Articolo metodologico

Produzione e purificazione di Baculovirus per applicazione di terapia genica

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DOI:

10.3791/57019

⸱

9 aprile 2018

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

In questo articolo

Sommario

In questo protocollo, baculovirus è prodotta dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide nelle cellule Sf9 e amplificato in una coltura di sospensione serum-free. Il supernatante è purificato mediante cromatografia di affinità di eparina e ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Questo protocollo è utile per la produzione e purificazione di baculovirus per applicazione di terapia genica.

Abstract

Baculovirus è stato tradizionalmente utilizzato per la produzione di proteine ricombinanti e vaccino. Tuttavia, più recentemente, baculovirus sta emergendo come un vettore promettente per applicazioni di terapia genica. Qui, baculovirus è prodotto dalla trasfezione transiente del baculovirus plasmide DNA (bacmid) in una coltura aderente delle cellule Sf9. Baculovirus è successivamente ampliato in Sf9 cellule in una coltura di sospensione serum-free fino ad ottenuta il volume desiderato. Viene quindi purificata dal surnatante mediante cromatografia di affinità di eparina della cultura. Surnatante virus viene caricato sulla colonna di eparina che lega le particelle baculovirus nel surnatante a causa dell'affinità di eparina per baculovirus avvolgono glicoproteina. La colonna viene lavata con un tampone per rimuovere i contaminanti e baculovirus è eluiti dalla colonna con un buffer del alto-sale. L'eluato viene diluito ad una concentrazione salina isotonica e particelle di baculovirus sono ulteriormente concentrato mediante ultracentrifugazione. Utilizzando questo metodo, baculovirus può essere concentrato fino a 500-fold con un 25% di recupero di particelle infettive. Sebbene il protocollo descritto qui di seguito viene illustrato la produzione e purificazione del baculovirus da culture fino a 1 L, il metodo possa essere scalati fino in una cultura di sospensione sistema chiuso per la produzione di un vettore di uso clinico per applicazione di terapia genica.

Introduzione

Baculovirus è utilizzata principalmente per la produzione di proteine ricombinanti e vaccini in lepidottero Spodoptera fugiperda (Sf) 9 cellule di insetto utilizzando ricombinante virus di virus della poliedrosi nucleare di Autographa californica (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. più di recente, sta emergendo come un vettore promettente per la terapia genica applicazione5. Esso è noto per avere un ampio tropismo host e tessuto, infetta le cellule proliferanti sia quiescente, è non patogeni e non integrare l'host del cromosoma4,5,6. Inoltre, baculovirus può essere prodotto nella coltura di sospensione serum-free che è scalabile e consente per sistema chiuso di elaborazione per la futura produzione clinica1.

La purezza del baculovirus particelle è importante per il raggiungimento di trasduzione efficace riducendo al minimo la citotossicità7,8,9. Baculovirus possono essere concentrati di ultracentrifugazione o filtrazione a flusso tangenziale (TFF) con impatto limitato sulla sua infettività. Tuttavia, queste procedure non solo concentrano le particelle del virus ma anche detriti cellulari e proteine da Sf9 cultura, che può essere tossico in vitro (osservazione personale) e possono indurre l'infiammazione o una risposta immunitaria quando utilizzato in vivo. Per evitare questo, soprattutto quando utilizzando altamente concentrato scorte di virus, baculovirus infettivi deve essere purificato e separati da particelle contaminanti.

Diversi metodi sono stati segnalati per la purificazione e la concentrazione di baculovirus vettori10,11,12. Degli approcci disponibili, cromatografia di affinità di eparina consente un elevato livello di singolo-passaggio di purificazione con la bassa concentrazione di contaminanti proteine12. Il metodo si basa sull'identificazione del solfato di heparan come il recettore per baculovirus13,14. Dopo il caricamento Sf9 surnatante di cella nella colonna e associazione di baculovirus, la colonna può essere lavata con fisiologica (isotonica) buffer per rimuovere particelle contaminanti vagamente associate o non associate. Poiché l'associazione di eparina è rovesciabile, baculovirus particelle possono essere eluite con un tampone salino elevato, che è immediatamente diluito alla concentrazione fisiologica di sale (isotonica) per evitare che l'inattivazione di shock osmotico12. Inoltre, la produzione di baculovirus, nonché acquisizione su e l'eluizione dalla colonna cromatografia, può essere eseguita utilizzando un processo di sistema chiuso che è compatibile con le attuali pratiche di buona fabbricazione (cGMP).

