Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici

Sommario

Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca^{2 +} rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.

Abstract

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono di grande importanza per l'industria farmaceutica come sono implicati in molte malattie umane e includere obiettivi ben convalidati per intervento terapeutico. Scoperta di composti di piombo, tra cui piccole molecole sintetiche, che specificamente inibiscono la funzione del ricevitore, è un passo iniziale importante nello sviluppo di farmaci e si basa su analisi cell-based sensibili, specifiche e robuste. Qui, descriviamo un'analisi cinetica cellulare con una lettura fluorescente progettata principalmente per identificare gli antagonisti di recettori specifici che inibiscono il Ca^{2 +} rilascio intracellulare evocato al momento dell'attivazione del recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4) dal suo ligando endogeno, il ligando di chemochine CXC 12 (CXCL12). Un vantaggio chiave di questo metodo è che permette anche lo screening di composti dotati di proprietà intrinseche agonistica (cioè, composti che provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca^{2 +} in assenza di CXCL12) o composti modulazione della funzione del recettore attraverso l'interazione con i siti di legame allosterico (cioè, modulatori allosterici positivi e negativi (PAMs e NAMs, rispettivamente)). Sul lato negativo, autofluorescent composti potrebbero interferire con indicazione del dosaggio, ostacolando quindi interpretazione dei dati affidabile. Molto probabilmente questo dosaggio può essere implementato, con adattamenti minimi, come un saggio di scoperta di farmaci generici per molti altri GPCR di cui l'attivazione conduce ad un rilascio di Ca intracellulare^{2 +}.

Introduzione

GPCR sono un'importante superfamiglia di proteine di superficie delle cellule che attivano cascate di trasduzione del segnale al ligando extracellulare. Possono essere attivati da una grande varietà di stimoli compreso peptidi, ormoni proteici, ammine biogene e lipidi, che provoca l'avvio di diverse vie di segnalazione intracellulare e risposte biologiche alla fine^1,2 . Inoltre, GPCR sono coinvolti in molti, se non tutti, i processi fisiologici e di sviluppo e molte malattie umane sono associati con sovraespressione di segnalazione o recettori GPCR disfunzionale. GPCR rientrano pertanto tra i bersagli farmacologici più convalidati in medicina^1,3.

In genere, un flusso di lavoro GPCR droga scoperta inizia con saggi di screening cellulare che consentano l'identificazione di composti quali piccole molecole, anticorpi monoclonali e peptidi che possono modulare l'attività di un GPCR particolare. Nella scoperta della droga GPCR esistono molti diversi tipi di analisi per la ricerca di tali composti, molti dei quali sono compatibili con le campagne di screening resa medio-alta. I saggi più utilizzati comprendono esperimenti di binding recettoriale, fluorescenza o luminescenza basato saggi rilevare le fluttuazioni nel livello del cosiddetti messaggeri secondari (per esempio, Ca^{2 +}, monofosfato di adenosina ciclico (AMP)), fenotipiche analisi della selezione e reclutamento di β-arrestina dosaggi⁴. La scelta per un particolare tipo di analisi può dipendere da diversi fattori, ma è anche determinata dalla conoscenza preventiva riguardante le proprietà di segnalazione di un GPCR determinato. Agonista vincolante di un GPCR induce un cambio conformazionale che catalizza lo scambio di difosfato di guanidina (PIL) per trifosfato di guanidina (GTP) sulla α-subunità delle proteine G eterotrimeriche. Successivamente la subunità di G_α-GTP si dissocia dalla subunità_βγ G ed entrambe le subunità avvierà ulteriori vie di segnalazione. Idrolisi della molecola di GTP e successiva ri-associazione il G_α- PIL e subunità_βγ G ripristinerà la proteina di G nella sua conformazione inattiva^5,6. Basato su somiglianza di sequenza della subunità_α G sono definiti diversi tipi di proteine G (G_s, G_i, G,_q, G_12/13)⁷. Segnalazione tramite il G_α subunità dà luogo a diverse risposte tipiche come l'aumento (via G_s) o diminuire (via G_io) di produzione di AMP ciclico e mobilizzazione intracellulare di Ca^{2 +} (via G_q)^{5 ,7}. Subunità_βγ G sono anche in grado di indurre vie effettrici intracellulari. Per esempio, al momento dell'attivazione di G_io-GPCR accoppiati, G_βγ può stimolare direttamente la fosfolipasi C (PLC-β) per la produzione di inositolo trifosfato (IP₃) che innesca il rilascio di Ca^{2 +} dai depositi intracellulari⁷ . Dopo l'attivazione dei recettori GPCR sono fosforilati da chinasi GPCR (GRK) che favorisce l'interazione con β-arrestins. Questo processo termina G proteina di segnalazione e conduce alla interiorizzazione e alla fine la desensibilizzazione del recettore. Β-arrestins sono anche in grado di formare complessi multi-molecolari che possono innescare altre vie di segnalazione indipendente di segnalazione⁸G di proteine.

