Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.
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Articolo metodologico
Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici
In questo articolo
Sommario
Abstract
I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono di grande importanza per l'industria farmaceutica come sono implicati in molte malattie umane e includere obiettivi ben convalidati per intervento terapeutico. Scoperta di composti di piombo, tra cui piccole molecole sintetiche, che specificamente inibiscono la funzione del ricevitore, è un passo iniziale importante nello sviluppo di farmaci e si basa su analisi cell-based sensibili, specifiche e robuste. Qui, descriviamo un'analisi cinetica cellulare con una lettura fluorescente progettata principalmente per identificare gli antagonisti di recettori specifici che inibiscono il Ca2 + rilascio intracellulare evocato al momento dell'attivazione del recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4) dal suo ligando endogeno, il ligando di chemochine CXC 12 (CXCL12). Un vantaggio chiave di questo metodo è che permette anche lo screening di composti dotati di proprietà intrinseche agonistica (cioè, composti che provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2 + in assenza di CXCL12) o composti modulazione della funzione del recettore attraverso l'interazione con i siti di legame allosterico (cioè, modulatori allosterici positivi e negativi (PAMs e NAMs, rispettivamente)). Sul lato negativo, autofluorescent composti potrebbero interferire con indicazione del dosaggio, ostacolando quindi interpretazione dei dati affidabile. Molto probabilmente questo dosaggio può essere implementato, con adattamenti minimi, come un saggio di scoperta di farmaci generici per molti altri GPCR di cui l'attivazione conduce ad un rilascio di Ca intracellulare2 +.
Introduzione
GPCR sono un'importante superfamiglia di proteine di superficie delle cellule che attivano cascate di trasduzione del segnale al ligando extracellulare. Possono essere attivati da una grande varietà di stimoli compreso peptidi, ormoni proteici, ammine biogene e lipidi, che provoca l'avvio di diverse vie di segnalazione intracellulare e risposte biologiche alla fine1,2 . Inoltre, GPCR sono coinvolti in molti, se non tutti, i processi fisiologici e di sviluppo e molte malattie umane sono associati con sovraespressione di segnalazione o recettori GPCR disfunzionale. GPCR rientrano pertanto tra i bersagli farmacol....
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Protocollo
Nota: Tutti i passaggi descritti nelle sezioni 1 e 2 sono effettuati in condizioni di sterilità in un flusso laminare.
1. manutenzione di U87. Cellule CD4.hCXCR4
- Crescere le cellule in matracci di cultura T75 a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.
Nota: La varietà di cellula in vitro utilizzati in questo protocollo è una linea cellulare di glioblastoma U87 che esprimono stabilmente cluster di differenziazione 4 (CD4) e umani CXCR4 ed è stato descritto in precedenza17. Espressione di superficie delle cellule di CD4 e CXCR4 è continuamente monitorata tramite flusso cytometry e livelli d....
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Risultati
L'effetto della stimolazione CXCL12 con la mobilizzazione intracellulare di Ca2 + nel U87. CD4.CXCR4+ e U87. Cellule CD4 è stata valutata con il test di mobilizzazione di Ca2 + . Invece di 20 µ l del composto in esame che normalmente verrebbero aggiunti durante il primo passaggio di pipettaggio del protocollo (Figura 1), il tampone del saggio è stato aggiunto al fluo-2am caricato U87. CD4.CXCR4+ cellule nella piastr.......
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Discussione
Il Ca2 +-saggio di mobilitazione qui descritto precedentemente è stato indicato per essere un valido strumento per identificare e caratterizzare antagonisti del recettore CXCR417di targeting. Si prevede, tuttavia, che questo metodo può essere applicato più generalmente a un folto gruppo di altri GPCR che innescano un Ca2 + rilascio citosolico al momento della loro attivazione, come illustrato per il ricevitore di chemokine correlate CCR5. Considerando che nel caso di CCR5 pot.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare Eric Fonteyn e Geert Schoofs per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da KU Leuven (grant no. PF/10/018), il Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, concedere no. G.485.08) e la Fondation Dormeur Vaduz.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | colorante fluorescente sensibile al Ca2+ |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | acido pluronico |
| Gelatina | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | antagonista specifico CXCR4 |
| Maraviroc | gentile dono del | , antagonista CCR5 | |
| Legante delle chemochine CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Ligando delle chemochine CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcio, magnesio, senza rosso fenolo | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Tripsina-EDTA (0,25 %), rosso fenolo | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Provette Falcon, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Pallone per coltura tissutale (T75) | Corning | 353024 | |
| Piastra nera, 96 pozzetti, fondo trasparente, con coperchio | 10530753 Costar/Fisher Scientific | (96 pozzetti), per la semina cellulare | |
| Piastre in polipropilene (PP) | Piastre Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | utilizzate per preparare le piastre composte e le chemochine piastre, fondo tondo |
| FLIPR Tetra sistema di screening cellulare ad alta produttività | Molecular Devices | Lettore di piastre fluorescenti con testa pipettatore integrata e telecamera ICCD | |
| Modulo LED FLIPR Tetra 470 - 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Diodi emettitori di luce per l'eccitazione del colorante fluorescente sensibile al Ca2+ |
| Filtro di emissione FLIPR Tetra 515 - 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | filtro di emissione compatibile con il colorante fluorescente |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | Testa pipettatrice a 96 pozzetti, integrata nel lettore di piastre fluorescenti |
| ScreenWorks | Molecular Devices | pacchetto software utilizzato per l'analisi e la visualizzazione dei dati sull'analizzatore | |
| Corning CellBIND 96 pozzetti a fondo chiaro Micropiastre in polistirene nero, con coperchio, sterili | Corning | 3340 | Piastre per saggi pre-rivestite a 96 pozzetti che possono rappresentare un'alternativa al rivestimento manuale della piastra per saggi. |
Riferimenti
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome f....
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