Questo articolo viene descritto l'utilizzo dell'ecografia ad alta risoluzione in topi geneticamente ingegnerizzati cancro del pancreas. L'obiettivo primario è quello di fornire istruzioni precise per il rilevamento e la valutazione dei tumori pancreatici endogeni.
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Articolo metodologico
Utilizzando ultrasuoni ad alta risoluzione per Monitor l'inizio del tumore e la crescita nei modelli geneticamente del cancro del pancreas
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX-1-Cre modello murino (KPC) rappresenta un modello transgenico stabilito e frequentemente utilizzato per valutare nuove terapie nel cancro del pancreas. L'inizio del tumore è variabile nel modello KPC da 8 settimane a diversi mesi. Di conseguenza, strumenti di imaging non invasivo sono tenuti a schermo per l'inizio del tumore e monitor per la risposta al trattamento. Per risolvere questo problema, diversi approcci sono emerse negli ultimi anni. Ultrasuono di alta risoluzione ha importanti vantaggi quali la non invasività, tempi di sessione veloce e un'alta risoluzione di immagine senza esposizione a radiazioni. Tuttavia, ecografia nei topi non è banale e sufficiente conoscenza anatomica e competenze pratiche necessari per eseguire con successo ad ultrasuoni ad alta risoluzione in modelli preclinici di cancro del pancreas. Con il seguente articolo, una guida dettagliata di hands-on per ecografia addominale in modelli murini con un focus particolare su modelli endogeni del cancro del pancreas è presentata. Inoltre, viene fornito un riepilogo degli errori comuni e come evitarli.
Introduzione
Modelli murini geneticamente hanno acquisito un'importanza crescente nella ricerca sul cancro dovuto la loro capacità di ricapitolare strettamente la natura complessa di carcinogenesi umana1,2,3. Uno dei più frequentemente usati modelli per studiare lo sviluppo del cancro del pancreas, progressione e risposta terapeutica è caratterizzata da una mutazione d'attivazione nell'oncogene Kras combinato con un'inattivazione del soppressore del tumore p534. Questo LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX-1-Cre modello murino (KPC) imita la progressione graduale dalle lesioni pre-invasive neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanIN) a carcinoma invasivo. Fenotipicamente, quasi tutti i topi sviluppano PDAC entro i primi sei mesi dopo la nascita. Tuttavia, rispetto ai modelli trapiantati, il modello KPC rivela un'insorgenza di tumore altamente variabile da 8 settimane a parecchi mesi4. Una volta che i tumori pancreatici raggiungono una certa dimensione (5-9 mm di diametro), rapidamente accelera la crescita del tumore e topi dovrà essere arruolati in studi preclinici5. Pertanto, la rilevazione esatta di inizio del tumore e la dimensione del tumore è un prerequisito essenziale per la logistica di studio preclinico e monitoraggio della terapia. In generale, diversi approcci come la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI)6, esame7,8,9 o ultrasuono di alta risoluzione di tomografia computata possa essere impiegata per condurre lo screening del tumore e terapia10. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi. Anche se MRI- o la tomografia computata (CT)-imaging permette l'acquisizione di dati ad alta risoluzione così come il calcolo del volume accurato, tempo prolungato esame sotto sedazione generale e attrezzature molto costose sono richiesta e non consentono frequenti scansione per un lungo periodo di tempo. Al contrario, piccolo animale ecografia è un metodo stabilito che possa essere impiegato per lo screening per le patologie addominali topi11. I vantaggi di questo metodo di imaging sono brevi tempi, alta risoluzione, di scansione e la possibilità di utilizzare l'ultrasuono di doppler o contrasto migliorato ultrasuono (CEUS) per visualizzare la perfusione degli organi in parallelo. Tuttavia, le conoscenze anatomiche, 3D fantasia e approfondita formazione pratica sono necessari per l'interpretazione corretta immagine.
Nel seguente articolo, viene fornito un protocollo dettagliato per l'utilizzo di ultrasuoni ad alta risoluzione nel modello KPC. Inoltre, immagini ecografiche standard sono raffigurate ed etichettate con strutture dell'organo per facilitare l'orientamento per l'investigatore.
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Protocollo
Questo protocollo è in conformità degli orientamenti di cura degli animali all'Università medica centro Goettingen, Germania (33,9-42502-04-15/2056). Scrivi una recensione su tavole a seconda delle esigenze specifiche del singolo animale, alcuni dei passaggi del protocollo può essere modificato di conseguenza.
1. addominale palpazione dei topi KPC
- Per evitare inutili ecografie, palpare l'addome del mouse per identificare i topi che eventualmente potrebbero sopportare una lesione intra-addominale e successivamente devono essere sottoposti a ecografia addominale.