All'interno della sottofamiglia dei recettori per le chemochine, G_io-CXCR4 accoppiato è un GPCR che ha suscitato molto interesse come un bersaglio promettente per la scoperta di nuovi farmaci. Dato il suo ruolo stabilito come un importante co-recettore per il virus di immunodeficenza umana 1 (HIV-1) entrata virale e infezione, composti CXCR4 di targeting sono stati inizialmente sviluppati come farmaco anti-HIV candidati⁹. Più recentemente, un corpo crescente di prova ha indicato un ruolo importante per CXCR4 nella tumorigenesi e cancro metastasi che lo rende un obiettivo terapeutico e validato in oncologia pure¹⁰. CXCR4 è altamente espresso in più di venti tipi di cancro umano e controlla la sopravvivenza delle cellule del tumore, proliferazione e migrazione, nonché l'angiogenesi tumore-relativi¹⁰. CXCR4 antagonisti di classi chimiche differenti precedentemente sono stati descritti^11,12, ma solo la piccola molecola che AMD3100 è attualmente approvato per l'uso in clinica come un agente di mobilizzazione delle cellule staminali usato durante il trattamento di linfoma e mieloma pazienti^13,14. Studi clinici sono in corso per valutare la sicurezza e l'efficacia di parecchi altri antagonisti di CXCR4 in diverse malattie umane, ma con un forte focus su oncologia¹². Data le molte applicazioni potenziali per CXCR4 antagonisti, è opportuna la ricerca di nuovi composti con proprietà farmacocinetiche migliorata, migliorata biodisponibilità o potenzialmente meno effetti collaterali.

Qui, un'analisi di cellulare cinetica fluorescenza-basata principalmente usato per schermo per composti capaci di inibire CXCR4 è descritto. Le misure in fluorescenza di questo metodo si basa sull'aumento transitorio della concentrazione intracellulare di Ca^{2 +} evocata all'attivazione di CXCR4 dal suo agonista endogeno, il ligando di chemochina CXCL12 (precedentemente noto come fattore 1 α (derivati da cellule stromali SDF1-α)) e la potenziale inibizione di questa risposta^{2 +} Ca CXCL12-indotta da particolari composti. In questa analisi, le cellule di glioblastoma umano U87 che esprimono il recettore CXCR4 umano sono utilizzate. Allo stesso tempo, queste cellule mancano dell'espressione endogena di CXCR7, un ricevitore di chemokine correlate che si lega anche CXCL12^15,16,17. CXCR7 ha tradotto anche dimostrato di essere in grado di formare eterodimeri con CXCR4, quindi modulazione delle proprietà segnalazione di questo recettore quest'ultimo¹⁸. Fluttuazioni del livello di Ca intracellulare^{2 +} mediata da CXCR4 sono monitorate caricando il CXCR4⁺ cellule con estere acetossimetil fluo-2 (AM), una cellula-permeabile ad alta affinità fluorescente Ca^{2 +}-associazione tintura. Fluo-2 AM è una molecola fluorescente di singola lunghezza d'onda che possa essere eccitata a 490 nm, mentre la sua fluorescenza emissione viene misurata a 520 nm. Questa fluorescenza emissione aumenta legandosi Ca^{2 +} , con un ampio range dinamico tra il Ca^{2 +}-associati e non associati di stato. L'aumento del segnale fluorescente è transitoria, che si verificano entro un intervallo di tempo di pochi minuti e decadrà in seguito. L'altezza di picco dei correlati ulteriori emissione fluorescente con il livello di attivazione del recettore. Il dosaggio stesso viene eseguito utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenza dotato di una fotocamera CCD intensificato (ICCD) che possiede un sistema di pipettaggio integrato che permette la standardizzazione delle operazioni pipettaggio nell'analisi (Vedi Tabella materiali) . Inoltre, la misura simultanea del segnale fluorescente in tutti i pozzetti di una micropiastra è un altro vantaggio chiave del lettore di fluorescenza che viene utilizzato. Durante la prima parte del saggio i composti in esame (ad esempio, un pannello di piccole molecole ad una concentrazione fissa o in una serie di diluizioni) vengono aggiunti al fluo-2am caricato CXCR4⁺ U87 cellule seguirono da un ~ periodo di incubazione di 10 min durante il quale l'effetto potenziale agonistico dei composti è misurato continuamente in tempo reale. Quindi, l'agonista endogeno (cioè, CXCL12) viene aggiunto alle cellule per evocare un aumento transitorio CXCR4-mediata del livello di intracellulare di Ca^{2 +}. Durante questa parte del test può essere valutato il potenziale attività antagonista dei composti testati. Una panoramica schematica del flusso di lavoro generale del dosaggio è presentata nella Figura 1.

