Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

Summary

Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.

Abstract

L'uso di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice, spettrometria di massa (MALDI MSI) di imaging ha rapidamente ampliato, poiché questa tecnica analizza una serie di biomolecole da farmaci e lipidi per N-glicani. Anche se esistono varie tecniche di preparazione del campione, rilevare peptidi da formaldeide conservato tessuti rimane una delle sfide più difficili per questo tipo di analisi spettrometria totale. Per questo motivo, abbiamo creato e ottimizzato una solida metodologia che conserva le informazioni spaziali contenute all'interno del campione, mentre suscitando il maggior numero di peptidi ionizzabili. Abbiamo anche l'obiettivo di raggiungere questo obiettivo in modo semplice e conveniente, eliminando potenziali bias o preparazione errore, che può verificarsi quando si usa automatizzata strumentazione. Il risultato finale è un protocollo riproducibile e poco costoso.

Introduction

Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI MSI) di imaging è stata impiegata come tecnica di immagine basata per due decenni^1,2, analizzando una gamma di biomolecole compreso: lipidi³, peptidi^{2 ,4}, proteine^2,5, metaboliti^6,7, N-glicani⁸e molecole sintetiche quali farmaci terapeutici^9,10. Il numero di pubblicazioni che dimostrano l'utilità di questa tecnica è cresciuti significativamente sopra l'ultimo decennio^6,11,12,13. Alcune molecole, quali i lipidi, sono relativamente facili da analizzare tramite MALDI MSI, in quanto ionizzare prontamente a causa della loro natura chimica e pertanto richiedono poca preparazione preliminare³. Tuttavia, per le destinazioni più difficili come i peptidi, i passaggi necessari a ionizzare efficacemente queste molecole sono ampie e generalmente complicati¹⁴. Ci sono attualmente molto poche pubblicazioni che mirano a indirizzo o dimostrano la riproducibilità delle metodologie impiegate per preparare il tessuto per questa tecnica visiva unica¹⁵. Per questo motivo, abbiamo compilato le osservazioni e implementate ottimizzazioni in un unico, facile da implementare, metodologia che non dovrebbe richiedono poca o nessuna modificazione, per l'analisi dei peptidi da un formaldeide reticolato tessuto fonte¹⁴.

In questo manoscritto, abbiamo descritto una metodologia riproducibile validata, a basso costo per la rilevazione e la mappatura territoriale dei peptidi, generati da formalina congelati (FFF) e fissati in formalina di sezioni di tessuto paraffina (FFPE). Questa metodologia non richiede o si basano su qualsiasi strumentazione specializzata³. In particolare, ci rivolgiamo i molteplici aspetti della preparazione del campione specializzato necessario analizzare peptidi; a pochi passi come antigene recupero¹⁶ e rivestimento di matrice. Il nostro protocollo utilizza anche poco costoso attrezzature e reagenti, rendendoli accessibili a una comunità più ampia che altrimenti sarebbero in grado di permettersi l' apparato robotico alternativo¹⁷questa metodologia.

Il ragionamento dietro lo sviluppo di un metodo di preparazione manuale del campione era duplice: in primo luogo, l'uso di un sublimator crea un rivestimento omogeneo e coerenza di cristalli di matrice che sono ~ 1 µm in lunghezza¹⁸, qualcosa irraggiungibile con la spruzzatura più comuni tecniche. In secondo luogo, il relativamente piccolo set up costi: il costo totale dell'apparato personalizzato era <$ 1500 dollari australiani. Notiamo che, in termini di costo-efficacia, prezzo per esempio è molto più economico quando non c'è nessun macchinario robotico coinvolti. L'uso di sublimazione è stata segnalata precedentemente, tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, metodologie dettagliate che descrivono questo processo e preparazione dei campioni non sono stati segnalati né descritti nella letteratura.

