Qui, presentiamo un protocollo per produrre cellule NK murine silenziamento genico utilizzando un sistema di differenziazione privo di alimentatore per studi meccanicistici in vitro e in vivo.
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Articolo metodologico
Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule natural killer (NK) appartengono al sistema immunitario innato e sono una difesa immune prima linea anti-cancro; Tuttavia, essi vengono soppressi nel microambiente tumorale e il meccanismo di fondo è ancora in gran parte sconosciuto. La mancanza di una fonte affidabile e coerenza delle cellule di NK limita i progressi della ricerca di immunità delle cellule NK. Qui, segnaliamo un sistema in vitro che in grado di fornire alta qualità e quantità derivate da midollo osseo murine delle cellule di NK in una condizione senza alimentatore. Ancora più importante, inoltre dimostriamo che con successo silenziamento genico mediato da siRNA inibisce la maturazione delle cellule NK E4bp4-dipendente utilizzando questo sistema. Così, questa romanzo in vitro cellule NK differenziazione del sistema sono una soluzione di biomateriale per ricerca di immunità.
Introduzione
Progressione del cancro dipende in larga misura il tumore microambiente1,2, tra cui immunociti host-derivato, ad esempio, le cellule NK. Numerosi studi hanno dimostrato che le cellule NK intratumoral sono correlate negativamente con la progressione del tumore3,4. Inoltre, studi clinici hanno mostrato che la terapia adottiva delle cellule NK è una possibile strategia per cancro5,6,7,8,9
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Protocollo
Il protocollo per ottenere e differenziazione NK derivate da midollo osseo cellule (BM-NK) si basa su metodi precedentemente pubblicati20,21,22. Tutte le procedure con i topi sono state approvate da animale etica sperimentale Comitato (AEEC) presso l'Università cinese di Hong Kong.
1. preparazione del Medium condizionato OP9
- Cultura la linea cellulare murina stroma OP9 in alfa-MEM contenente 20% FBS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina, a 37 ° C in atmosfera umidificata di aria/CO2 (95%: 5%).
- Contare....
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Risultati
Risultati rappresentativi sono ottenuti seguendo il protocollo descritto. Cellule in sospensione totale del midollo osseo sono state coltivate sotto il sistema di differenziazione privo di alimentatore per 11 giorni; significativo aumento nel tasso di proliferazione è stata osservata di giorno 7 rispetto al numero delle cellule totali il giorno 0 (Figura 1A). Cellule NK mature con alto rapporto nucleare citoplasmico e citoplasma ricco di gran.......
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Discussione
Nel presente lavoro, abbiamo descritto un metodo novello per la produzione di cellule NK murina derivanti dal midollo osseo in vitro. L'alimentatore delle cellule nel sistema originale21,22 è sostituito con successo dal medium condizionato delle cellule OP9, che in gran parte aumentata la stabilità del sistema di differenziazione. Inoltre, il sistema può produrre elevate quantità e purezza di NK maturo cellule per in vitro come pure in vivo<.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Research Grants Consiglio di Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) l'innovazione e fondo della tecnologia di Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), sovvenzione diretta per ricerca-CUHK (2016.035) e studioso di Hong Kong Programma.
H.-Y.L. progettato e supervisionato tutti gli esperimenti e contribuito alla preparazione del manoscritto. P.M.-K.T. eseguirono degli esperimenti, hanno analizzato i dati e ha contribuito alla preparazione del manoscritto. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., d.-M.W., e G.-Y.L. raccolti campioni animali e partecipato negli esperimenti sugli animali. J.S., X.-R.H.....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linea cellulare OP9 | ATCC ATCC | sup>® CRL-2749&commercio; | |
| MEM α, senza nucleosidi | Gibco | 22561021 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010049 | |
| Murina ricombinante IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Murina ricombinante SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Murina ricombinante Flt3-ligando | PEPROTECH | 250-31L | |
| ricombinante murino IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX reagente di trasfezione | Invitrogen | 1377815 | |
| tampone di fissazione IC | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Tampone per colorazione per citometria a flusso | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-coniugato anti-topo CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-coniugato anti-topo NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Controllo senza senso (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA contro topo E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& primo; |
Riferimenti
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on the....
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Ristampe e permessi
