Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cellule NK murine silenziamento genico utilizzando un sistema di differenziazione privo di alimentatore per studi meccanicistici in vitro e in vivo.

Abstract

Cellule natural killer (NK) appartengono al sistema immunitario innato e sono una difesa immune prima linea anti-cancro; Tuttavia, essi vengono soppressi nel microambiente tumorale e il meccanismo di fondo è ancora in gran parte sconosciuto. La mancanza di una fonte affidabile e coerenza delle cellule di NK limita i progressi della ricerca di immunità delle cellule NK. Qui, segnaliamo un sistema in vitro che in grado di fornire alta qualità e quantità derivate da midollo osseo murine delle cellule di NK in una condizione senza alimentatore. Ancora più importante, inoltre dimostriamo che con successo silenziamento genico mediato da siRNA inibisce la maturazione delle cellule NK E4bp4-dipendente utilizzando questo sistema. Così, questa romanzo in vitro cellule NK differenziazione del sistema sono una soluzione di biomateriale per ricerca di immunità.

Introduzione

Progressione del cancro dipende in larga misura il tumore microambiente^1,2, tra cui immunociti host-derivato, ad esempio, le cellule NK. Numerosi studi hanno dimostrato che le cellule NK intratumoral sono correlate negativamente con la progressione del tumore^3,4. Inoltre, studi clinici hanno mostrato che la terapia adottiva delle cellule NK è una possibile strategia per cancro^5,6,7,8,9. L'immunoterapia del cancro basati su cellule NK recentemente è stato suggerito come opzione terapeutica per i tumori solidi, ma sfide esistano dovuto la secrezione di citochine immunosoppressive e downregulation di attivazione ligandi nel microambiente dei tumori solidi ^10,11. Trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) è stato suggerito per svolgere un ruolo soppressivo nella carcinogenesi, ma paradossalmente le cellule tumorali producono anche TGF-β1 per supportare il tumore sviluppo^{12,13,14 , 15}. segnalazione di TGF-β può sopprimere l'attività citolitica delle cellule di NK via giù-regolando la velocità di risposta dell'interferone e CD16-mediata di interferone-gamma (IFN-γ) produzione in vitro^{16,17, 18}.

Anche se la rottura di segnalazione di TGF-β nel microambiente tumorale possa essere un modo possibile per l'eliminazione dei tumori, bloccando completamente segnalazione di TGF-β causerà malattie autoimmuni grazie alla sua funzione di anti-infiammatori, come testimoniano lo sviluppo della effetti collaterali tra cui l'infiammazione sistemica, difetti cardiovascolari e autoimmunità nel topo modelle¹⁹. Così, la comprensione del meccanismo di funzionamento di TGF-β-mediata immunosoppressione porteranno all'identificazione di un accessibile obiettivo terapeutico per il trattamento del cancro.

Per delucidare gli eventi molecolari necessari per lo sviluppo delle cellule NK, Williams et al. stabilite un sistema in vitro per la differenziazione di cellule staminali emopoietiche del midollo osseo murino in NK cells²⁰. Questo sistema facilita in gran parte lo studio meccanicistico di sviluppo delle cellule NK, compresa l'individuazione di nuovi progenitori delle cellule NK²¹. Tuttavia, i progenitori di midollo osseo dovrebbero essere coltivati nel sistema con il supporto di cellule stromali OP9 come un alimentatore strato^20,21, e questa popolazione cellulare eterogenea limita in gran parte l'applicazione ulteriore gene di interruzione strumenti (ad es., silenziamento genico mediato da siRNA) specificamente applicata per la differenziazione delle cellule NK.

