorescenza di una singola cella o iniezione della vena della coda.
    Nota: Mantenere le cellule sul ghiaccio prima di eseguire le iniezioni di vena FACS analisi o coda.

4. polmone colonizzazione Assay

  1. Preparare le cellule identificate con 20 µM CFSE (vedere 3.1 passaggi attraverso 3.4).
    Nota: Decidere la dose di lavoro di CFSE per l'etichettatura di cellule del tumore, sulla base dei risultati di titolazione dall'analisi FACS (Vedi punto 3.3).
  2. Scaldare le code di 4-6 settimana-vecchi topi C57BL/6 maschi (6 topi) con una lampada ad alogenuri per 5-10 min su una base di mouse-di-mouse per dilatare le vene di coda di topo.
  3. Mischiare attentamente ed aspirare le cellule del tumore CFSE-etichettati con una siringa da 1 mL (26Gx1/2), evitando qualsiasi bolle in sospensione delle cellule (con una densità di cella finale di 5 x 106 cellule/mL).
  4. Attentamente iniettare 1 x106 di cellule tumorali con etichetta CFSE 200 µ l di DMEM nella vena della coda del mouse, che dovrebbe essere presentata in un dispositivo di ritenuta del mouse.
    Nota: Durante l'iniezione, se l'ago viene inserito direttamente nel lume della vena della coda, le cellule del tumore dovrebbero essere facilmente consegnate nella circolazione senza la necessità di spingere forte sulla siringa. Se è difficile spingere le cellule del tumore attraverso, esse sono state iniettate molto probabilmente di fuori della vena caudale, nello spazio sottocutaneo.
  5. Dividere i topi che per via endovenosa hanno ricevuto le cellule del tumore con etichetta CFSE in due gruppi: un gruppo subirà perfusione polmonare seguita mediante microscopia confocale e quantificazione di ImageJ nel dosaggio di colonizzazione del polmone e l'altro sarà lasciato da solo per 4-5 analisi di settimane nella colonizzazione del polmone di lungo termine.
  6. 20, 38 o 45 h e con le cellule del tumore di 1 x 106 iniettate per via endovenosa durante una titolazione del corso - e dose-dipendente di tempo, anestetizzare i topi del tumore-cuscinetto con zoletil 50-75 mg/kg 50, che è un anesthetizer ben accettato e corretto23.
    Nota: Unguento uso veterinario sugli occhi di topi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  7. Tagliare longitudinalmente la pelle ed i tessuti sottocutanei dall'addome alla regione toracica con forbici chirurgiche. Aprire la cavità pleurica con forbici e pinze per esporre completamente il cuore ed i polmoni.
    Nota: Fare attenzione a evitare il taglio dei vasi sanguigni.
  8. Legare la vena cava superiore (SVC) e la vena cava inferiore (IVC) con punti di sutura chirurgici sterili per evitare il riflusso della soluzione di perfusione durante la perfusione polmonare.
  9. Tagliare la parete del ventricolo di sinistra con forbici chirurgiche per aprire una fessura (circa 2-4 mm) per drenare la soluzione di perfusione dai polmoni.
  10. Iniettare 1X PBS nel ventricolo di destra con una siringa da 3 mL e rimuovere la soluzione drenata con aspirazione costante durante la perfusione polmonare fino a quando i polmoni girare da un colore rossastro a completamente pallido.

5. confocale Imaging microscopica e l'analisi delle cellule del tumore del polmone-colonizzato

  1. Rimuovere i polmoni ora-pale dalla cavità pleurica e separare i cinque lobi tagliando via i legamenti trachea e tessuto connettivo con forbici e pinze chirurgiche24.
  2. Preparare un supporto barella-come polmone come illustrato in Figura 3B avvolgendo una sutura in nylon attorno a due aste metalliche per produrre una struttura reticolata con uno spazio tra le due barre per il posizionamento dei lobi del polmone. Impostare titolare del polmone in un piatto di 6 cm.
    Nota: Il titolare del polmone verrà essere utilizzato per stabilizzare i lobi del polmone sotto la lente dell'obiettivo di un microscopio confocale.
  3. Lodge e difficoltà i lobi del polmone sulla trama reticolata del titolare del polmone. Coprire e inumidire i lobi del polmone con 1x PBS.
  4. Soggetto il piatto di cultura di 6 cm che harboring i lobi del polmone sul titolare del polmone alla microscopia confocale per catturare le immagini di fluorescenza registrazione le cellule del tumore del polmone-colonizzazione.
  5. Per l'imaging, utilizzare lenti dell'obiettivo (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, aria).
  6. Girare la manopola del filtro di NIBA (eccitazione/emissione; 470-495 nm/510-550 nm) e utilizzare un laser a 488 nm per eccitare CFSE, chiaramente visualizzare immagini di puntini di fluorescenza nei lobi del polmone.
  7. Ruotare la ruota portafiltri per R690 (per MaiTai HP Bosumtwi laser) per eseguire la scansione con 2.0 µs/pixel di scansione veloce e ottimizzate l'HV, guadagno e offset livelli.
  8. Catturare immagini di fluorescenza (512 x 512 pixel) utilizzando il software di microscopio con un 10 µs/pixel velocità di scansione.
  9. Quantificare e analizzare statisticamente le immagini al microscopio usando ImageJ e GraphPad software come descritto in precedenza21.