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la fabbricazione, la purificazione e la concentrazione di baculovirus infettivi mediante centrifugazione e cromatografia di affinità. Brevemente, produciamo baculovirus mediante trasfezione di cellule Sf9 con un DNA plasmidico baculovirus nella cultura aderente e ampliare ulteriormente il baculovirus infettivi nella coltura di sospensione serum-free. Dobbiamo purificare baculovirus mediante cromatografia di affinità di eparina e usare ultracentrifugazione come il passaggio finale per altamente concentrato il vettore per applicazione di terapia genica.

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Protocollo

Vedere la Figura 1 per un'illustrazione che riassume il protocollo.

1. purificazione di DNA plasmidico di Baculovirus

  1. Crescere la coltura batterica che contiene baculovirus plasmide DNA (bacmid)14 in 200 mL di brodo LB con antibiotici; kanamicina (50 µ g/mL), tetraciclina (10 µ g/mL) e gentamicina (7 µ g/mL), per 16 h a 37 ° C su un'impostazione di agitatore orbitale a 300 giri/min.
  2. Purificare il DNA bacmid dalla coltura batterica mediante Lisi alcalina standard protocollo15e sciogliere il bacmid nel buffer di TE.

2. produzione di Baculovirus

  1. Cellule di cultura Sf9 in un incubatore agitatore orbitale a 135 giri/min e 28 ° C in un matraccio di Erlenmeyer contenente terreno di coltura privo di siero insetto1,2,3di policarbonato.
    Nota: Se le cellule Sf9 sono scongelate da azione congelate, consentire almeno due settimane per le cellule di recuperare e immettere la fase esponenziale di crescita.
  2. Contare le celle Sf9 raccolte alla fase esponenziale di crescita con un emocitometro dopo colorazione con Trypan blue. Semi di 1 x 106 cellule Sf9 vitali per pozzetto di una piastra di coltura del tessuto-trattati di 6 pozzetti in 2 mL di terreno. Consentire la cella di allegare per 1 h a 28 ° C in un incubatore.
  3. Sostituire il mezzo di crescita con 1 mL di mezzo di coltura di privo di siero senza aggiunte Grace insetto.
  4. Transfect il bacmid del DNA nelle cellule Sf9 utilizzando il reagente di transfezione delle cellule di insetto.
    1. Mix 8 µ l di reagente transfezione delle cellule di insetto con 100 µ l di medium di insetto di grazia.
    2. Diluire 2 µ g di DNA di bacmid in 100 µ l di terreno di insetto senza aggiunte e mescolare delicatamente nel Vortex.
    3. Combinare il DNA diluito con il reagente di transfezione delle cellule di insetto diluito e mescolare delicatamente. Incubare per 15-30 min a temperatura ambiente.
    4. Aggiungere la miscela di DNA-lipidico goccia a goccia sulle celle. Incubare a 28 ° C in un incubatore per circa 5 h.
  5. Rimuovere la miscela di transfezione dalle cellule e lavare le cellule con 2 mL di PBS.
  6. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura dell'insetto e continuare a cultura a 28 ° C in un incubatore senza modificare i media.
    Nota: Se il bacmid contiene una proteina fluorescente, sua espressione può essere rilevato in cellule 48h post-di transfezione. Baculovirus è prodotto da cellule trasfettate Sf9 e secreta nel terreno di coltura che successivamente infetta le cellule untransfected. La popolazione intera cella si infetta con baculovirus in 5 giorni e mostra segni di infezione virale, chiamato anche effetto citopatico. Questi includono il diametro aumentato delle cellule, granuli di vacuoli nel citoplasma, cessazione della crescita delle cellule e cellule morte o lisate sono presenti nella coltura delle cellule. Tuttavia, se l'efficienza di trasfezione o infezione non è ottima, la cultura non produca un effetto citopatico ovvio. L'effetto citopatico può essere visualizzato con un microscopio invertito di fase a 200-400 ingrandimenti. Cellulare baculovirus infettata può essere rilevato mediante colorazione con anticorpo di anti-gp6411.
  7. Vendemmia baculovirus surnatante 5 giorni dopo trasfezione ed etichetta come lo stock di virus1 P.
  8. Conservare il surnatante, baculovirus che è sensibile alla luce, al buio con 0,5% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Conservare a 4 ° C per a breve termine (fino a 90 giorni) o a-80 ° C per il lungo termine.
  9. 6 × 106 Sf9 celle in una piastra di coltura del tessuto-trattati di 10 cm in 10 mL di terreno di coltura dell'insetto del seme. Aggiungere 1 mL di surnatante di baculovirus iniziale (P1) per le cellule.
  10. Raccogliere il surnatante baculovirus (P2) alle 5th giorno dopo l'infezione.
  11. Seme 50ml di Sf9 cellule (3 x 106 cellule/mL) nella coltura di sospensione nel terreno di coltura dell'insetto in un policarbonato 250 mL flacone erlenmeyer e posto il matraccio in un incubatore agitatore orbitale. Aggiungere 2 mL di brodo2 P per le cellule e agitare a 135 giri/min, mantenendo una temperatura costante di 28 ° C.
    Nota: Tre o quattro giorni dopo l'infezione, l'intera popolazione cellulare Sf9 mostrerà l'effetto citopatico, che è un'indicazione di produzione di alto-titolo baculovirus.
  12. In sequenza amplificare i surnatanti di baculovirus fino ad ottenere il volume desiderato (P3,4,...) aumentando 10 a 50 volte volume della coltura delle cellule in ogni successiva infezione.
    Nota: P3 è 3rd tondo dell'infezione in cui 500 mL in 1 L di Sf9 coltura cellulare può essere infettato con 10-20 mL di P2 baculovirus surnatante; P4 è il 4th rotondo dell'infezione in cui 5 a 10 L di Sf9 coltura cellulare può essere infettato con 100-200 mL di surnatante di baculovirus3 P e così via. In genere, Sf9 cellule sono seminate a 3 × 106 cellule/mL in terreni di coltura privo di siero dell'insetto.
  13. Centrifugare il baculovirus surnatante a 1.000 x g per 30 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari e trattare il baculovirus surnatante con nucleasi 50 unità/mL (250 unità / µ l di brodo) per 2 h a 37 ° C per digerire il RNA e del DNA genomico. Filtrare i surnatanti attraverso un'unità di filtrazione di 0,45 μm.