Anche se questo test di mobilizzazione di Ca^{2 +} è stato utilizzato principalmente per identificare e determinare la potenza inibitoria di antagonisti competitivi di CXCR4 (cioè, composti che impediscono l'agonista endogeno per legare e stimolare il recettore), esso anche agonisti del recettore in grado di identificare e, inoltre, i composti che esercitano la loro funzione legandosi a siti allosterici (cioè, siti che topograficamente differiscono dal sito di legame ortosterici occupato da agonista endogeno). Sono esempi di quest'ultima categoria di composti agonisti allosterici e PAMs e NAMs^19,20. Considerando che gli antagonisti del recettore specifico, nonché NAMs sarebbe inibiscono la CXCL12-indotta di Ca^{2 +} risposta, PAMs migliorerebbe questa risposta (veda inoltre la discussione sezione). Anche se il dosaggio descritto nel presente documento in particolare obiettivi CXCR4, si prevede che questo metodo può essere applicato a altri GPCR con sforzo minimo ottimizzazione, almeno se segnalano tramite il rilascio di Ca intracellulare^{2 +}.

Protocollo

Nota: Tutti i passaggi descritti nelle sezioni 1 e 2 sono effettuati in condizioni di sterilità in un flusso laminare.

1. manutenzione di U87. Cellule CD4.hCXCR4

1. Crescere le cellule in matracci di cultura T75 a 37 ° C e 5% di CO₂ in un incubatore.
   Nota: La varietà di cellula in vitro utilizzati in questo protocollo è una linea cellulare di glioblastoma U87 che esprimono stabilmente cluster di differenziazione 4 (CD4) e umani CXCR4 ed è stato descritto in precedenza¹⁷. Espressione di superficie delle cellule di CD4 e CXCR4 è continuamente monitorata tramite flusso cytometry e livelli di espressione restano costanti nel tempo (~ 100% CD4⁺ e ~ 100% CXCR4⁺ cellule). Una descrizione dettagliata della generazione della linea cellulare usato e la procedura di citometria a flusso per indagare i livelli di espressione del recettore non è nell'ambito del presente protocollo.
   1. Cellule di sottocultura al confluency di 80-85%. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (RT) prima di coltura delle cellule.
   2. Rimuovere il medium di coltura condizionato dalle cellule e lavare il monostrato cellulare una volta con salino di 5 mL tamponato fosfato (PBS).
   3. Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA 0.25% e distribuirlo uniformemente sopra strato monomolecolare della cellula. Quindi rimuovere l'eccesso di tripsina-EDTA e incubare fino a 5 min a 37 ° C fino a quando le cellule cominciano a staccare.
   4. Aggiungere 10 mL di coltura fresca completa (di Dulbecco Medium (DMEM dell'Aquila per volta) + 10% siero bovino fetale (FBS) + 0,01 M HEPES + agenti di selezione appropriata). Risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 50 mL.
   5. Contare il numero di cellule vitali utilizzando un metodo di scelta. Nel caso di cellule di glioblastoma U87, redditività generalmente raggiunge ~ 100%.
      Nota: I numeri delle cellule possono essere determinati in diversi modi. Utilizziamo abitualmente un sistema di analisi delle cellule automatizzato basato su trypan blu colorazione (Vedi Tabella materiali) secondo lo standard di gestione delle procedure, ma altre maniere dovrebbe funzionare altrettanto bene.
   6. Aggiungere 2 x 10⁶ o 3 x 10⁶ cellule (vitali) ad un volume finale di 25 mL di terreno di crescita fresco in un matraccio di cultura T75 e incubare a 37 ° C e 5% CO₂.
      Nota: Se vengono utilizzate 3 x 10⁶ cellule le cellule raggiungerà confluency di 80-90% dopo 2 giorni. Se vengono utilizzate 2 x 10⁶ cellule, raggiungeranno la confluenza stessa dopo 3 giorni. Il tasso di crescita delle cellule in primo luogo dovrebbe essere determinato empiricamente se vengono utilizzate altre linee cellulari.