Qui, descriviamo un sistema privo di alimentatore che è stato sviluppato modificando ulteriormente il sistema in vitro di Williams et al.²⁰. Nel nostro sistema, le cellule stromal alimentatore OP9 non sono necessari, e invece OP9 medium condizionale è usato senza influenzare la differenziazione delle cellule NK in vitroe questo recentemente ci portano a scoprire che il TGF-β è in grado di promuovere la progressione del cancro tramite sopprimere lo sviluppo delle cellule NK E4bp4-dipendente nel microambiente tumorale²². Questo nuovo sistema fornisce con successo un metodo privo di sfondo per delucidare il meccanismo molecolare di sviluppo delle cellule NK in condizioni specifiche (ad es., alta TGF-β1, silenziamento genico mediato da siRNA, ecc.) in vitro.

Protocollo

Il protocollo per ottenere e differenziazione NK derivate da midollo osseo cellule (BM-NK) si basa su metodi precedentemente pubblicati^20,21,22. Tutte le procedure con i topi sono state approvate da animale etica sperimentale Comitato (AEEC) presso l'Università cinese di Hong Kong.

1. preparazione del Medium condizionato OP9

1. Cultura la linea cellulare murina stroma OP9 in alfa-MEM contenente 20% FBS, 100 U/mL di penicillina G e 100 µ g/mL di streptomicina, a 37 ° C in atmosfera umidificata di aria/CO₂ (95%: 5%).
   1. Contare le celle con un emocitometro, poi seme 2 x 10⁶ delle cellule OP9 per ciascun matraccio di cultura² 75cm con 15 mL di terreno. Cultura per 48 h.
   2. Quando la cultura raggiunge 80% confluenza, lavare il matraccio con 10 mL di PBS e aggiungere 20 mL di pianura medio di alfa-MEM (senza FB e antibiotici) per fiaschetta.
2. Raccogliere il mezzo di condizione OP9 nel matraccio di cultura a 24 h, ripulire i detriti cellulari con 0,25 µm in polietersulfone (PES) filtro e conservare a 4 ° C (uso entro 2 settimane).

2. isolamento delle cellule del midollo osseo del topo

1. Eutanasia di un mouse C57BL/6J 12-week-old con un sovradosaggio di pentobarbitone (100 mg/kg, l'iniezione intraperitoneale). Confermare la morte dalla mancanza di respirazione, quindi raccogliere le ossa di femore con un taglio di coltello chirurgico alle giunzioni tra le ossa e rimuovere i muscoli restanti con la lama graffiando delicato.
2. Mettere le ossa in una provetta da centrifuga 50 mL contenente refrigerati sterile alfa-MEM e quindi eseguire la procedura seguente in una cappa di biosicurezza.
3. Eliminare il terreno di alfa-MEM e sciacquare le ossa con etanolo al 70% per 30 s.
4. Lavare le ossa con PBS sterile ghiacciata due volte per ripulire l'etanolo rimanente.
5. Trasferire le ossa in un mortaio contenente 5 mL di PBS ghiacciata, e delicatamente frammentano le ossa con un pestello (non polverizzare li).
6. Agitare delicatamente le ossa agitando il pestello per rilasciare cellule del midollo osseo in PBS. Raccogliere le cellule del midollo osseo contenente PBS in una nuova provetta da centrifuga 50 mL.
7. Ripetere il passaggio 2.6 per quattro volte fino a quando diventano i frammenti di osso solido bianco a colori.
8. Centrifugare la provetta a 465 x g per 5 min a 4 ° C, quindi eliminare il supernatante.
9. Risospendere il pellet con 18 mL di acqua distillata sterile e lasciar riposare per 30 s per rimuovere le cellule di anima rosse.
10. Aggiungere 2 mL di 10 ghiacciata X PBS per arrestare la reazione, quindi filtrare la miscela attraverso un colino di cella di 70 µm per rimuovere cellule rosse del sangue lisate.
11. Centrifugare la provetta a 465 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con 20 mL di PBS ghiacciata.
12. Lavare le cellule ripetendo passo 2.11 una seconda volta.
13. Trasferire il pellet cellulare in una piastra Petri sterile 100 mm con 10 mL di mezzo di condizionale OP9 da passo 1.2 completati con 20% FBS e una miscela di 0,5 ng/mL murino IL-7, 30 ng/mL mouse SCF e flt3L murino di 100 U/mL.
14. Incubare il piatto a 37 ° C con 5% CO₂ per 2 h. trasferimento delle cellule non collegate in un nuovo contenitore di cultura ad una densità di 5 x 10⁵ vitali cellule/mL (numero di celle di un emocitometro con esclusione del blu di trypan) con la stessa formula media come descritto al punto 2.13 e incubare a 37 ° C con 5% CO₂.
15. Il giorno 4, cambia la condizione di cultura medio condizionale OP9 completati con 20% FBS e 2.000 U/mL del-2 murino.
16. Aggiornare il terreno di coltura ogni 3 giorni; cellule NK mature possono essere ottenute da giorno 7 e qualificate come nella sezione 4.