3. preparazione del sistema di cromatografia

  1. Preparare il sistema di cromatografia risciacquando in sequenza linee campione e buffer ogni con acqua sterile, 1 N di idrossido di sodio, acqua e lavare il buffer (20 mM sodio fosfato tampone contenente cloruro di sodio 150 mM, pH 7,0) ad un flusso lineare di 50 mL/min.
  2. Preparare una colonna di eparina 50 µm (10 × 10 cm, 7,9 mL di volume di colonna (CV)) eseguendo in sequenza colonna pulizia tampone (5 CV sterile 20 mM sodio fosfato tampone contenente cloruro di sodio 2 M, pH 7.0) e tampone di lavaggio 5 CV ad un flusso lineare di 7 mL/min.

4. purificazione di Baculovirus vettoriale

  1. Impostare il sistema di cromatografia come segue:
    1. Utilizzare il porta di ingresso per il caricamento del baculovirus surnatante di carico del campione.
    2. Utilizzare la porta di ingresso di buffer A1 per il caricamento del tampone di lavaggio. Preparare un biberon con almeno 500 mL di tampone di lavaggio e posizionare la linea di tampone di lavaggio nella bottiglia.
    3. Utilizzare la porta di ingresso A2 di buffer per il caricamento del buffer di eluizione (fosfato di sodio di 20 mM con 1,5 M cloruro di sodio, pH 8.0). Preparare un biberon con almeno 500 mL di tampone di eluizione e posizionare la linea di buffer di eluizione nella bottiglia.
    4. Inserire il collettore di frazione per raccogliere la colonna pass-through baculovirus surnatante, il tampone di lavaggio e il baculovirus eluiti diverse provette coniche da 50 mL.
  2. Equilibrare la colonna di eparina con volumi di colonna (CVs) di cinque 7,9 mL di tampone di lavaggio (40 mL) ad un flusso lineare di 7,0 mL/min.
  3. Caricare 250 mL di surnatante sulla colonna di eparina utilizzando la pompa di campionamento (pozzetto campione di ingresso) del sistema di cromatografia ad un flusso lineare di 2,0 mL/min di baculovirus.
  4. Eseguire 10 CVs (80 mL) di tampone di lavaggio attraverso la colonna di eparina ad un flusso lineare di 2,0 mL/min fino a quando la curva di assorbanza (UV) ultravioletta (280 nm) è ritornato ai valori basali e diventa stabile.
  5. Eluire le particelle di baculovirus dalla colonna di eparina 7,9 mL con 5 CVs (40 mL) di tampone di eluizione ad un flusso lineare di 4,0 mL/min orologio per un picco di eluizione taglienti della proteina sul cromatogramma, quando le particelle di baculovirus dissociano dalla colonna di eparina.
  6. Post-eluizione, diluire immediatamente il supernatante di baculovirus eluiti 10 volte utilizzando 20 mM di tampone fosfato di sodio in acqua per evitare che l'inattivazione di baculovirus particelle da shock osmotico durante la successiva centrifugazione.
  7. Archivio 100 µ l di ciascuna delle frazioni, tra cui il flusso-attraverso la colonna raccolti durante il caricamento del surnatante baculovirus, il tampone di lavaggio e l'eluato. Infettare queste frazioni di baculovirus per HT1080 per valutare il processo di purificazione (Vedi sezione 6).
  8. Pulire la colonna con colonna buffer e tampone di lavaggio di pulizia. Infine, lavare la colonna con 5 CV sterile 20% di etanolo in acqua ad un flusso lineare di 7,0 mL/min e conservare a 4 ° C.
  9. Pulire il sistema di cromatografia con acqua, idrossido di sodio 1 N nuovo con acqua e 20% di etanolo in acqua ad un flusso lineare di 50,0 mL/min e conservare il sistema in etanolo al 20%.