Questo protocollo è destinato per aiutare i ricercatori che hanno accesso a uno spettrometro di massa MALDI e che sono intenti a generare informazioni spaziali in relazione a una bio-molecola di interesse¹⁹. In sostanza, MALDI MSI è una forma di istologico di screening che non si basa sugli anticorpi o macchie².

Protocol

Attenzione: Tutte le precauzioni di sicurezza applicabili dovrebbero essere seguite quando si esegue questa procedura, compreso l'uso di appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) (ad es., camici da laboratorio, guanti in nitrile, occhiali di sicurezza, ecc.)

1. preparazione di reagenti e attrezzature

1. Preparazione delle soluzioni
   1. Per preparare 500 mL di liquido di Carnoy, mescolare 100% etanolo (EtOH), cloroformio ed acido acetico glaciale in un 6: rapporto di 3:1 v/v/v in una bottiglia di vetro pulita Schott.
   2. Per rendere liquida nitrocellulosa (NC), sciogliere membrana NC (comunemente usata nel macchiarsi occidentale) in ordinata di acetone, di movimentazione delicata, a una concentrazione finale di 40 mg/mL.
2. Preparazione dei vetrini NC rivestito
   1. Vetrini rivestiti con uso di una tecnica simile a quella utilizzata per la preparazione di sangue sbavature per esame istologico²⁰ preparare NC.
   2. Dispensare 40 µ l di liquido NC su uno spigolo di un vetrino da microscopio conduttivo Indio ossido di stagno (ITO). Utilizzando un vetrino per microscopio regolari, trascinare la NC sotto tensione superficiale attraverso la diapositiva per creare un rivestimento di film anche sottile.
   3. Consentire la NC ad asciugare a temperatura ambiente per 20 s e poi archivio fino a quando necessario a temperatura ambiente. Conservazione dei campioni in queste condizioni può essere indefinita condizione i tessuti sono mantenuti e privi di polvere.
      Nota: Questo metodo di preparazione è meglio conosciuto come "film sottile" e produrrà un rivestimento uniforme che si basa sulla viscosità della Carolina del nord così come la sua mancanza di tensione superficiale per autolivelli sulla diapositiva. L'unica accortezza che dovrebbe essere presa quando preparare le diapositive non si muove troppo rapidamente, che creerà striature di NC, piuttosto che una copertura completa.
      Attenzione: Come NC liquido si asciuga molto rapidamente, è fondamentale lavorare rapidamente per evitare l'essiccazione la soluzione prima che è stata correttamente diffusa. Dovrebbe anche prestare attenzione quando si maneggiano NC allo stato liquido, come esso è un composto altamente energetico e non venga a contatto una sorgente di accensione per evitare l'esplosione incendiarie. NC subisce anche transizioni endotermiche quando essiccazione e può causare bruciature da freddo se permesso di entrare in contatto prolungato con la pelle o le mani guantate. Per ridurre al minimo i rischi ad esso associati, solo piccole quantità devono essere preparate in ogni momento (< 1 mL è consigliato). Una volta asciutto è stabile a temperatura ambiente. Tuttavia, NC può rimanere esplosivo quando sono presenti in grandi quantità.
3. Creazione delle camere a vapore su ordinazione
   1. Tagliare un pezzo di carta assorbente spessa con un paio di forbici abbastanza grande da contenere il fondo la metà di un piatto di petri in plastica standard (94 mm di diametro e 3 mm di spessore).
   2. Tagliare la carta, lasciando una striscia rettangolare al centro, la stessa dimensione di un vetrino da microscopio, lasciando abbastanza in eccesso in modo che la carta manterrà la posizione in di Petri (complementare figura 1).