2. semina delle cellule per il dosaggio di mobilizzazione di Ca^{2 +}

1. Al giorno del passaggio (giorno 0), cappotto nero-murato polistirolo piastre da 96 pozzetti con clear cella inferiore (Vedi Tabella materiali) con una soluzione di gelatina di 0,1% per facilitare il collegamento delle cellule.
   Nota: Rivestimento delle piastre a 96 pozzetti con gelatina potrebbe essere omessa se vengono utilizzate piastre prepatinati, che sono disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali). Si consiglia di valutare l'uso di piastre prepatinati invece di rivestimento manuale per ogni linea cellulare sotto inchiesta prima di continuare con il protocollo.
   1. Preparare la soluzione di gelatina aggiungendo 1 g di gelatina per 100 mL di PBS per ottenere una soluzione di 1%. Diluire 10 volte con PBS prima dell'ulteriore uso. Per migliorare la solubilità di gelatina, riscaldare la soluzione a 37 ° C.
   2. Aggiungere 100 µ l di soluzione di gelatina di 0,1% per pozzetto della piastra 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare per 2 ore a RT.
2. Nel frattempo, preparare le celle per la semina della piastra 96 pozzetti rivestiti.
   1. Staccare le cellule nel matraccio di cultura, li risospendere in terreno di coltura fresco e contarli utilizzando il metodo di colorazione blu di trypan.
   2. Rotazione verso il basso le cellule in una provetta da 50 mL per 5 min a 400 x g a TA.
   3. Risospendere le cellule in terreno di coltura fresco (DMEM 10% FBS + 1% HEPES, senza antibiotici) per ottenere una densità cellulare di 0.1 x 10⁶ (vitali) cellule/mL.
3. Rimuovere la soluzione di gelatina delle placche con pareti nero con fondo chiaro da lanciare sopra la piastra e asciugarlo su un tessuto. Aggiungere 200 µ l/pozzetto PBS per rimuovere l'eccesso gelatina e capovolgere nuovamente la piastra.
4. Dispensare 200 µ l di sospensione cellulare (corrispondente a 0.2 x 10⁵ celle) per pozzetto della piastra 96 pozzetti rivestite con gelatina (da ora uno questa piastra verrà essere denominato la "piastra di misurazione").
5. Incubare la piastra durante la notte a 37 ° C e 5% CO₂.