5. concentrazione di Baculovirus

  1. Pre-sterilizzare provette da centrifuga utilizzando un'autoclave. Aggiungere un volume uguale di baculovirus surnatante ogni ultracentrifuga provette in una cappa di coltura del tessuto. Misurare il peso del tubo da un equilibrio e regolare il peso del contenuto dei tubi ultracentrifuga con PBS sterile.
  2. Posizionare ciascuna delle provette ultracentrifuga opponendosi a benna del rotore SW 32 Ti.
  3. Eseguire l'ultracentrifuga a 80.000 × g per 90 min a 4 ° C.
  4. Aprire le provette ultracentrifuga in una cappa di coltura del tessuto e asetticamente aspirare il liquido senza rimuovere il pellet di baculovirus.
  5. Risospendere il pellet di ogni tubo pipettando energicamente su e giù con 200 µ l di PBS contenente 0.5% (w/vol) BSA.
  6. Trasferire i baculovirus concentrato per cryovials (50 a 100 µ l per flaconcino) e conservare a-80 ° C.

6. titolazione di Baculovirus

  1. Il giorno prima dell'infezione, conta cellule HT1080 utilizzando un emocitometro dopo la macchiatura delle celle con Trypan blu. Semi di 1 x 105 HT1080 cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Seme diversi pozzi aggiuntive per essere in grado di determinare l'esatto numero di cellule presenti al momento dell'infezione. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: Cellule HT1080 vengono utilizzate per la titolazione come essi esprimono un livello superiore di eparan solfato rispetto ad altri la cella linee16. Poiché le cellule HT1080 sono aderenti, la titolazione è più semplice e richiede meno tempo rispetto all'utilizzo la titolazione Sf9-base tradizionale.
  2. Il giorno di infezione, è necessario determinare il numero di cellule per pozzetto contando le cellule da pozzi. Infettare le cellule aggiungendo il baculovirus diluito originale che era stato messo da parte prima di purificazione di colonna e con i campioni dal flusso-attraverso la colonna, lavare e frazioni di eluizione. Per ogni campione, determinare la diluizione e il volume empiricamente basato su particelle infettive baculovirus e infettare ogni pozzetto in triplice copia.
  3. Due giorni dopo l'infezione, analizzare le cellule per l'espressione del gene di interesse. Le cellule possono essere analizzate utilizzando un citometro a flusso, se esprimono una proteina fluorescente (per esempio GFP)17.
  4. Calcolare i titoli (infettive unità / mL) basati sul numero di cellule presenti al momento dell'infezione, il fattore di diluizione e percentuali di proteina fluorescente nelle celle utilizzando la formula: (numero di cellule durante infezione × percentuale di proteina fluorescente fattore di diluizione di cellule positive ×) / volume di baculovirus in mL.
    Nota: Ad esempio, se il numero totale di cellule per pozzetto al momento dell'infezione è 1,2 × 105, la percentuale di proteina fluorescente è 5%, il fattore di diluizione è 100 e il volume di baculovirus diluito aggiunto è di 10 µ l, il titolo è 6 × 107 unità infettive (IU) / ml.

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Risultati

Il protocollo presentato è in un diagramma di flusso (Figura 1). Passaggi includono la trasfezione transiente di cellule Sf9 con bacmid DNA per produrre baculovirus in cultura aderente in un piatto, l'amplificazione successiva nella coltura di sospensione serum-free, trattamento di nucleasi e chiarificazione mediante centrifugazione e filtrazione, e la purificazione mediante cromatografia di affinità di eparina seguita da concentrazione con ultracentrifugazio...

