Articolo metodologico

Un'analisi semplice e a basso costo per la misurazione della deambulazione in modelli murini di distrofia muscolare

DOI:

10.3791/56772

⸱

29 dicembre 2017

 , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, 2Center for Duchenne Muscular Dystrophy, University of California, 3Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, 4Molecular Biology Institute, University of California

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un sistema flessibile, a basso costo per la misurazione della deambulazione del mouse in un'analisi di attività di campo aperto. Vi mostriamo un saggio di deambulazione di 6 minuti basato su questo sistema rileva una diminuzione nel movimento volontario nei topi mdx che distingue accuratamente miglioramento in un salvataggio di muscolo-specific di questi animali.

Abstract

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Misurazione dei risultati funzionali nel trattamento della distrofia muscolare è un aspetto essenziale del test preclinici. La valutazione della deambulazione volontaria in modelli murini è un saggio di attività non-invasivo e riproducibile che è direttamente analoga alle misure del paziente deambulazione come il 6-minute walk test e relativi punteggi di mobilità. Molti metodi comuni per il test di velocità di deambulazione del mouse e distanza sono basati sul test di campo aperto, dove la libera circolazione di un animale all'interno di un'arena è misurata nel tempo. Uno svantaggio principale di questo approccio è che il software commerciale e attrezzature per il tracciamento del movimento ad alta risoluzione sono costosa e possono richiedere il trasferimento di topi a strutture specializzate per il test. Qui, descriviamo un sistema a basso costo, basati su video per la misurazione della deambulazione del mouse che utilizza il software libero e open-source. Usando questo protocollo, dimostriamo che volontaria della deambulazione nel modello del topo del dystrophin-null mdx per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è diminuita rispetto al mouse di selvaggio-tipo attività. In mdx topi che esprimono il transgene di utrofina, questi deficit di attività non vengono osservati e la distanza totale percorsa è indistinguibile da topi wild-type. Questo metodo è efficace per misurare i cambiamenti nel ambulation volontario associato a patologia distrofica e fornisce una piattaforma versatile che può essere facilmente adattata alle impostazioni di ricerca diversi.

Introduzione

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Misurazioni affidabili e riproducibili di funzione muscolare sono fondamentali per valutare l'efficacia delle terapie potenziali per la DMD. DMD è una malattia genetica causata da mutazioni nel gene della distrofina, che conduce alla debolezza muscolare progressiva, perdita della deambulazione ed eventuale insufficienza cardiorespiratoria. Il modello animale più ampiamente usato di DMD è il mouse dystrophin-null mdx . Una batteria di test funzionali sono emersi come analisi di routine per valutare la progressione di malattia nel topo mdx così come in modelli animali simili di altre distrofie e miopatie. Comunemente usato in vivo analisi includono misurazioni della forza di presa della zampa anteriore, filo appeso tempo, massimo rotarod, ora ad esaurimento durante il rilevamento delle attività in esecuzione e motore tapis roulant. C'è stato un notevole sforzo nel campo per standardizzare questi test, con l'obiettivo di riduzione della variabilità tra gli studi preclinici e aumentando il potenziale traslazionale di terapeutica testato in topi1,2.

Una categoria importante di test preclinici è la misura del movimento volontario, un parametro che è frequentemente alterato in modelli murini di distrofia muscolare. Questo solitamente è testato da saggi basati su campo aperto attività di monitoraggio e può valutare orizzontale (a piedi) o movimenti verticali (allevamento) sopra un corso di minuti o ore2,3,4. Una serie di studi hanno dimostrato il movimento volontario per essere alterata in topi mdx , particolarmente dopo l'esercizio, e queste misurazioni hanno dimostrate di essere sensibili alla progressione di malattia e trattamento di droga. Uno dei principali limiti nell'esecuzione di queste analisi è la necessità di apparecchiature specializzate, ad alto costo. Qui, viene presentato un metodo di basso costo che tiene traccia della deambulazione del mouse utilizzando risorse prontamente disponibili.

La distanza di 6 minuti a piedi è una metrica comunemente usata come uno strumento di valutazione clinica in individui con la distrofia muscolare di Duchenne5,6. Le modifiche di questa misura sono state usate per valutare i risultati in modelli animali di Duchenne, compresi di topi mdx 7 e documentalista dorato distrofia muscolare (GRMD) cani8. In questo studio, registriamo il movimento volontario campo aperto in 6 minuti subito dopo una sfida di esercizio mite. Distanza di deambulazione è stata quindi calcolata utilizzando software open-source gratuito per misurare il movimento orizzontale nel corso del tempo.

