Method Article

Preparazione ottimale di formalina riparata campioni per Peptide basati su matrice assistita spettrometria totale di desorbimento/ionizzazione Laser i flussi di lavoro di Imaging

DOI:

10.3791/56778

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January 16th, 2018

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1Mass Spectrometry Core Facility, University of Sydney, 2Proteomics Core Facility, University of Technology Sydney, 3Neuropathology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney, 4Redox Biology Group, Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, University of Sydney

In This Article

Summary

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Questo protocollo descrive un metodo attendibile e riproducibile per la preparazione di base di sublimazione di formalina riparata tessuto destinato per imaging spettrometria di massa.

Abstract

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L'uso di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice, spettrometria di massa (MALDI MSI) di imaging ha rapidamente ampliato, poiché questa tecnica analizza una serie di biomolecole da farmaci e lipidi per N-glicani. Anche se esistono varie tecniche di preparazione del campione, rilevare peptidi da formaldeide conservato tessuti rimane una delle sfide più difficili per questo tipo di analisi spettrometria totale. Per questo motivo, abbiamo creato e ottimizzato una solida metodologia che conserva le informazioni spaziali contenute all'interno del campione, mentre suscitando il maggior numero di peptidi ionizzabili. Abbiamo anche l'obiettivo di raggiungere questo obiettivo in modo semplice e conveniente, eliminando potenziali bias o preparazione errore, che può verificarsi quando si usa automatizzata strumentazione. Il risultato finale è un protocollo riproducibile e poco costoso.

Introduction

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Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI MSI) di imaging è stata impiegata come tecnica di immagine basata per due decenni1,2, analizzando una gamma di biomolecole compreso: lipidi3, peptidi2 ,4, proteine2,5, metaboliti6,7, N-glicani8e molecole sintetiche quali farmaci terapeutici9,10. Il ....

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Protocol

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Attenzione: Tutte le precauzioni di sicurezza applicabili dovrebbero essere seguite quando si esegue questa procedura, compreso l'uso di appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) (ad es., camici da laboratorio, guanti in nitrile, occhiali di sicurezza, ecc.)

1. preparazione di reagenti e attrezzature

  1. Preparazione delle soluzioni
    1. Per preparare 500 mL di liquido di Carnoy, mescolare 100% etanolo (EtOH), cloroformio ed acido acetico glaciale in un 6: rapporto di 3:1 v/v/v in una bottiglia di vetro pulita Schott.
    2. Per rendere liquida nitrocellulosa (NC), sciogliere ....

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Results

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Se seguita correttamente, questo protocollo produce immagini che rappresentano chiaramente la morfologia lorda del tessuto senza alcun graffio o altre deformazioni (Figura 1). La convalida ideale per una preparazione del campione la corretta esecuzione, è la capacità di distinguere tra diverse strutture fisiche modificando la molecola essere guardato (Figura 2).

Una buo.......

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Discussion

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Questo protocollo è stato progettato per massimizzare la generazione di specie molecolari ionizzabili, eliminando la delocalizzazione degli analiti. I fattori chiave comportano utilizzando lo stesso principio prevalente quando l'applicazione di matrix, digerendo il campione, o ricristallizzazione dopo sublimazione24; vale a dire, che un'anche deposizione di vapore, di matrice o in caso contrario, deve essere creato e mantenuto. Pipettaggio solvente lavaggi per ricristallizzazione e la digestione, .......

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Disclosures

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi o interesse commerciale di divulgare

Acknowledgements

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Gli autori desidera ringraziare il Sydney Medical School Foundation e il Blues e la Fondazione per il finanziamento di parte di questo lavoro attraverso il loro programma di borsa di studio di dottorato per la ricerca sulla malattia di Alzheimer e una sovvenzione di ARC Discovery (DP160102063) assegnato a PKW.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microtomo criogenicoLeicaCM3050Per la preparazione e la sezione di tessuti.
Vetrini per microscopio all'ossido di indio e stagnoBruker8237001Per la preparazione e la sezione dei tessuti.
Barattoli CoplinSigma AldrichS5516Per la preparazione e la sezione di tessuto.
Pentola a pressioneKambrookKPR620BSSPer la preparazione e la sezione di tessuti.
SublimatoreChem GlassNAPer la procedura di sublimazione. Simile nel design al CG-3038, tuttavia è stato realizzato su misura.
Bagno di sabbiaNANA Perla procedura di sublimazione. Sabbia di fiume di qualità fine contenuta in un foglio di alluminio piegato proveniente dall'esterno, non da alcuna azienda specifica
Piastra di Petri in vetroSigma AldrichCLS70165100Per la procedura di sublimazione.
Pompa a vuotoNANAPer la procedura di sublimazione. Proveniente come pezzo di ricambio da un vecchio spettrometro di massa 
Trappola freddaVetro chimicoCG-4510-02Per la procedura di sublimazione.
Piastra riscaldanteJohn MorrisEW-15956-32.Per la procedura di sublimazione.
Piastra di Petri in plasticaSigma AldrichZ717223Per la procedura di sublimazione.
37 gradi Incubatrice CNA NAPerla procedura di sublimazione. Non applicabile, l'incubatrice non è sterile e ha più di 30 anni.
Carta assorbenteSigma AldrichP7796Per la procedura di sublimazione.
Nitrocellulosa Sigma AldrichN8395Per il lavaggio di diapositive.
AcetoneSigma Aldrich650501Per il lavaggio di vetrini.
XyleneSigma Aldrich214736Per il lavaggio di diapositive.
100% EtOHSigma Aldrich1.02428Per il lavaggio di vetrini.
70% EtOHSigma AldrichNAPer il lavaggio di vetrini. Prodotto in laboratorio con il 95% di etanolo di riserva 
CloroformioSigma AldrichC2432Per il lavaggio di vetrini.
Acido Acetico GlacialeSigma AldrichARK2183Per il lavaggio di vetrini.
Tris HCL pH 8.8Sigma AldrichTRIS-ROPer scissione proteolitica. Polvere prodotta a 1M seguita da equilibratura con il 32% di HCl a PH 8,8
Milli Q Acqua ultrapuraSigma AldrichNAPer scissione proteolitica. Purificazione eseguita in casa dal sistema di purificazione dell'acqua sartorious
Bircarbonato di ammonioSigma AldrichA6141Per scissione proteolitica.
TripsinaSigma AldrichT0303Per scissione proteolitica.
CHCA MatrixSigma AldrichC2020Per la ricristallizzazione.
AcetonitrileSigma Aldrich1.00029Per la ricristallizzazione.
Acido trifluoroacetico (TFA) Sigma Aldrich302031Per la ricristallizzazione.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J.

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Formalin Fixed SamplesPeptide Mass Spectrometry ImagingMALDI MSI WorkflowsTissue Sample PreparationNitrocellulose Coated SlidesVapor Chamber AssemblyTrypsin Digestion ProtocolCHCA Matrix SublimationFFPE Tissue ProcessingMass Spectrometry Analysis

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