- Eseguire la palpazione addominale settimanale a partire da 8 settimane di età nel modello del topo KPC. Ultrasuono di alta risoluzione può anche applicarsi in modelli di tumore trapiantato (ad esempio, orthotopics) o altri geneticamente costruito del topo.
Nota: A seconda del tumore cinetica e studio obiettivo (studio di prevenzione, di intervento terapeutico Studio), rilevamento di tumori molto piccoli (1-2 mm) è fattibile all'inizio del tumore monitor prima di tumori possono essere palpati.
- Eseguire la palpazione addominale settimanale a partire da 8 settimane di età nel modello del topo KPC. Ultrasuono di alta risoluzione può anche applicarsi in modelli di tumore trapiantato (ad esempio, orthotopics) o altri geneticamente costruito del topo.
- Posizionare il mouse sulla griglia della gabbia e delicatamente sollevare il mouse dalla coda e palpare l'addome delicatamente andando su e giù con indice e pollice della mano non fissazione (Figura 1).
- Se il mouse tollera la palpazione morbida, procedere aumentando lentamente la pressione. Una più grande resistenza possa essere facilmente individuato nell'addome superiore e inferiore. A volte, feci dure possono essere erroneamente interpretate come un tumore massa.
2. preparazione dello spazio di lavoro
- Fornire spazio per almeno tre unità di lavoro differenti: area di pre-scansione, scansione gabbia fase e recupero. Materiale richiesto sono rappresentati in Figura 2.
- Pulire la piastra di lavoro principale (per esempio con 70% etanolo) e accendere la piattaforma di riscaldamento prima della scansione (Figura 3). Assicurarsi che la temperatura di 38-40 ° C viene raggiunta prima che il primo mouse viene trasferito.
- Accendere la macchina di ultrasuono e creare una nuova cartella per i dati acquisiti (Figura 4). L'impostazione di modalità B viene applicata per l'imaging addominale. Inoltre, affinché che il trasduttore addominale è collegato alla porta attiva della macchina. Fissare la testa di trasduttore nella parte superiore della fase di lavoro utilizzando il sistema di montaggio trasduttore.
- Preparare una gabbia di recupero su una piastra riscaldante o la stuoia termica (o lampada di riscaldamento uso) affinché termoregolazione post-procedurale e pronta guarigione dei topi digitalizzati. Mettere un sottile strato di tessuto come cuscino nella parte inferiore di questa gabbia per evitare l'aspirazione di biancheria da letto con il rischio di soffocamento (Figura 5).
3. inalazione anestesia
- Procedere mettendo un mouse nella camera di induzione. Aprire la valvola per il flusso di gas vettore (1 L/min di ossigeno o aria) e impostare la concentrazione di isoflurane al 4%, permettendo una lentamente crescente saturazione della camera ad induzione. Assicurarsi che isoflurano corretto lo scavenging (filtro passivo o attivo) è a posto. Dopo circa 2-4 min il mouse sarà solitamente sotto sedazione profonda.
- Mantenere la sedazione con la somministrazione di isoflurano 2% attraverso il cono di naso nella fase di lavoro.
- Trasferire con cautela l'animale dalla camera di induzione per la fase di lavoro. Controllare il cono di naso per un flusso di gas costante. Mettere il muso del mouse nel cono di naso la presa di linea di anestesia. La posizione normale per la scansione iniziale è posizione supina. Il mouse può essere posizionato anche su lato destro o sinistro per migliorare la visibilità della testa pancreatica o tumori di coda (Figura 6).
- Anche se l'ecografia addominale non è dolorosa per sé, è possibile eseguire il test di pizzico di piede come indicatore per un dolore gratuito condizione e stato di anestesia profonda. Se il mouse è ancora attivo o muoversi attivamente, ritrasferimento l'animale indietro nella camera di induzione per induzione ripetuta e prolungata.
- Utilizzare l'unguento protezione degli occhi per prevenire lesioni della cornea a causa della perdita di liquidi.
- Durante l'anestesia, utilizzare un sistema di monitoraggio. Tuttavia, la temperatura rettale ed ECG non viene utilizzato regolarmente per ecografia addominale. D'importanza, topi perdono la capacità di termoregolarsi sotto anestesia. Pertanto, osservare da vicino i segni clinici per ipotermia o afflizione respiratoria come ansimante o apnea. Se qualsiasi sintomo è ovvio fermata isoflurano e posto il mouse nella gabbia recupero immediatamente.
4. ecografia impostazioni
- Accendere il sistema a ultrasuoni come descritto da istruzioni del produttore. Assicurarsi che l'impostazione primaria è messo su imaging generale con il pacchetto addominale attivato. Solito B-modalità-imaging viene utilizzato per l'acquisizione di dati come standard.
