Il protocollo descrive un’analisi semplice per identificare le larve di Drosophila melanogaster che stanno vivendo ipossia sotto i livelli normali di ossigeno atmosferico. Questo protocollo permette hypoxic larve deve essere distinto da altri mutanti che mostrano fenotipi sovrapposti ad esempio lentezza o crescita lenta.
Privazione dell’ossigeno negli animali può derivare dall’esposizione a livelli bassi di ossigeno atmosferico o da danni ai tessuti interni che interferisce con la distribuzione di ossigeno. È anche possibile che il comportamento aberrante dei neuroni di rilevamento dell’ossigeno potrebbe indurre ipossia-come comportamento in presenza di livelli normali di ossigeno. In d. melanogaster, sviluppo a bassi livelli di ossigeno provoca l’inibizione della crescita e pigro comportamento durante le fasi larvali. Tuttavia, queste manifestazioni consolidate del deficit di ossigeno si sovrappongono notevolmente con i fenotipi di molte mutazioni che regolano la crescita, le risposte di sforzo o locomozione. Come risultato, non c’è attualmente nessun test disponibili per identificare i) cellulare ipossia indotta da una mutazione o ii) ipossia-come comportamento quando indotta dal comportamento di un neurone anormale.
Recentemente abbiamo identificato due comportamenti distintivi nelle larve di d. melanogaster che si verificano a livelli di ossigeno normale in risposta alla rilevazione interna di ipossia. In primo luogo, in tutte le fasi, tali larve evitare scavando cunicoli cibo, spesso randagi lontano dalla fonte di cibo. In secondo luogo, tunneling in un substrato morbido, che si verifica normalmente durante la terza tappa di instar errante è completamente abolita se le larve sono ipossiche. Il test qui descritto è stato progettato per rilevare e quantificare questi comportamenti e quindi per fornire un modo per rilevare ipossia indotta da danno interno piuttosto che esterno basso ossigeno. Piastre di dosaggio con un substrato di agar e una spina centrale della pasta di lievito sono utilizzate per sostenere gli animali attraverso la vita larvale. La posizione e lo stato delle larve vengono rilevate ogni giorno appena si procede dalla prima alla terza instar. Nella misura di tunneling in substrato agar durante fase errante è quantificata dopo impupamento usando ImageJ NIH. Il dosaggio sarà di valore per determinare quando l’ipossia è un componente di un fenotipo mutante e così fornire informazioni su possibili siti di azione del gene in questione.
La sofisticata gamma di strumenti genetici molecolari disponibili in d. melanogaster ne fanno un organismo prezioso per lo studio dei processi biologici evolutivamente conservati. Chiave risposte molecolari alla disponibilità di ossigeno hanno dimostrato di essere conservati attraverso l’evoluzione e studi precedenti in d. melanogaster hanno generato intuizioni i componenti universali di queste vie 1,2, di segnalazione 3,4,5,6.
Nell’ambito di uno studio volto a dissezione funzione del neurone sensoriale nelle larve di d. melanogaster , abbiamo identificato due risposte comportamentali che ha dimostrato di essere attivato da ipossia del tessuto normale dell’ossigeno livelli 7. Uno di questi, il mancato scavano nel cibo, è altamente relativo alla risposta a bassi livelli di ossigeno segnalato da Wingrove e o ‘ Farrell 8. Il secondo comportamento, guasto al tunnel in un substrato morbido durante il tardo terzo instar vagando fase, non era stati precedentemente identificato come relazione con l’ipossia. Abbiamo determinato che esponendo larve errante di tipo selvaggio a bassi livelli di ossigeno inoltre inibisce il substrato tunneling 7, stabilendo così che entrambi questi comportamenti hanno origine da ipossia – sia indotta da danno di tessuto o di livelli di assunzione di ossigeno basso. Qui descriviamo un’analisi che abbiamo sviluppato per quantificare questi due comportamenti indotti da ipossia, che inizia con osservazioni immediatamente dopo la schiusa larvale.
