In questo protocollo, baculovirus è prodotta dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide nelle cellule Sf9 e amplificato in una coltura di sospensione serum-free. Il supernatante è purificato mediante cromatografia di affinità di eparina e ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Questo protocollo è utile per la produzione e purificazione di baculovirus per applicazione di terapia genica.
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Articolo metodologico
Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Baculovirus è stato tradizionalmente utilizzato per la produzione di proteine ricombinanti e vaccino. Tuttavia, più recentemente, baculovirus sta emergendo come un vettore promettente per applicazioni di terapia genica. Qui, baculovirus è prodotto dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide DNA (bacmid) in una coltura aderente delle cellule Sf9. Baculovirus è successivamente ampliato in Sf9 cellule in una coltura di sospensione serum-free fino ad ottenuta il volume desiderato. Viene quindi purificata dal surnatante mediante cromatografia di affinità di eparina della cultura. Surnatante virus viene caricato sulla colonna di eparina che lega le particelle baculovirus nel surnatante a causa dell'affinità di eparina per baculovirus avvolgono glicoproteina. La colonna viene lavata con un tampone per rimuovere i contaminanti e baculovirus è eluiti dalla colonna con un buffer del alto-sale. L'eluato viene diluito ad una concentrazione salina isotonica e particelle di baculovirus sono ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Utilizzando questo metodo, baculovirus può essere concentrato fino a 500-fold con un 25% di recupero di particelle infettive. Sebbene il protocollo descritto qui di seguito viene illustrato la produzione e purificazione del baculovirus da culture fino a 1 L, il metodo possa essere scalati fino in una cultura di sospensione sistema chiuso per la produzione di un vettore di uso clinico per applicazione di terapia genica.
Introduzione
Baculovirus è utilizzata principalmente per la produzione di proteine ricombinanti e vaccini in lepidottero Spodoptera fugiperda (Sf) 9 cellule di insetto utilizzando ricombinante virus di virus della poliedrosi nucleare di Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. più di recente, sta emergendo come un vettore promettente per la terapia genica applicazione5. Esso è noto per avere un ampio tropismo host e tessuto, infetta le cellule proliferanti sia quiescente, è non patogeni e non integrare l'ho....
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Protocollo
Vedere la Figura 1 per un'illustrazione che riassume il protocollo.
1. purificazione di DNA plasmidico di Baculovirus
- Crescere la coltura batterica che contiene baculovirus plasmide DNA (bacmid)14 in 200 mL di brodo LB con antibiotici; kanamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), per 16 h a 37 ° C su un'impostazione di agitatore orbitale a 300 giri/min.
- Purificare il DNA bacmid dalla coltura batterica mediante Lisi alcalina standard protocollo15e sciogliere il bacmid nel buffer di TE.
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Risultati
Il protocollo presentato è in un diagramma di flusso (Figura 1). Passaggi includono la trasfezione transiente di cellule Sf9 con bacmid DNA per produrre baculovirus in cultura aderente in un piatto, l'amplificazione successiva nella coltura di sospensione serum-free, trattamento di nucleasi e chiarificazione mediante centrifugazione e filtrazione, e la purificazione mediante cromatografia di affinità di eparina seguita da concentrazione con ultracentrifugazio.......
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Discussione
Il protocollo presentato qui descrive la produzione di baculovirus in Sf9 cellule in coltura in sospensione e purificazione di baculovirus utilizzando una cromatografia di affinità di eparina. I parametri utilizzati in questo protocollo massimizzare il rendimento e ridurre al minimo l'inattivazione di baculovirus infettivi. Il protocollo fornito qui indica che un recupero significativamente migliorato di baculovirus particelle rispetto ai recuperi realizzato da altri9.
.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto in parte attraverso il finanziamento di Start-up da di Cincinnati Children ' s Research Foundation (CCRF) a M.N. e innovativo Core Grant (ICG) supportato dal centro nazionale per le scienze traslazionale avanzando dei National Institutes of Health, sotto Premio numero UL1 TR001425. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | sistema cromatografico |
| POROS Heparin 50 &; m Colonna | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Colonna di eparina |
| Ultracentrifuga | Beckman-Coulter | Articolo non di catalogo | Concentra il virus in |
| poliallomero ad alta velocità Provetta per ultracentrifuga | Beckman-Coulter | 326823 | Concentra il virus ad alta velocità |
| MaxQ 8000 incubatore con agitatore orbitale... | ThermoFisher Scientific | Agitatore per coltura in sospensione | |
| 250 mL | ThermoFisher Scientific | 238071 | per coltura in sospensione |
| Palloni di Erlenmeyer da 1 L | ThermoFisher Scientific | Pallone da 238072 per coltura in sospensione | |
| Microscopio (Olympus CKX41) | Olympus | Articolo non catalogo | Monitoraggio e conteggio cellulare |
| Centrifuga da tavolo | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Per la chiarificazione del surnatante del Baculovirus |
| Tubo conico da 50 ml | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | Per la raccolta del surnatante del Baculovirus |
| Piastra a 6 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Piastra trattata per coltura tissutale |
| Piastra da 10 cm | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Piastra trattata per coltura tissutale |
| Stericup-HV, 0,45 µ m, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Unità di filtrazione |
| Kanamicina | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetraciclina | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamicina | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Kit vettoriale da bac a bac | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Sistema di espressione del baculovirus |
| DH10B-T1R Cella competente | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Cella competente per |
| tampone bacmid TE | Inhouse | Articolo non di catalogo | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Kit Plasmidi Maxiprep | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | Per purificazione bacmide |
| Cellule Sf9 ThermoFisher | Scientific | 11496-015 | Cellule di insetto |
| Grace' s Terreno di coltura cellulare per insetti | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Terreno di trasfezione |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Lavaggio di cellule, diluendo campioni |
| HyClone SFX-Terreno cellulare per insetti | GE Healthcare | SH30278.02 | Terreno di crescita di cellule di insetti senza siero |
| Benzonasi Nucleasi | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzima per degradare DNA e RNA |
| Plasmide di baculovirus (bacmid) DNA | In-house | Articolo non di catalogo | Bacmid per la produzione di baculovirus |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Reagente di trasfezione per cellule di insetti |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizza il Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | Per la conservazione della linea cellulare Baculovirus |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Linea cellulare di fibroblasti |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Crescita terreni per linee cellulari |
| Tampone di lavaggio | Articolo non di catalogo | 20 mmol/l di fosfato contenente 150 mmol/l di cloruro di sodio | |
| Tampone di eluizione | Articolo non di catalogo | 20 mmol/l di fosfato contenente 1,5 mol/l di cloruro di sodio | |
| Tampone di pulizia della colonna | Articolo non di catalogo | 20 mmol/l di tampone fosfato contenente 2,0 mol/l di cloruro | |
| di sodioAcqua sterile | In-house | Articolo non di catalogo | Per la pulizia Akta Avant |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 1.09137 | Per la pulizia Akta Avant |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7073 | Per la pulizia Akta Avant |
Riferimenti
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein....
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Ristampe e permessi