Il vantaggio principale di questo metodo è che gli animali possono essere testati in una varietà di impostazioni senza bisogno di attrezzature specializzate o software commerciale ad alto costo per l'analisi. Un aspetto importante di questa analisi è che può essere eseguita in un ambiente di laboratorio di base senza la necessità di spostare o trasferire i topi fuori il vivarium in una struttura specializzata. Il protocollo di rilevamento video descritto qui è particolarmente adatto per la valutazione della deambulazione relativamente a periodi di tempo breve e può rilevare differenze di attività tra topi wild-type e mdx , nonché miglioramento funzionale in un salvataggio di rivelare modello di DMD.

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Protocollo

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I metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la University of California, Los Angeles e istituzionali Animal Care. Wild-type (C57BL/6J) e topi mdx (C57Bl/10ScSn sfondo) sono stati acquistati da una fonte commerciale. MDX: topi di utrofina-Tg erano un regalo da James Ervasti, con il permesso di Kay Davies ed erano tenuti sullo sfondo mdx . Analisi della deambulazione sono stati effettuati su topi maschi a 6 mesi di età. Topi sono stati mantenuti nel Vivarium di Life Sciences Terasaki seguendo le linee guida stabilite dalla cura istituzionale degli animali e uso Committee presso la University of California, Los Angeles (approvazione n. 2000-029-43) e l'approvazione per questi studi fu concesso dal UCLA Animal Welfare Assurance (approvazione n #A3196-01).

1. preparazione della camera

  1. Eseguire la raccolta di dati in una stanza tranquilla, temperatura controllata in un preciso istante del giorno9. Eseguire i test in cieco per il genotipo e il trattamento del mouse in fase di test.
  2. Adattarsi a qualsiasi sistema di alloggiamento del campo aperto per questa analisi.
    Nota: In questo studio, usiamo una camera di registrazione poco costoso e facilmente trasportabile costruita da un grande cestino. L'arena di campo aperto è un vassoio impostato su una gabbia o la piattaforma sopraelevata simile.
  3. Posizionare la fotocamera su una rete metallica sopra la camera di registrare tutta l'arena completo.
  4. Pulire la camera di registrazione con disinfettante prima di ogni prova.

2. pre-allenamento protocollo e raccolta dati

  1. Facoltativamente, immediatamente prima dell'attività di registrazione, è possibile sfidare ogni mouse con un protocollo di attivazione muscolare.
    Nota: Questo è facoltativo ma consigliato in esperimenti su topi mdx .
    1. Consentire il mouse per afferrare la sbarra di trazione di un dinamometro digitale e tirare delicatamente indietro fino a quando la barra di tiro viene rilasciata. Ripetere questa procedura cinque volte al trial.
    2. Tensione di picco record (N) per ogni prova.
      Nota: Oltre a servire come una sfida di esercizio per l'analisi della deambulazione, la forza esercitata dall'animale durante questo test di forza di presa può essere utilizzata come un ulteriore risultato funzionale misura2,10.
    3. Eseguire cinque prove totale per ogni mouse con 1 min di riposo tra ogni prova.
  2. Subito dopo il test di forza di presa o altro protocollo di esercizio, posizionare il mouse nella camera di attività.
  3. Avviare la registrazione video del movimento del mouse nell'arena da camera. Consentire il mouse per esplorare liberamente per 6 min.
  4. Interrompere la registrazione a 6 min e tornare il mouse alla sua gabbia a casa.