3. mediata da siRNA Gene Silencing differenziazione delle cellule di NK

1. Il controllo di siRNA o sciocchezze (NC) con un agente di transfezione secondo il manuale del prodotto della premiscela.
2. Eseguire il passaggio 3.1 in qualsiasi momento dal giorno 0.
3. Aggiungere il 50 nM di siRNA o NC miscela alle cellule da passo 2.14.
4. Ripetere il passaggio 3.1 su ogni media rinfresco (ad es., giorno 0, 4 e 7) fino al punto finale sperimentale.

4. analisi di differenziazione delle cellule NK mediante citometria a flusso

1. Ad un momento opportuno, raccogliere la sospensione di differenziazione delle cellule e lavare con PBS ghiacciata.
2. Fissare le cellule con buffer di fissazione delle cellule secondo il manuale del prodotto.
3. Lavare le cellule fisse con PBS ghiacciata e quindi risospendere 1 x 10⁶ cellule in 100 µ l di Buffer di macchiatura Cytometry di flusso contenente Cy3-coniugato anti-topo NKp46 e PE-coniugati di anticorpi anti-topo CD244 in un rapporto di diluizione di 1: 100.
4. Macchia il campione al buio a temperatura ambiente per 2 h.
5. Risospendere i campioni macchiati con 300 µ l di PBS, poi acquisire dati di FACS e analizzare con Cytobank piattaforma²⁰ (http://cytobank.org/).

Risultati

Risultati rappresentativi sono ottenuti seguendo il protocollo descritto. Cellule in sospensione totale del midollo osseo sono state coltivate sotto il sistema di differenziazione privo di alimentatore per 11 giorni; significativo aumento nel tasso di proliferazione è stata osservata di giorno 7 rispetto al numero delle cellule totali il giorno 0 (Figura 1A). Cellule NK mature con alto rapporto nucleare citoplasmico e citoplasma ricco di gran...

Discussione

Nel presente lavoro, abbiamo descritto un metodo novello per la produzione di cellule NK murina derivanti dal midollo osseo in vitro. L'alimentatore delle cellule nel sistema originale^21,22 è sostituito con successo dal medium condizionato delle cellule OP9, che in gran parte aumentata la stabilità del sistema di differenziazione. Inoltre, il sistema può produrre elevate quantità e purezza di NK maturo cellule per in vitro come pure in vivo<...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare OP9	ATCC ATCC	sup>® CRL-2749&commercio;
MEM α, senza nucleosidi	Gibco	22561021
Siero fetale bovino	Gibco	10500064
PBS, pH 7,4	Gibco	10010049
Murina ricombinante IL-7	PEPROTECH	217-17
Murina ricombinante SCF	PEPROTECH	250-03
Murina ricombinante Flt3-ligando	PEPROTECH	250-31L
ricombinante murino IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX reagente di trasfezione	Invitrogen	1377815
tampone di fissazione IC	eBioscience	00-8222-49
Tampone per colorazione per citometria a flusso	eBioscience	00-4222-26
PE-coniugato anti-topo CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-coniugato anti-topo NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Controllo senza senso (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA contro topo E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& primo;

<