Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.
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Articolo metodologico
Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nel tentativo di aumentare l'efficienza nella creazione di topi geneticamente modificati tramite metodologie delle cellule di ES, presentiamo un adattamento per l'attuale protocollo di iniezione di blastocisti. Qui segnaliamo che una semplice rotazione dell'embrione e iniezione attraverso massa cellulare Trans-interno (TICM) ha aumentato la percentuale dei topi chimerici dal 31% al 50%, con nessun equipaggiamento supplementare o ulteriore formazione specialistica. inbred 26 differenti cloni, e cloni totali 35 sono stati iniettati in un periodo di 9 mesi. Non c'era differenza significativa nel tasso di recupero di embrioni o di tasso di gravidanza tra tecniche di iniezione tradizionale e TICM. Pertanto, senza alcuna alterazione principali nel processo di iniezione e un semplice posizionamento della blastocisti e iniettare attraverso l'ICM, rilasciando le cellule ES nella cavità Blastocele possa potenzialmente migliorare la quantità di produzione chimerici e successive trasmissione nella linea germinale.
Introduzione
Per quasi 25 anni, la creazione di topi geneticamente mirati è stato un processo lento, spesso ostacolato da un collo di bottiglia nella fase blastocisti ES cella microiniezione per la generazione di germline trasmissione chimere. Gli avanzamenti recenti, tra cui CRISPR/Cas91,2 di targeting in cellule ES ed ES di alto-rendimento cella consorzi di generazione come KOMP, hanno migliorato la disponibilità/generazione di cellule geneticamente modificate ES. Tuttavia, la generazione di germline chimere rimane un collo di bottiglia nella creazione di topi geneticamente modificati da queste cellule ES
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Protocollo
Tutte le operazioni sono state eseguite come parte del normale funzionamento dell'impianto NIEHS Knock Out Mouse Core. Tutti i topi sono stati tenuti su un 12:12 ciclo di luce: scuro h e sono stati di alimentazione una dieta di NIH-31 e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato di uso del National Institute of Environmental Health Sciences e cura degli animali.
1. animale preparazione
- Razza di topi di donatore, B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j topi femmina a 8-10 settimane di età naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > il topo maschio/j tra 8 e 26 settimane di età. Tappi di verificare vis....
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Risultati
Trattamento linea cellulare come l'effetto casuale, un modello lineare di effetti misti è stato utilizzato per analizzare i dati nel software (ad es. SAS (versione 9.2)). Ogni analisi controllata per il numero di embrioni trasferiti e la linea cellulare. La seconda analisi anche controllata per il numero dei cuccioli che sono sopravvissuti.
Per questo studio, ogni linea cellulare ES e clone è stato iniettato entrambi con tradizi.......
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Discussione
Si è a lungo pensato che qualsiasi disturbo del ICM potrebbe portare alla mortalità, infatti, protocolli di microinjection di blastocisti correnti ancora avvertono di questo12,13. Quello che vi abbiamo mostrato qui è che microiniezione attraverso l'ICM non è dannosa per l'embrione e aumenta la resa delle chimere.
L'esatto meccanismo di questo effetto non è stato identificato. Tuttavia, la rottura meccanica del ICM e l'accompagnamento i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta [in parte] dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Si ringrazia Shyamal Peddada per l'analisi statistica. Desideriamo anche ringraziare Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao per la revisione di questo manoscritto e Franco DeMayo per il suo continuo supporto e consulenza.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago per iniezione ES Cell | Humagen | MSC-20-0 | |
| Dispositivo NSET | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (tecnologie per la vita) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (tecnologie per la vita) | 10439-024 | i lotti devono essere testati individualmente per la compatibilità con le celle ES. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-mercaptoetanolo | Sigma | M7522 | |
| Micro manipolatore | Leica | Micro manipolatore | |
| micro iniettore | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscopio | Leica | DM IRB | |
| Piatto a 4 pozzetti | Thermo Scientific | 176740 | |
| Piatto da 60 mm | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| topi svizzeri Webster | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
Riferimenti
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W.
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Ristampe e permessi
