Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice, spettrometria di massa (MALDI MSI) di imaging ha rapidamente ampliato, poiché questa tecnica analizza una serie di biomolecole da farmaci e lipidi per N-glicani. Anche se esistono varie tecniche di preparazione del campione, rilevare peptidi da formaldeide conservato tessuti rimane una delle sfide più difficili per questo tipo di analisi spettrometria totale. Per questo motivo, abbiamo creato e ottimizzato una solida metodologia che conserva le informazioni spaziali contenute all'interno del campione, mentre suscitando il maggior numero di peptidi ionizzabili. Abbiamo anche l'obiettivo di raggiungere questo obiettivo in modo semplice e conveniente, eliminando potenziali bias o preparazione errore, che può verificarsi quando si usa automatizzata strumentazione. Il risultato finale è un protocollo riproducibile e poco costoso.
Introduzione
Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI MSI) di imaging è stata impiegata come tecnica di immagine basata per due decenni1,2, analizzando una gamma di biomolecole compreso: lipidi3, peptidi2 ,4, proteine2,5, metaboliti6,7, N-glicani8e molecole sintetiche quali farmaci terapeutici9,10. Il ....
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Protocollo
Attenzione: Tutte le precauzioni di sicurezza applicabili dovrebbero essere seguite quando si esegue questa procedura, compreso l'uso di appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) (ad es., camici da laboratorio, guanti in nitrile, occhiali di sicurezza, ecc.)
1. preparazione di reagenti e attrezzature
-
Preparazione delle soluzioni
- Per preparare 500 mL di liquido di Carnoy, mescolare 100% etanolo (EtOH), cloroformio ed acido acetico glaciale in un 6: rapporto di 3:1 v/v/v in una bottiglia di vetro pulita Schott.
- Per rendere liquida nitrocellulosa (NC), sciogliere ....
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Risultati
Se seguita correttamente, questo protocollo produce immagini che rappresentano chiaramente la morfologia lorda del tessuto senza alcun graffio o altre deformazioni (Figura 1). La convalida ideale per una preparazione del campione la corretta esecuzione, è la capacità di distinguere tra diverse strutture fisiche modificando la molecola essere guardato (Figura 2).
Una buo.......
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Discussione
Questo protocollo è stato progettato per massimizzare la generazione di specie molecolari ionizzabili, eliminando la delocalizzazione degli analiti. I fattori chiave comportano utilizzando lo stesso principio prevalente quando l'applicazione di matrix, digerendo il campione, o ricristallizzazione dopo sublimazione24; vale a dire, che un'anche deposizione di vapore, di matrice o in caso contrario, deve essere creato e mantenuto. Pipettaggio solvente lavaggi per ricristallizzazione e la digestione, .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi o interesse commerciale di divulgare
Ringraziamenti
Gli autori desidera ringraziare il Sydney Medical School Foundation e il Blues e la Fondazione per il finanziamento di parte di questo lavoro attraverso il loro programma di borsa di studio di dottorato per la ricerca sulla malattia di Alzheimer e una sovvenzione di ARC Discovery (DP160102063) assegnato a PKW.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microtomo criogenico | Leica | CM3050 | Per la preparazione e la sezione di tessuti. |
| Vetrini per microscopio all'ossido di indio e stagno | Bruker | 8237001 | Per la preparazione e la sezione dei tessuti. |
| Barattoli Coplin | Sigma Aldrich | S5516 | Per la preparazione e la sezione di tessuto. |
| Pentola a pressione | Kambrook | KPR620BSS | Per la preparazione e la sezione di tessuti. |
| Sublimatore | Chem Glass | NA | Per la procedura di sublimazione. Simile nel design al CG-3038, tuttavia è stato realizzato su misura. |
| Bagno di sabbia | NA | NA Per | la procedura di sublimazione. Sabbia di fiume di qualità fine contenuta in un foglio di alluminio piegato proveniente dall'esterno, non da alcuna azienda specifica |
| Piastra di Petri in vetro | Sigma Aldrich | CLS70165100 | Per la procedura di sublimazione. |
| Pompa a vuoto | NA | NA | Per la procedura di sublimazione. Proveniente come pezzo di ricambio da un vecchio spettrometro di massa |
| Trappola fredda | Vetro chimico | CG-4510-02 | Per la procedura di sublimazione. |
| Piastra riscaldante | John Morris | EW-15956-32. | Per la procedura di sublimazione. |
| Piastra di Petri in plastica | Sigma Aldrich | Z717223 | Per la procedura di sublimazione. |
| 37 gradi Incubatrice C | NA NA | Per | la procedura di sublimazione. Non applicabile, l'incubatrice non è sterile e ha più di 30 anni. |
| Carta assorbente | Sigma Aldrich | P7796 | Per la procedura di sublimazione. |
| Nitrocellulosa | Sigma Aldrich | N8395 | Per il lavaggio di diapositive. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | Per il lavaggio di vetrini. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | Per il lavaggio di diapositive. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | Per il lavaggio di vetrini. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | Per il lavaggio di vetrini. Prodotto in laboratorio con il 95% di etanolo di riserva |
| Cloroformio | Sigma Aldrich | C2432 | Per il lavaggio di vetrini. |
| Acido Acetico Glaciale | Sigma Aldrich | ARK2183 | Per il lavaggio di vetrini. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | Per scissione proteolitica. Polvere prodotta a 1M seguita da equilibratura con il 32% di HCl a PH 8,8 |
| Milli Q Acqua ultrapura | Sigma Aldrich | NA | Per scissione proteolitica. Purificazione eseguita in casa dal sistema di purificazione dell'acqua sartorious |
| Bircarbonato di ammonio | Sigma Aldrich | A6141 | Per scissione proteolitica. |
| Tripsina | Sigma Aldrich | T0303 | Per scissione proteolitica. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | Per la ricristallizzazione. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | Per la ricristallizzazione. |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Per la ricristallizzazione. |
Riferimenti
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J.
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Ristampe e permessi
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