3. caricamento delle cellule con una fluorescente Ca^{2 +} -colorante sensibile

1. Al giorno 1 eseguire l'effettivo Ca^{2 +} mobilizzazione analisi, a partire con caricamento delle cellule seminate con il fluorescente Ca^{2 +}-associazione tintura fluo-2 AM.
   1. Preparare il tampone aggiungendo 40 mL HEPES (1 M) di soluzione salina bilanciata di Hank 200ml (HBSS, 10x, nessun rosso di fenolo, non bicarbonato di sodio). Aggiungere acqua ultrapura per ottenere un volume finale di 2 L e aggiungere 4G albumina di siero bovino (BSA). Sciogliere la BSA tramite agitazione magnetica. Regolare il pH a 7.4 (con NaOH) e filtrare la soluzione.
      Nota: Durante tutti i passaggi seguenti viene utilizzato lo stesso buffer, indicato come "tampone".
   2. Preparare una soluzione stock (4 mM di solfossido dimetilico (DMSO)) di fluorescente Ca^{2 +}-sensibile tingere fluo-2 AM. Evitare un'eccessiva esposizione alla luce. Sciogliere 1 mg fluo-2 AM (peso molecolare: 1.061 g/mol) in 235.6 µ l DMSO.
   3. Preparare una soluzione di lavoro di fluo-2 AM. Per una piastra a 96 pozzetti saggio mescolare 12,5 µ l della soluzione di riserva di fluo-2 AM (4 mM) e 12,5 µ l tensioattivo non ionico poliolo (ad es., f-127 pluronic) soluzione (20% peso/volume in DMSO, Vedi Tabella materiali). Aggiungere 22 µ l di questa miscela al tampone del saggio di 11 mL in una provetta da 15 mL. La concentrazione finale di fluo-2 AM è 4 µM.
      Nota: Il tensioattivo non ionico è usato come agente di dispersione per migliorare la solubilità acquosa di fluo-2 AM e, di conseguenza, per migliorare il caricamento delle cellule. Per solubilizzare tensioattivo in DMSO, riscaldare il campione a 37 ° C e mescolare regolarmente fino a ottenere una soluzione omogenea.
   4. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule precedentemente seminate nella piastra 96 pozzetti misura da lanciare sopra la piastra e asciugare su carta assorbente.
   5. Aggiungere 100 µ l di soluzione colorante per pozzetto usando una pipetta multicanale di caricamento e incubare per 45 min a RT nel buio.

4. preparazione del polipropilene di 96 pozzetti piastre contenenti il ligando chemochina CXCL12 o i composti sotto inchiesta

1. Ottenere le piastre da 96 pozzetti fondo tondo in polipropilene (PP) (Vedi Tabella materiali).
   1. Consentire la soluzione di riserva di CXCL12 (1 mg/mL) e la soluzione di riserva dei composti in esame per equilibrare a TA.
      Nota: La soluzione madre di CXCL12 è preparata in acqua ultrapura completati con 0,01% Tween20 e conservati a-20 ° C come le aliquote monouso.
   2. Preparare una soluzione concentrata di CXCL12 nel tampone di 5x (250 ng/mL che è uguale a 31,25 nM) e un 5 x diluizione concentrato di ogni composto (in tampone del saggio).
   3. Dispensare le soluzioni stock nella piastra a 96 pozzetti appropriata secondo un layout predefiniti piastra. Pipettare 75 µ l/pozzetto nella piastra che contiene CXCL12 (la "piastra di chemokine"), dispensare 50 µ l/pozzetto nella piastra che contiene i composti (il "piatto composto").
      Nota: Entrambi composti e CXCL12 diventerà finalmente diluito 5 x al momento di erogazione nella piastra di misurazione. Inoltre è importante includere i pozzetti di controllo negativo contenente solo tampone del saggio in entrambi il piatto composto come pure la piastra di chemokine. Anche pozzetti di controllo positivo devono essere inclusi (cioè, pozzetti con CXCL12 nella piastra di chemokine, ma con tampone in rispettivi pozzetti della piastra composto).

5. protocollo impostazioni il lettore di micropiastre di fluorescenza

Nota: Il lettore di micropiastre fluorescenza utilizzato nel presente protocollo viene definito nella Tabella materiali.