2. preparazione di sezioni di tessuto

1. FFPE tessuto²¹.
   1. Selezionare la sezione a 12 µm spessore in un banco standard montato microtomo e galleggiante montare sulla NC prerivestiti ITO diapositive e blocco del tessuto desiderato.
   2. Immergere i vetrini in xilene fresco per rimuovere residua paraffina per 2 min e ripetere l'operazione una seconda volta.
      Nota: Se il blocco di paraffina è particolarmente dominante o il tessuto è relativamente piccolo rispetto al blocco di paraffina, i campioni possono essere riscaldati a 60 ° C per sciogliere la maggior parte distanza prima del lavaggio in xilene.
   3. Lavare i campioni Sparaffinatura immergendo i vetrini in una serie graduata di solvente: 70% v/v EtOH/acqua, 100% EtOH, liquido di Carnoy, 100% EtOH, acqua ultra pura e 100% EtOH. La durata di ogni immersione deve essere 30 s, fatta eccezione per il liquido di Carnoy, che deve durare per 2 min.
      Attenzione: Xilene e del liquido di Carnoy deve essere memorizzati e utilizzati in una cappa aspirante, in quanto sono altamente tossici se inalato.
2. Tessuto formalina-fisso congelati (FFF)
   Nota: I campioni devono già essere congelati, in modo appropriato secondo il tipo di campione.
   1. Equilibrare il blocco di tessuto alla temperatura di funzionamento del microtomo per 20 min²².
      Nota: Temperatura di equilibrazione è dipenda dal tipo di tessuto.
   2. Far scorrere la sezione il tessuto usando un microtomo a 12 µm e disgelo montare le sezioni su un pre-preparati NC rivestito ITO.
   3. Conservare i vetrini in un essiccatore sotto vuoto in panchina nel buio.
      Nota: I campioni possono essere conservati per diverse settimane in queste condizioni.
   4. Lavare i campioni in una serie di solvente Classificato come indicato per tessuto FFPE (2.1.3).
      Nota: non c'è nessuna necessità di un passo di deparaffinisation di xilene come il campione non è incorporato.

3. metilene Crosslink idrolisi

1. Caricare la slide di esempio (FFF o FFPE) in una scatola di plastica slide che è riempita nella parte superiore di 20 mmol tris-HCl (pH 8,8). Chiudete la scatola e posizionarlo in un bagno di acqua, contenente 500 mL di acqua, permettendo la casella per toccare il fondo. Quindi riscaldare per 15 min a 120 ° C in una pentola a pressione che può raggiungere una pressione di esercizio di 70 kPa.
2. Rimuovere le diapositive, lasciarli raffreddare e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 15 min.

4. tessuto digestione

1. Una volta idrolizzato, rivestire con 10 µ l di soluzione di tripsina (1mg/mL) i campioni in acqua ultra-pura, di pipettaggio 10 µ l della soluzione sul bordo della sezione di tessuto, quindi, utilizzando la stessa punta della pipetta, trascinare la goccia su tutta la superficie del tessuto sotto la superficie tensione.
   Nota: Evitare di graffiare la superficie del tessuto con la punta della pipetta e sopra diffusione l'enzima oltre i confini dei bordi del tessuto.
2. Consentire ai campioni di asciugare a temperatura ambiente.
3. Una volta asciutto, è possibile montare i campioni all'interno della parte superiore della camera di vapore precedentemente costruita (tessuto rivolto verso il basso) con nastro autoclave su dei bordi della diapositiva (complementare figura 2).
4. Pipettare 600 µ l di una soluzione contenente un mix 1:1 v/v 100% acetonitrile e 50mm di bicarbonato di ammonio attentamente sul dito carta assorbente nella parte inferiore del piatto petri fino a quando il dito sembra essere uniformemente umido.
5. Posizionare la metà superiore della camera del vapore sul fondo metà, assicurando la diapositiva di dito e campione di carta allineare perfettamente e sigillare la camera intorno suo equatore con la pellicola di paraffina.
6. Lasciar riposare il campione in un incubatore a 37 ° C per consentire la completa digestione.