6. lungo termine saggi di colonizzazione del polmone

Nota: Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.5.

  1. Sacrificare i topi dopo l'inoculazione delle cellule del tumore per 4-5 settimane e fissare i loro polmoni con liquido di Bouin25 per 1-2 giorni.
  2. Quantificare e analizzare statisticamente i noduli del tumore dai polmoni di topi con software21.

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Risultati

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Prima dell'esecuzione del saggio di colonizzazione del polmone in vivo come illustrato in Figura 1A per verificare se polyFN sulle cellule del tumore sospensione media la colonizzazione del polmone e/o stravaso nel facilitare la metastasi, abbiamo prima titolato diversi concentrazioni di CFSE, un composto fluorescente che è cellula permeabile e legame covalente coniugati intracellulari contenenti molecole26,

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Discussione

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Insieme con le analisi colonizzazione polmonare a lungo termine, breve termine metodologia qui abbiamo impiegato per valutare in vivo la colonizzazione del polmone da CTCs in organi distanti chiaramente svelato e differenziato il ruolo specifico di polyFN montato su CTCs nella colonizzazione i polmoni, che poi ha portato alla stravaso e processi metastatici18,19,20,21. Anche se etichet...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Dr. Ming-Min Chang e MS. Cheng Ya-Hsin per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Ministero della scienza e della tecnologia di Taiwan (la maggior parte-103-2325-B-006-009, la maggior parte-104-2325-B-006-001, la maggior parte-105-2325-B-006-001 e MOST-106-2320-B-006-068-MY3) e il Ministero della salute e benessere (MOHW106-TDU-B-211-144004). Inoltre siamo grati per il sostegno dal Core Research Laboratory dell'Università di medicina, National Cheng Kung University, per loro multi-fotone al microscopio confocale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale
Albumina sierica bovina ( BSA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-9048-46-8
Bouin's FluidMCC (società chimica medica)/POISON456-A-1GL
CFSE Proliferation Dyeebiosciences65-0850-85Nome completo: Carbossifluoresceina succinimidil estere
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) (Gibco)ThermoFisher Scientific12100-061
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-6381-92-6Per soluzione preparata di tripsina-EDTA (concentrazione finale: 0,53 mM) 
Siero fetale bovino (FBS)(Gibco)ThermoFisher Scientific10437-028
Carcinoma polmonare di Lewis (LLC)ATCC, Manassas, VA, USACRL-1642
L-Glutammina, USP (Gibco)ThermoFisher Scientific21051-024
Cloruro di potassio (KCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7447-40-7Per preparato 1X PBS ( Concentrazione finale: 2,7 mM )
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7778-77-0Per preparato 1X PBS ( Concentrazione finale: 1,8 mM )
Sodio cloruro (NaCl)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-7647-14-5Per preparato 1X PBS ( Concentrazione finale: 137mM )
Sodio fosfato bibasico (Na2HPO4)Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan)101-10039-32-4Per preparato 1X PBS ( Concentrazione finale: 10mM )
Trypan BlueSigma AldrichT61460,5 g mescolare con 100 mL 1X PBS
TrypsinSigma AldrichT4799Per soluzione preparata di tripsina-EDTA ( Concentrazione finale: 5g/L )
Zoletil 50VirbacDa diluire con 1X PBS 
NameAziendaNumero di catalogoComments
>Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420KUBOTA Co.2420
Piatto di coltura (6cm)Wuxi NEST Biotechnology Co.
Siringa monouso (con ago)Perfect Medical Industry Co.24G/3 cm; 3 ml & 26G/0,5 cm; 1 ml
Miscelatore End over EndC.T.I YOUNG CHENNTS-20Per il recupero di cellule sospese 
FACSCalibur (FACS)BD biosciences
PinzeDimeda10.102.14
Forma Calore diretto CO2 incubatoreThermo Fisher Scientific Inc.HEPA CLASS 100
Mouse reholder (Cylindrical Resrain, 15-30 gm)Stoelting51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WIOlympusFV1000MPE
Neubauer camera di conteggioMarienfeld-Superior640010
Forbice chirurgicaDimeda08.370.11
Suture chirurgiche UNIK SUTURE CHIRURGICHE MFG. CO.NO. 0034Seta intrecciata nera; non assorbibile (25YD; U.S.P. 4/0)Provetta
microcentrifuga da 1,5 mLWuxi NEST Biotechnology Co.
provetta Greiner da 15 mLGreiner bio-one188271
705001 per 615001

Riferimenti

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