1. Accendere il refrigeratore del lettore della piastra di fluorescenza e poi accendere il lettore di fluorescenza stesso. Lasciate avviare per pochi minuti e aprire il software del sistema.
2. Creare il protocollo del dosaggio usando il menu di drag-and-drop che include i seguenti passaggi:
   1. Nella finestra "Impostazioni", selezionare 'Read_Mode' con lunghezza d'onda di eccitazione: 470-495 nM; lunghezza d'onda di emissione: 515-575 nM.
      Nota: Le lunghezze d'onda selezionate sono idonee all'uso con il Ca^{2 +}-sensibili colorante fluo2.
   2. Includere la casella "Mix con TF" (fluido termovettore) per miscelazione automatica dei composti nel piatto composto, che sarà messo nella posizione di origine 2 del dispositivo (Vedi punto 6.4). Selezionare 15 µ l di soluzione in ciascun pozzetto automaticamente essere aspirato e misto tre volte. Regolare l'altezza delle punte di pipetta a 20 µ l sotto la superficie del liquido. Impostare la velocità di aspirazione e di erogazione a 50 µ l/s.
      Nota: L'altezza delle punte di pipetta si riferisce al volume che è rimasto sotto le punte di pipetta. Per esempio, se i pozzetti di una piastra composto contengono 50 µ l, un'altezza di 30 µ l corrisponde a 20 µ l sotto la superficie del liquido. Il volume del composto soluzione adottate per mescolare, la velocità di miscelazione, la posizione della pipetta consigli durante la miscelazione, e il numero di cicli di miscelazione possa essere registrato utilizzando il software.
   3. Nella finestra di "Trasferimento fluido", definire quel 20 µ l di ogni bene dal piatto composto sarà trasferito nella piastra di misurazione. Posizionare i puntali a 20 µ l sotto il liquido in superficie cioè, presso altezza 30 µ l durante l'aspirazione dei composti e altezza 60 µ l durante l'erogazione della piastra di misurazione. Impostare la velocità di aspirazione a 50 µ l/s e la velocità di erogazione 25 µ l/s.
      Nota: La piastra composta contiene 50 µ l di soluzione per pozzetto (Vedi punto 4.1.3), così un'altezza di 30 µ l corrisponde a una posizione 20 µ l sotto la superficie del liquido. La piastra di misurazione conterrà 80 µ l di tampone di dosaggio per pozzetto (Vedi punto 6.3), un'altezza di 60 µ l corrisponde dunque ad una simile posizione delle punte.
   4. Selezionare il pulsante "Lettura con TF". Durante il primo intervallo, selezionare 60 letture (fluorescente misure) con un tempo di intervallo di lettura di 1 s. Definisci che 10 letture vengono registrate prima dell'erogazione dei composti nella piastra di misurazione e 50 legge in seguito. Definire l'intervallo di secondi con una lettura intervallo di tempo di 30 s e 18 letture.
      Nota: Durante questa fase fluorescenza si misurerà cineticamente (a intervalli di tempo definiti) per ~ 10 min in totale.
   5. Includere il pulsante "Wash consigli" nel protocollo tre volte. All'interno di ogni fase di lavaggio, selezionare il tipo di fluido: fluido (acqua ultrapura) o fluido B (70% di etanolo), il numero di cicli di lavaggio (1), la pompa di velocità (veloce), e lavare il numero dei colpi (5) durante ogni passaggio.
      Nota: Durante il primo e l'ultimo lavaggio passaggio fluido è utilizzato A, durante il secondo fluido di passaggio lavaggio che b viene utilizzato.
   6. Includono la funzione "Pausa pipettatore". Impostare il pipettatore per mettere in pausa per 300 s.
      Nota: Inserendo questo passaggio nel protocollo, la testa del pipettatore, che è integrata nel dispositivo di lettore di piastra di fluorescenza, verrà sospesa per 5 min prima di continuare il protocollo.
   7. Includere la casella "Mix con TF" per consentire la miscelazione automatica della soluzione CXCL12 nella piastra di chemochine, che verrà posizionata nella posizione di origine 3 del dispositivo (Vedi punto 6.4). Selezionare 15 µ l di soluzione in ciascun pozzetto automaticamente essere aspirato e misto tre volte. Durante l'aspirazione e la miscelazione, posizionare i puntali di pipetta 20 µ l sotto la superficie del liquido. La velocità di aspirazione e di erogazione è impostata a 50 µ l/s.
      Nota: Simile per quanto riguarda il punto 5.2.2, questi parametri possono essere regolati.
   8. Nella finestra di dialogo successiva "Trasferimento fluido", definire quel 25 µ l di ogni bene di chemochina piastra sarà trasferito nella piastra di misurazione. Posizione suggerimenti 20 µ l sotto il liquido in superficie cioèa altezza 55 µ l durante l'aspirazione dalla piastra di chemokine che contiene 75 µ l/pozzetto (Vedi punto 4.1.3) e all'altezza 80 µ l durante l'erogazione della piastra di misurazione. Impostare la velocità di aspirazione a 50 µ l/s e la velocità di erogazione 25 µ l/s.
   9. Includere il pulsante "Lettura con TF". Durante il primo intervallo, selezionare 145 letture con un tempo di intervallo di lettura di 1 s. Definisci che 5 letture vengono registrate prima di erogare CXCL12 nella piastra di misurazione e 140 legge in seguito. Definire l'intervallo di secondi con una lettura intervallo di tempo di 6 secondi e poi selezionare 20 letture.
      Nota: Presi insieme, in tutta l'intero protocollo 243 letture (fluorescente misure) vengono registrate: 78 al punto 5.2.4 e 165 durante passaggio 5.2.9.
   10. Simile al punto 5.2.5, includere il pulsante "Lavare suggerimenti" tre volte nel protocollo.
       Nota: Tra cui questo passaggio alla fine del protocollo permette che le punte sono ri-utilizzabili per eseguire un altro test senza dover modificare i suggerimenti.
3. Impostare la temperatura del dispositivo a 37 ° C facendo clic sul pulsante "Set temperatura fase" e selezionando il 37 ° C.