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Discussione

Il protocollo presentato qui descrive la produzione di baculovirus in Sf9 cellule in coltura in sospensione e purificazione di baculovirus utilizzando una cromatografia di affinità di eparina. I parametri utilizzati in questo protocollo massimizzare il rendimento e ridurre al minimo l'inattivazione di baculovirus infettivi. Il protocollo fornito qui indica che un recupero significativamente migliorato di baculovirus particelle rispetto ai recuperi realizzato da altri9.

...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è sostenuto in parte attraverso il finanziamento di Start-up da di Cincinnati Children ' s Research Foundation (CCRF) a M.N. e innovativo Core Grant (ICG) supportato dal centro nazionale per le scienze traslazionale avanzando dei National Institutes of Health, sotto Premio numero UL1 TR001425. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Akta Avant 150GE Healthcare28976337sistema cromatografico
POROS Heparin 50 &; m ColonnaThermoFisher Scientific4333414Colonna di eparina
UltracentrifugaBeckman-CoulterArticolo non di catalogoConcentra il virus in
poliallomero ad alta velocità Provetta per ultracentrifugaBeckman-Coulter326823Concentra il virus ad alta velocità
MaxQ 8000 incubatore con agitatore orbitale...ThermoFisher ScientificAgitatore per coltura in sospensione
250 mLThermoFisher Scientific238071per coltura in sospensione
Palloni di Erlenmeyer da 1 LThermoFisher ScientificPallone da 238072 per coltura in sospensione
Microscopio (Olympus CKX41)OlympusArticolo non catalogoMonitoraggio e conteggio cellulare 
Centrifuga da tavoloThermoFisher Scientific75253839/433607Per la chiarificazione del surnatante del Baculovirus
Tubo conico da 50 mlThermoFisher Scientific14-959-49APer la raccolta del surnatante del Baculovirus
Piastra a 6 pozzettiThermoFisher Scientific07-200-80Piastra trattata per coltura tissutale
Piastra da 10 cmThermoFisher Scientific08-772EPiastra trattata per coltura tissutale
Stericup-HV, 0,45  µ m, PVDFEMD-MilliporeSCHVU05REUnità di filtrazione
KanamicinaThermoFisher Scientific15160-054
TetraciclinaSigma-AldrichT7660
GentamicinaThermoFisher Scientific15750-060
Kit vettoriale da bac a bacThermoFisher Scientific10360-014Sistema di espressione del baculovirus
DH10B-T1R  Cella competenteThermoFisher Scientific12331-013Cella competente per
tampone bacmid TEInhouseArticolo non di catalogo10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Kit Plasmidi MaxiprepThermoFisher ScientificK2100-06Per purificazione bacmide
Cellule Sf9 ThermoFisherScientific11496-015Cellule di insetto
Grace' s Terreno di coltura cellulare per insettiThermoFisher Scientific11605-094Terreno di trasfezione
PBSThermoFisher Scientific20012227Lavaggio di cellule, diluendo campioni
HyClone SFX-Terreno cellulare per insettiGE HealthcareSH30278.02Terreno di crescita di cellule di insetti senza siero
Benzonasi NucleasiSigma-AldrichE1014Enzima per degradare DNA e RNA
Plasmide di baculovirus (bacmid) DNAIn-houseArticolo non di catalogoBacmid per la produzione di baculovirus
Cellfectin II ThermoFisher Scientific10362Reagente di trasfezione per cellule di insetti
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA4737Stabilizza il Baculovirus
CryovialThomas Scientific1222C24Per la conservazione della linea cellulare Baculovirus
HT1080ATCCCCL-121Linea cellulare di fibroblasti
DMEMSigma-AldrichD6429Crescita terreni per linee cellulari
Tampone di lavaggioArticolo non di catalogo20 mmol/l di fosfato contenente 150 mmol/l di cloruro di sodio
Tampone di eluizioneArticolo non di catalogo20 mmol/l di fosfato contenente 1,5 mol/l di cloruro di sodio
Tampone di pulizia della colonnaArticolo non di catalogo20 mmol/l di tampone fosfato contenente 2,0 mol/l di cloruro
di sodioAcqua sterileIn-houseArticolo non di catalogoPer la pulizia Akta Avant
Idrossido di sodioSigma-Aldrich1.09137Per la pulizia Akta Avant
EtanoloSigma-AldrichE7073Per la pulizia Akta Avant
Palloni di Erlenmeyer

Riferimenti

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