5. matrice rivestimento tramite sublimazione

1. Una volta digerito, pesare il vetrino su un equilibrio microanalitico di 5 cifre.
2. Montare il vetrino sul dito raffreddamento dell'apparato di sublimazione e fissarlo con nastro di rame, nello stesso modo come descritto per la camera di vapore (complementare figura 3).
   Nota: Per garantire che la diapositiva viene contattata uniformemente dal dito raffreddamento, uno strato di nastro di rame è posto sulla parte inferiore del dito raffreddamento per livellare la superficie. Questo assicura che la diapositiva viene raffreddata uniformemente che conduce anche deposizione della matrice.
3. Inserire 300 mg di matrice di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA) in una capsula Petri vetro nella parte inferiore della sezione e diffusione uniformemente per creare un sottile strato di cristalli di matrice.
4. Il sublimator di assemblare e fissare le due metà con il morsetto a ferro di cavallo. Sospendere l'unità assemblate 15-20 cm sopra un bagno di sabbia, preriscaldato a 220 ° C, collocandolo in un anello di metallo collegato ad uno stand della storta.
5. Collegare la camera alla fonte del vuoto, il vuoto di coinvolgere e consentirle di stabilizzare fino a ~ 25 mTorr per 5 min.
6. Pack il raffreddamento dito verso l'alto con ghiaccio e aggiungere 50 mL di acqua. Consentire l'apparato a stabilirsi per ulteriori 5 minuti prima di procedere.
7. Abbassare la camera sulla superficie della sabbia, garantendo che la sabbia completamente contatto con il fondo della camera e lasciarlo per 45 min creare un rivestimento ideale di 0,22 mg/cm²
   Attenzione: Prestare particolare attenzione dovrebbe essere movimentazione vetro ad alto vuoto, come eventuali danni all'apparato, mentre evacuati, può provocare fallimento catastrofico della camera del vetro.
8. Dopo 45 min, rimuovere la camera il bagno di sabbia sollevando l'anello metallico e sfiatare la camera.
   Nota: Una volta che la camera è stata ventilata, la diapositiva deve essere rimosso molto rapidamente come acqua nell'aria inizia a condensare sulla diapositiva dito e campione congelamento.
9. Rimuovere il vetrino e pesarlo affinché il rivestimento desiderato è stato raggiunto.
   Nota: Se insufficiente rivestimento è stato realizzato, semplicemente ripetere il processo di sublimazione per la diapositiva fino a quando lo spessore di rivestimento desiderato è stato raggiunto.

6. ricristallizzazione

1. Una volta sublimata, montare il vetrino all'interno la sommità della camera vapore precedentemente costruita, come descritto precedente (tessuto rivolto verso il basso).
2. Pipettare 600 µ l di una soluzione contenente un mix 1:1 (v/v) di 100% acetonitrile e 0.1% v/v l'acido trifluoroacetico in acqua con attenzione sulla carta assorbente nella parte inferiore del piatto petri per garantire un rivestimento anche.
3. Assemblare la camera, garantendo la diapositiva di microscopio e scheda di carta siano perfettamente allineate e lasciare in un incubatore a 37 ° C per 1 h.
   Attenzione: Non sigillare la camera.
   Nota: Una volta ricristallizzato, la tonalità normalmente gialla della matrice dovrebbe cambiare in bianco, aspetto meno lucida e appaiono molto anche. Questo indica che ricristallizzazione è stato eseguito correttamente.
4. Il campione è pronto per l'analisi.

7. Strumentazione

1. Analizzare il vetrino in uno scanner piano per creare un'immagine digitale.
2. Caricare il campione nello spettrometro di massa e quindi analizzare utilizzando la piattaforma di software appropriato.
3. Analizzare i campioni in modalità reflectron ioni positivi con un intervallo di massa Da 750-3.500, con una risoluzione di spot che è applicabile al risultato desiderato. Nella maggior parte dei casi, 20-50 µm larghezza della trama è sufficiente, tuttavia poco quanto 10 µm può essere usato¹⁵.
   Attenzione: MALDI UV laser sono una fonte di radiazioni ionizzanti e non deve essere visto direttamente. Assicurarsi che il laser è contenuto all'interno dello strumento schermatura prima dell'operazione.