3. video analisi

  1. Facoltativamente, preparare video per analisi di riduzione della frequenza fotogrammi. Al fine di ridurre la frequenza fotogrammi per analisi di rilevamento, utilizzare il seguente protocollo in un software di video editing (ad es., iMovie o programma simile) per decimare il frame rate video di un fattore 2.
    Nota: A seconda della lunghezza e frame rate del video, può essere utile per ridurre la frequenza di fotogrammi video prima dell'analisi. In questo studio, il video è stato registrato a 30 fotogrammi/s (6 min di registrazione, totale circa 10.800 fotogrammi).
    1. Caricare il video nel software.
    2. Sotto il menu 'Speed', selezionare ' velocità: veloce ' e impostare la velocità a 2x.
    3. Esportare il video decimato in formato file. MP4 per tenere traccia delle analisi.
  2. Aprire il video per l'analisi con il programma. Impostare la taratura per la video registrazione utilizzando lo strumento linea. Disegnare una linea lungo un lato della camera. Fare clic con il pulsante destro sulla linea e selezionare "Calibra misura..." Immettere la dimensione effettiva del lato camera in centimetri.
  3. Per iniziare il rilevamento semi-automatizzato della posizione del mouse, fare clic sul cursore 'Sposta'.
    A partire dal fotogramma iniziale nel video, fare clic destro sul punto da rilevare; il punto di rilevamento è segnato con un cerchio blu.
    Nota: Nello studio presente, la posizione di ogni animale è stata registrata da rintracciare la base della coda.
  4. Far avanzare il fotogramma cliccando la freccia destra sulla tastiera; il punto di rilevamento dovrebbe spostare automaticamente basato sulla posizione della base della coda.
    1. Se la posizione di rilevamento non è allineata con il punto di interesse in un determinato frame, allineare manualmente il cerchio blu alla base della coda.
      Nota: A seconda della qualità del video e la velocità del mouse, il rilevamento può richiedere i livelli variabili di input dell'utente per mantenere l'allineamento con il punto di interesse. Il percorso del mouse dovrebbe avanzare attraverso il corso del video.
  5. Quando rintracciare il video completo è completa, salva la sovrapposizione video e tracciatura. Esportare i dati posizionali del ricalco selezionando "Esporta per foglio di calcolo".

4. analisi dei dati

  1. Aprire i dati posizionali in un programma di software di foglio di calcolo. Il software di analisi di movimento segnala che la X, Y coordinare la posizione del mouse in ogni fotogramma.
  2. Per calcolare la distanza percorsa dalla cornice, utilizzare la seguente equazione (dove è la posizione nella cornice uno x1, y1 e pagina due è x2, y2):
    figure-protocol-1
    Nota: Distanza percorsa nel tempo può essere calcolato sommando la distanza percorsa tra ogni fotogramma.

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Risultati

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Variazioni del dosaggio campo aperto hanno dimostrati di essere un metodo efficace per testare la progressione di malattia nei modelli della distrofia muscolare. Qui, dimostriamo un video versatile inseguimento del metodo per l'analisi del movimento del mouse bidimensionale utilizzando apparecchiature di registrazione prontamente disponibili e software open source (Figura 1A–B). Coerente con i risultati riportati da simili do...

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Discussione

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Il dosaggio di campo aperto consente di testare la funzione motoria in modelli murini di malattia del muscolo in modo efficace e non invasivo, e variazioni di questo test possono servire come una misura di endpoint prezioso per studi pre-clinici. Uno dei principali limiti con questo tipo di analisi è l'accessibilità ad alto costo e limitato di sistemi di monitoraggio delle attività. In questo studio, dimostriamo un sistema a basso costo per l'analisi di attività di campo aperto che possono generare risultati simili a sof...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health [AR048179 R01 e R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 e F32 AR069469to E.M.G] e la distrofia muscolare Association USA [274143 e 416364 di RCW].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
VideocameraApple Inc.ME553LL/APer la registrazione di video di deambulazione, iPhone 5S Plus (o equivalente)
Software Kinovea (versione 0.8.15)Kinovea AssociationSoftware di analisi video open source. Scaricare gratis, PC compatibile (versione 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (versione 10.0.6)Apple Inc.Qualsiasi software simile può essere utilizzato per ridurre la frequenza dei fotogrammi video (opzionale)
Cestino rotondo nero da 32 galloni Roughneck (camera a campo aperto)Rubbermaid# 1778013Qualsiasi sistema a camera a campo aperto può essere adattato per la registrazione. Questo studio utilizza una camera di registrazione costruita da un vassoio su una piattaforma, sul fondo di un grande bidone della spazzatura.
Vassoio in plastica bianca Avant 15"L x 10"P x 1,45"H (camera a campo aperto)US Acrylic, LLCQualsiasi sistema di camera a campo aperto può essere adattato per la registrazione. Questo studio utilizza una camera di registrazione costruita da un vassoio su una piattaforma, sul fondo di un grande bidone della spazzatura.
C57BL/6JJackson Laboratory#000664Topi maschi di 6 mesi
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)Jackson Laboratory#001801Topi maschi di 6 mesi
mdx: utrophin-Tg (fiona)Regalo da James Ervasti, con il permesso di Kay DaviesTopi maschi di 6 mesi

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
  2. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  3. Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
  4. Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
  5. McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
  6. Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
  7. Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
  8. Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
  9. Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
  10. Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
  11. Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
  12. Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
  13. Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
  14. Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).

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