Presentiamo un metodo per l'analisi di microfluidica di lignaggi di singola cellula batterica utilizzando Bacillus subtilis come esempio. Il metodo sormonta le imperfezioni dei tradizionali metodi analitici in microbiologia, consentendo l'osservazione di centinaia di generazioni di cellulari in condizioni di crescita uniforme e ben controllabile.
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Articolo metodologico
Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tecnologia microfluidica supera molte delle limitazioni ai tradizionali metodi analitici in microbiologia. A differenza dei metodi di cultura di massa, offre risoluzione cella singola e lunga osservazione volte spanning centinaia di generazioni; a differenza dell'agarosi basati su pad microscopia, ha condizioni di crescita uniforme che possono essere strettamente controllate. Perché il flusso continuo di crescita medio consente di isolare le cellule in un dispositivo microfluidico da imprevedibili variazioni nell'ambiente chimico locale causato dalla crescita delle cellule e del metabolismo, autentici cambiamenti nell'espressione genica e la crescita delle cellule in risposta a stimoli specifici possono essere osservati con maggiore sicurezza. Bacillus subtilis è utilizzato qui come una specie batterica di modello per dimostrare una "macchina madre"-digitare metodo per analisi cellulare. Vi mostriamo come costruire e scandagliare un dispositivo microfluidico, caricarlo con cellule, avviare la formazione immagine microscopica e di esporre le cellule ad uno stimolo di commutazione da una coltura a altra. Un reporter lo stress-sensible a reagire è utilizzato come esempio per rivelare il tipo di dati che possono essere ottenuti da questo metodo. Inoltre brevemente discutiamo ulteriori applicazioni di questo metodo per altre tipologie di esperimenti, quali l'analisi di sporulazione batterica.
Introduzione
Una delle caratteristiche più sorprendenti della vita sulla terra è la sua ottima resilienza e varietà. Un obiettivo centrale della biologia molecolare è di capire la logica con cui le cellule usano geni e proteine per massimizzare la loro crescita e fitness sotto un'ampia varietà di condizioni ambientali. Per raggiungere questo obiettivo, gli scienziati devono essere in grado di osservare con fiducia come crescono le singole celle, dividono ed esprimono loro geni sotto un dato insieme di condizioni, notando come le cellule rispondono alle successive modifiche nel loro ambiente. Tuttavia, i tradizionali metodi analitici in microbiologia hanno limitazioni tecniche che ....
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Protocollo
1. PDMS dispositivo Casting
- In un ambiente privo di polvere, mescolare polimero PDMS e agente indurente con un rapporto 10:1 e degassare sotto vuoto per almeno 10 min.
- Posizionare un maestro di silicio (o di una resina epossidica o poliuretano replica della stessa) su un pezzo di carta stagnola ininterrotta in una piastra di Petri in polistirolo. Versare il composto PDMS degassato sopra il padrone ad una profondità di circa 5 mm. Degas la piastra di Petri per almeno 10 min. uso un leggero getto d'aria per rompere le bolle superficiali.
Nota: Le dimensioni del dispositivo due-tiered utilizzato sono disponibili in accompagnamento....
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Risultati
Successo iniziale delle cellule di carico, come valutato da microscopia di contrasto di fase prima di collegare l'impianto idraulico di microfluidica al dispositivo, sarebbe considerato come avendo tutti o quasi tutti i canali di lato di microfluidica contenente uno o più cellule batteriche ( Figura 3A). Carico ottimale avrebbe mostrato diverse celle in ogni canale, ma canali comunque si riempiranno di cellule a causa della crescita delle cellule durante il p.......
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Discussione
Questo protocollo di microfluidica è flessibile in quanto molti dei passaggi possono essere modificate per ottimizzarne l'uso con una particolare specie o ceppo o per uno scopo specifico. In questo protocollo, infatti, abbiamo fatto modifiche al concetto "macchina madre" originale4 per ottimizzarne l'uso con Bacillus subtilis. Spesso, le trincee in cui le cellule sono confinate costituiscono una caratteristica di monostrato, considerando che in questo protocollo usiamo trincee di due-stra.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato finanziato dal National Institutes of Health, sotto GM018568. Questo protocollo è stato effettuato in parte al centro per sistemi su scala nanometrica (CNS), un membro della nazionale nanotecnologia coordinato infrastruttura rete (NNCI), che è sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio NSF n. 1541959. CNS è parte dell'Università di Harvard. Molte grazie sono dovuti Thomas Norman e Nathan Lord, per il loro lavoro nella ideazione e realizzazione del modello master utilizzato per i dispositivi mostrati qui e nella creazione della versione originale dell'apparato. Inoltre ringraziamo Johan Paulsson per i suoi preziosi consigli collabo....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit elastomero siliconico Sylgard 184 | Dow Corning | (240)4019862 | Questo è indicato come PDMS nel protocollo. Ci sono 2 componenti che vengono miscelati con un rapporto 10:1 |
| Punzone per biopsia da 0,75 mm | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1,5 vetro di copertura VWR | 48393 172 | ||
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Strumento utilizzato per incollare PDMS al vetro utilizzando il trattamento al plasma di ossigeno |
| Tygon tubo flessibile ID 0,02", OD 0,06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | Per la parte principale del tubo, ad esempio attaccato agli aghi |
| Tubo in silicone, 0,04" ID, 0,085" OD | Tubo in silicone standard HelixMark | 60-795-05 | Per valvole a manicotto e collegamento a giunzione a Y |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Utilizzato come agente di passivazione |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | Per il caricamento del dispositivo con fluido e celle |
| Filtro per siringa Acrodisc da 32 mm con 5-μ m Supor membrana | Pall Life Sciences | 4560 | Per filtrare le colture prima del caricamento del dispositivo |
| Aghi smussati da 21 ga, connettore | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| con punte serie 200, tubo ID da 1/16", polipropilene | Nordson Medical | Y210-6005 | L'azienda è AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E microscopio invertito | Nikon | Questa unità è stata interrotta dal produttore ed è stata sostituita dalla Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis ceppo NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | ceppo parentale wild-type modificato per l'uso negli esperimenti mostrati in questo protocollo |
| Forno a convezione a gravità | VWR | 414005-106 | per la polimerizzazione PDMS e la cottura assemblato dispositivi |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | può essere utilizzato per incollare un wafer di silicone a una piastra di supporto in alluminio |
| Nastro Scotch Magic, 3/4" di larghezza | 3M | per pulire la polvere dai dispositivi PDMS e per posizionare sopra le caratteristiche per aumentare la visibilità (indicato con "nastro da ufficio" o "nastro adesivo" nel protocollo) | |
| Stereomicroscopio | Nikon | SMZ800N | qui elencato a titolo di esempio; quasi tutti gli stereomicroscopi faranno |
| alcol isopropilico | Sigma-Aldrich | W292907 | Per pulire il vetro di copertura |
| Pompa Syring, 6 canali | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | un marchio di salviette senza polvere |
Riferimenti
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al.
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Ristampe e permessi