6. eseguire l'analisi di fluorescenza

1. Dopo la misurazione piastra ha incubato con buffer per 45 min di carico (Vedi punto 3.1.5), rimuovere il buffer da lanciare sopra la piastra e asciugarlo su un tessuto.
2. Lavare le cellule seminate con l'aggiunta di 150 µ l/pozzetto di tampone del saggio e incubare per 2 min.
3. Rimuovere di nuovo il buffer da lanciare sopra la piastra. Aggiungere 80 µ l/pozzetto di tampone con una pipetta multicanale.
4. Inserirlo nel dispositivo al loro posizione appropriata di tutti i piatti: il piatto composto dalla posizione di origine 2, la piastra di chemokine dalla posizione di origine 3 e la piastra di misurazione presso la posizione di lettura. Mettere una scatola di punte nere nella posizione di suggerimenti di origine 1. Chiudi porta del dispositivo e incubare per 5 minuti prima di continuare il protocollo.
5. Selezionare il pulsante "Protocollo segnale test" per determinare l'unità di luce relativa (RLU) di sfondo e la varianza di fluorescenza sopra la piastra. Una nuova finestra pop-up. Selezionare "Segnale di prova".
   Nota: Durante questa fase, sfondo RLU sono determinati dalla telecamera ICCD, che è integrata nel comparto del dispositivo lettore fluorescenza ottica. Questi RLU derivare dall'eccitazione del Ca^{2 +}-sensibili dye (fluo-2) da diodi luminosi (LED) (LED lunghezza d'onda di uscita 470-495 nm). Valori di 8.000-10.000 RLU sono adatti per questa applicazione. RLU può, se necessario, essere adattato modificando l'intensità di eccitazione (selezionare escl. intensità), o il cancello di fotocamera (selezionare cancello aperto). La varianza sopra la piastra dovrebbe idealmente essere inferiore al 7,5%.
6. Selezionare "Aggiorna" Se si ottengono valori di fondo di 8.000-10.000 RLU. Salvare il protocollo principale facendo clic sul pulsante Salva.
   Nota: In questo modo, le impostazioni del test di segnale di protocollo si svolgerà al protocollo principale.
7. Eseguire il test premendo il pulsante "Esegui".