- Ottenere una qualità di immagine ottimizzata con i seguenti parametri: frequenza di 40 MHz, 2D-guadagno 25-30 dB, immagine profondità 10 mm, larghezza 10 mm, 3 zone focali con centro tra 3-6 mm.
5. Mouse preparazione
- Fissare l'estremità superiore ed inferiore con nastro adesivo. Essere il più attento possibile evitare qualsiasi pregiudizio all'animale a causa della fissazione (Figura 7).
- Rimuovere tutte le pellicce addominale utilizzando elettronico domestico clippers. Dovuto la struttura della pelliccia, iniziare dalla parte inferiore dell'addome fino alla gabbia toracica. Prendersi cura a processus xiphoideus per evitare le lesioni della pelle in questa zona.
Nota: Mouse pelliccia riflette gli ultrasuoni e diminuisce la visibilità. - Utilizzare la crema depilatoria per eseguire una preparazione ottimizzata della pelle e la rimozione completa della pelliccia. Amministrare un sottile strato di crema sulla punta dell'addome rasato con punte in cotone (Figura 8). Rimuovere la crema (dopo 30 s o successivamente a seconda la crema utilizzata) con tessuti a secco seguiti da molta acqua per rimuovere completamente tutti i residui (Figura 9, Figura 10, Figura 11). Crema resti potrebbero causare irritazioni della pelle e della mucosa dopo l'ecografia e possono così influenzare la salute.
- Per garantire un'adeguata scansione condizioni applicano un sacco di gel per ultrasuoni sull'addome (Figura 12). Di solito, gel per ultrasuoni calda viene utilizzato al fine di ridurre al minimo l'ipotermia per il mouse.
- Applicare manualmente un sottile strato di gel per ultrasuoni sulla testa del trasduttore. Eseguire un test toccando sul lato trasduttore con la tacca. Alla schermata di un segnale sul lato superiore sinistro può essere visto se il trasduttore è posizionato correttamente.
6. addominale di ultrasuono
- Regolare il trasduttore sull'addome utilizzando una pressione decisa. Pesante compressione dell'addome del mouse può condurre a danno respiratorio o circolatorio e dovrebbe essere evitata.
- Scansione su e giù. Regolare il telaio della piattaforma di lavoro e le ruote per asse x e y.
- Come il primo passo per identificare entrambi i reni. Di solito appaiono come strutture omogenee iperecogeni nel basso addome. Il collegato renalis di essere facilmente reperibile che ulteriormente conduce alla vena cava inferiore (Figura 13).
- Utilizzare la vena lienalis serve come nave di pietra miliare per il pancreas. Tentativo di distinguere tra Renalis del vena e lienalis del vena. Al momento del rilevamento di vena lienalis pancreas può essere localizzato esattamente. Il pancreas normale è piuttosto una membrana si sono diffuse attraverso la cavità addominale rispetto a una struttura solida (Figura 14 e Figura 15).
7. pancreatiche del tumore rilevamento e la valutazione del Volume
- Identificare le lesioni pancreatiche da tutte le strutture circostanti. Essi generalmente appaiono come masse di hypoechoic disomogeneo tessuto rotonda o allungata (Figura 16). Il tumore è solitamente costante e difficilmente può essere compresso per la testa di scansione. Nota, di volta in volta che potrebbe essere difficile da distinguere chiaramente tra un tumore e un ciclo di piccole viscere. Prestare attenzione alla peristalsi dell'intestino che non devono essere osservata in tumori pancreatici.
- Sulla schermata di rilevazione del tumore su e giù per farsi un'idea delle dimensioni complessive e misurare il diametro più grande utilizzando la pinza di ultrasuono. Una volta trovata un'immagine adatta, congelamento della schermata e utilizzare lo strumento di misura per determinare con precisione le dimensioni del tumore. Nota, per un uso successivo che sarà importante differenziare se un tumore è localizzato nella coda, il corpo o la testa del pancreas.
- Prima di cambiare indietro per modalità live, assicurarsi di salvare immagini per registrare il lavoro. Notare che durante il congelamento dell'immagine che potrebbe accadere che la rotella di regolazione viene rilasciata, e la sonda ad ultrasuoni viene premuta ancora più all'addome del mouse. Di conseguenza, fissare la regolazione della compressione prima di cambiare la modalità di congelare.