Results

Se seguita correttamente, questo protocollo produce immagini che rappresentano chiaramente la morfologia lorda del tessuto senza alcun graffio o altre deformazioni (Figura 1). La convalida ideale per una preparazione del campione la corretta esecuzione, è la capacità di distinguere tra diverse strutture fisiche modificando la molecola essere guardato (Figura 2).

Una buo...

Discussion

Questo protocollo è stato progettato per massimizzare la generazione di specie molecolari ionizzabili, eliminando la delocalizzazione degli analiti. I fattori chiave comportano utilizzando lo stesso principio prevalente quando l'applicazione di matrix, digerendo il campione, o ricristallizzazione dopo sublimazione²⁴; vale a dire, che un'anche deposizione di vapore, di matrice o in caso contrario, deve essere creato e mantenuto. Pipettaggio solvente lavaggi per ricristallizzazione e la digestione, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtomo criogenico	Leica	CM3050	Per la preparazione e la sezione di tessuti.
Vetrini per microscopio all'ossido di indio e stagno	Bruker	8237001	Per la preparazione e la sezione dei tessuti.
Barattoli Coplin	Sigma Aldrich	S5516	Per la preparazione e la sezione di tessuto.
Pentola a pressione	Kambrook	KPR620BSS	Per la preparazione e la sezione di tessuti.
Sublimatore	Chem Glass	NA	Per la procedura di sublimazione. Simile nel design al CG-3038, tuttavia è stato realizzato su misura.
Bagno di sabbia	NA	NA Per	la procedura di sublimazione. Sabbia di fiume di qualità fine contenuta in un foglio di alluminio piegato proveniente dall'esterno, non da alcuna azienda specifica
Piastra di Petri in vetro	Sigma Aldrich	CLS70165100	Per la procedura di sublimazione.
Pompa a vuoto	NA	NA	Per la procedura di sublimazione. Proveniente come pezzo di ricambio da un vecchio spettrometro di massa
Trappola fredda	Vetro chimico	CG-4510-02	Per la procedura di sublimazione.
Piastra riscaldante	John Morris	EW-15956-32.	Per la procedura di sublimazione.
Piastra di Petri in plastica	Sigma Aldrich	Z717223	Per la procedura di sublimazione.
37 gradi Incubatrice C	NA NA	Per	la procedura di sublimazione. Non applicabile, l'incubatrice non è sterile e ha più di 30 anni.
Carta assorbente	Sigma Aldrich	P7796	Per la procedura di sublimazione.
Nitrocellulosa	Sigma Aldrich	N8395	Per il lavaggio di diapositive.
Acetone	Sigma Aldrich	650501	Per il lavaggio di vetrini.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	Per il lavaggio di diapositive.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Per il lavaggio di vetrini.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	Per il lavaggio di vetrini. Prodotto in laboratorio con il 95% di etanolo di riserva
Cloroformio	Sigma Aldrich	C2432	Per il lavaggio di vetrini.
Acido Acetico Glaciale	Sigma Aldrich	ARK2183	Per il lavaggio di vetrini.
Tris HCL pH 8.8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Per scissione proteolitica. Polvere prodotta a 1M seguita da equilibratura con il 32% di HCl a PH 8,8
Milli Q Acqua ultrapura	Sigma Aldrich	NA	Per scissione proteolitica. Purificazione eseguita in casa dal sistema di purificazione dell'acqua sartorious
Bircarbonato di ammonio	Sigma Aldrich	A6141	Per scissione proteolitica.
Tripsina	Sigma Aldrich	T0303	Per scissione proteolitica.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Per la ricristallizzazione.
Acetonitrile	Sigma Aldrich	1.00029	Per la ricristallizzazione.
Acido trifluoroacetico (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Per la ricristallizzazione.