7. dati analisi e qualità

1. Una volta terminata l'analisi, è possibile aprire la casella di "Analisi" nel software del sistema.
   1. Vai a "configurare le correzioni" e scegli "risposta sulla linea di base". Definire la linea di base 1 per iniziare a misura 1 e fine alle misura 5; verrà calcolata la media di fluorescenza in ciascun pozzetto tra misura 1 e 5.
      Nota: Tutte le misurazioni da un particolare bene sono divisi da questa linea di base ben specifiche 1.
      1. Definire la linea di base 2 per iniziare a misura 78 fino alla misura 83 (CXCL12 viene erogata dopo misura 83; nuovamente la media di fluorescenza è calcolata in ogni bene tra fattore di correzione della misura 78 e 83 e questo viene applicato a tutte le misurazioni seguendo misura 83).
   2. Attivare la casella di spunta "Mostra come percentuale" e "sottrarre sfondo".
   3. Vai a "Configurare la riduzione del cinetica". Per valutare l'effetto inibitorio dei composti sulla risposta indotta da CXCL12 Ca^{2 +} , scegliere Max-Min a partire dalla misura 84 (vale a dire, la prima misura dopo il quale viene erogata CXCL12) a 243 (cioè, la misura finale).
      Nota: Scegliendo Max-Min la differenza tra la risposta minima e massima rispetto al basale tra misura 84 e misura 243 è segnalato. Se il Max-Min è scelto a partire tra misura 11 e misura 78, la differenza tra la risposta minima e massima rispetto al basale rispetto al basale 1 è segnalata. Questo valore può essere utilizzato per analizzare il potenziale attività agonistica dei composti, Vedi discussione).
   4. I dati verranno visualizzati nel software del sistema. Se necessario, è possibile esportare i dati grezzi per ulteriore analisi e la visualizzazione in altri comuni pacchetti software di analisi.

Risultati

L'effetto della stimolazione CXCL12 con la mobilizzazione intracellulare di Ca^{2 +} nel U87. CD4.CXCR4⁺ e U87. Cellule CD4 è stata valutata con il test di mobilizzazione di Ca^{2 +} . Invece di 20 µ l del composto in esame che normalmente verrebbero aggiunti durante il primo passaggio di pipettaggio del protocollo (Figura 1), il tampone del saggio è stato aggiunto al fluo-2am caricato U87. CD4.CXCR4⁺ cellule nella piastr...

Discussione

Il Ca^{2 +}-saggio di mobilitazione qui descritto precedentemente è stato indicato per essere un valido strumento per identificare e caratterizzare antagonisti del recettore CXCR4¹⁷di targeting. Si prevede, tuttavia, che questo metodo può essere applicato più generalmente a un folto gruppo di altri GPCR che innescano un Ca^{2 +} rilascio citosolico al momento della loro attivazione, come illustrato per il ricevitore di chemokine correlate CCR5. Considerando che nel caso di CCR5 pot...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	colorante fluorescente sensibile al Ca2+
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G	acido pluronico
Gelatina	Sigma	G9391
AMD3100	Sigma	A5602-5 mg	antagonista specifico CXCR4
Maraviroc	gentile dono del		, antagonista CCR5
Legante delle chemochine CXCL12	PeproTech	300-28A
Ligando delle chemochine CCL5	PeproTech	300-06
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma	A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS (10 x), calcio, magnesio, senza rosso fenolo	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1 M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Tripsina-EDTA (0,25 %), rosso fenolo	Gibco (Life Technologies)	25200-056
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Provette Falcon, 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
Pallone per coltura tissutale (T75)	Corning	353024
Piastra nera, 96 pozzetti, fondo trasparente, con coperchio	10530753 Costar/Fisher Scientific		(96 pozzetti), per la semina cellulare
Piastre in polipropilene (PP)	Piastre Thermo Scientific (VWR)	732-2661	utilizzate per preparare le piastre composte e le chemochine piastre, fondo tondo
FLIPR Tetra sistema di screening cellulare ad alta produttività	Molecular Devices		Lettore di piastre fluorescenti con testa pipettatore integrata e telecamera ICCD
Modulo LED FLIPR Tetra 470 - 495 nm	Molecular Devices	0200-6128	Diodi emettitori di luce per l'eccitazione del colorante fluorescente sensibile al Ca2+
Filtro di emissione FLIPR Tetra 515 - 575 nm	Molecular Devices	0200-6203	filtro di emissione compatibile con il colorante fluorescente
FLIPR Tetra 96 Head	Molecular Devices	0310-4536	Testa pipettatrice a 96 pozzetti, integrata nel lettore di piastre fluorescenti
ScreenWorks	Molecular Devices		pacchetto software utilizzato per l'analisi e la visualizzazione dei dati sull'analizzatore
Corning CellBIND 96 pozzetti a fondo chiaro Micropiastre in polistirene nero, con coperchio, sterili	Corning	3340	Piastre per saggi pre-rivestite a 96 pozzetti che possono rappresentare un'alternativa al rivestimento manuale della piastra per saggi.