- Dopo aver terminato la misurazione del primo aereo o ruotare la testa di scansione di 90° in posizione longitudinale (Figura 17), o girare il mouse al suo fianco, per rilevare la dilatazione longitudinale dei tumori. Alcuni tumori potrebbero essere necessario modificare la posizione del mouse per un'adeguata visibilità. Per i tumori della coda pancreatica, il mouse può essere collocato sul suo lato destro (Figura 10 e Figura 19), per i tumori pancreatici testa sul suo lato sinistro (Figura 11 e Figura 20).
8. quantificazione del Volume del tumore
Nota: Uno degli obiettivi principale di tutti gli sforzi è la corretta determinazione del volume del tumore. Anche se ci sono diverse tecniche disponibile un metodo di calcolo, tra cui la formula di un ellissoide è preferito all'University Medical Center Goettingen.
- Dotato di tutti i tre diametri ottenuti in precedenza, calcolare il volume approssimativo del tumore corrispondente (Figura 21).
- In alternativa, è possibile utilizzare un sistema motorio della testa di scansione per eseguire una scansione automatizzata della regione del tumore con il calcolo del volume successivo e 3-D-ricostruzione.
9. recupero
- Dopo la scansione, rimuovere con attenzione tutto il nastro adesivo e rimuovere con attenzione tutti i gel per ultrasuoni con il tessuto asciutto.
- Trasferire con cautela il mouse nella gabbia recupero ( Figura 21). Evitare qualsiasi tessuto di rivestimento sulla faccia di mouse´s che potrebbe causare danno respiratorio. Una posizione laterale per il recupero dovrebbe essere preferita.
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Risultati
L'imaging ad ultrasuoni è una tecnica versatile e non invasivo che viene utilizzata per risolvere diversi problemi in modelli murini di malattie umane. Rispetto a tutti gli altri vantaggi principali approcci imaging sono efficienza ad alta velocità, costo, tempo di acquisizione breve e l'imaging in tempo reale. Tuttavia, questo strumento ha bisogno di competenze per generare immagini accurate e di alta qualità. In particolare nel caso di artefatti indesiderati almeno qualche esperienza co...
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Discussione
Con questo protocollo, è fornita una descrizione dettagliata per quantificare i tumori pancreatici usando la formazione immagine di ultrasuono addominale ad alta definizione in modelli murini geneticamente. Recentemente, Sastra et al pubblicato una descrizione dettagliata di come quantificare i tumori pancreatici in modelli murini, ma non visualizzato in quel momento istruzioni circa la preparazione e manipolazione come prerequisito per gli ulteriori passi sono stati mostrati11. L'obietti...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da Deutsche ausgewiesenen (gruppo di Eder Max per AN: 110972), una borsa di tesi di dottorato di DGVS (di SMB) e una borsa di Studio Fondazione Fresenius-Else-Kröner (a RGG) all'University Medical Center Goettingen. Ringraziamo Jutta Blumberg e Ulrike Wegner per assistenza tecnica. Ringraziamo anche tutti i tecnici degli animali presso l'impianto di animale dell'University Medical Center Goettingen per mouse mantenendo. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le normative tedesche sul benessere degli animali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema a ultrasuoni ad alta risoluzione Visual Sonics Vevo2100, incluso tavolino di imaging e linea di anestesia | FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada | VS-11945 | |
| Trasduttore MicroScan Vevo 2100 MS-550-D (22-55 MHz) | FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada | VS-11874 | |
| Sistema di anestesia Vevo (camera di induzione per anestesia con ingresso di gas freschi e di scarico) | FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada | SA-12055 | |
| Vevo Imaging Station (tavolino di lavoro con cono nasale per l'alimentazione dell'anestesia) | FUJIFILM VisualSonics Inc, Canada | SA-11982 | |
| tosatrici elettroniche per animali domestici | Panasonic Marketing Europe, Germany | 5025232484324 | Panasonic ER-PA10-s |
| Labotect Piastra riscaldante | Labor tech Gö ttingen, Germania | 13854 | |
| crema per gli occhi (unguento oftalmico) | Schü lke& Mayr, Germania | 9080249 | |
| isoflurano veterinario | Abbvie, Germania | 4831867 | |
| crema depilatoria | RB healthcare UK, Regno Unito | 8218535 | |
| etanolo al 70% (v/v) in acqua distillata | TH. Geyer, Germania | 22941000 | |
| gel per ultrasuoni | Asmuth, Germania | 13477 | |
| salviette per tessuti | Kimberly-Clark Germania, Germania | 7558 | |
| punte di cotone | Meditrade, Germania | 75481116 | |
| ciotola di vetro per gel per ultrasuoni | ARC Francia, Francia | H1149 | |
| ciotola dell'acqua | W & P Trading Co., USA | B00K2P6PLQ | |
| spugne di garza | Fuhrmann, Germania | 960504 |
Riferimenti
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