Risposte ipossiche nelle prime fasi larvali non sono state esaminate in precedenza e quindi eseguire un’analisi per tutta la vita larvale è una componente importante della nostra analisi. La maggior parte delle manifestazioni evidenti di ipossia – lento sviluppo, scarsa crescita e lentezza dell’apparato locomotore – si sovrappongono con i fenotipi larvali prodotti da molte mutazioni. Ma abbiamo trovato che solo terzo instar larve con ipossia mostrano un completo fallimento per 7un tunnel. Così, abbiamo determinato che larve anche più compromessi in termini di crescita e locomozione rispetto nostro larve hypoxic, ancora effettuato alcuni tunneling, considerando che larve ipossiche con tunnel mai 7. Un altro prezioso elemento di questo test è così che fornisce un modo per stabilire quando l’ipossia è la fonte di un particolare insieme di fenotipi pleiotropici, al contrario di alcuni altri stress o disfunzione metabolica. Come una dimostrazione del dosaggio, qui descriviamo il suo uso nel caratterizzare le risposte delle larve con ridotta espressione tracheale di uninflatable, un gene che funziona nel larvale airways 9.
Prevediamo che questo test sarà di valore per i ricercatori impegnati nella caratterizzazione dei fenotipi larvali che includono scarsa crescita e comportamento pigro. Di conseguenza, nuovi geni che influenzano la distribuzione, l’utilizzo o risposte, potrebbe essere identificato ossigeno in tutto il corpo. Inoltre, incorporare questo test un mutante protocollo di screening fornirebbe un percorso diretto ad identificare le mutazioni che producono ipossia. Questo test sarà anche prezioso nell’analizzare i circuiti che suscita i comportamenti innati indotta da ipossia descritti qui. Analisi di rete neurale di questo tipo sono un fuoco di molta ricerca corrente e il sistema nervoso semplice della larva d. melanogaster è un sistema prezioso per la dissezione fuori comportamenti automatizzati. Neuroni sensoriali coinvolte nella percezione del larvale ossigeno già individuati, fornendo un primo passo verso la definizione la circuiteria completa per risposte indotta da ipossia 10,11. Usando la nostra analisi in combinazione con atterramento selettiva neurale tramite il sistema GAL4-UAS12 è un percorso chiaro per la delineazione ulteriori componenti della rete neurale.
Qui abbiamo presentato un’analisi semplice, progettata per rilevare l’ipossia tissutale nelle larve di d. melanogaster . La diagnosi si basa sulla diminuzione scavando cunicoli tumuli di cibo nei primi anni di vita larvale e l’assenza di substrato tunneling tardi nella vita larvale. Affollamento larvale può causare precoce migrazione lontano da una fonte di cibo e quindi un aspetto critico del test è che un piccolo numero di larve è dosato in presenza di un grande eccesso di cibo. L’inclusione del benzoato di idrossile di fungicida metil-p (Nipagen) nelle piastre agar è anche essenziale per impedire la crescita di muffe durante il dosaggio.
Troviamo che le piastre di agar possono essere una fonte di variabilità nell’analisi. In genere, le larve dello stesso genotipo, da differenti gruppi di genitori, o da diverse collezioni di larve, mostrano variazioni relativamente limitato nel loro comportamento nell’analisi. Al contrario, piastre di agar fatto in giorni diversi o con diversi lotti di agar possono produrre differenze di tunneling. Una condizione è pertanto tale controllo e larve sperimentali devono tutti essere verificate utilizzando piastre di agar dalla stessa preparazione batch. Agar di produttori diversi o anche le spedizioni dalla stessa fabbricazione possono variare nel loro potere gelatinizzante, e quindi può essere necessario regolare la concentrazione di agar verso l’alto dal 2,2% usato qui per ottenere un gel ottimo. Abbiamo trovato che le larve di tipo selvaggio possono prontamente tana attraverso gel 3% agar.
Al fine di dimostrare il valore di questo test, abbiamo utilizzato per indagare la potenziale ipossia tissutale nelle larve con soppressa funzione di uninflatable in trachee. I nostri risultati forniscono l’appoggio importante per l’ipotesi che la perdita di tracheale espressione di questo gene può produrre ipossia: btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larve ha mostrato il guasto alla tana in cibo e completa assenza di substrato tunneling durante il terzo instar. Nei nostri studi precedenti di altri genotipi, abbiamo osservato che la perdita indotta da ipossia di cibo scavando non è completo come perdita di substrato tunneling e btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larve studiato qui si sono comportati allo stesso modo. Il componente di tunneling non riuscito di questo test fornisce pertanto l’indicazione più forte di ipossia.
Anche se il btl-Gal4 > uif RNAi larve ha mostrato tratti comportamentali diagnostica di ipossia, il taglio(ue)-Gal4 > UAS –uif RNAi non ha esibito queste anomalie. Il btl e tagliare(ue), Gal4 driver sono espressi in diverse fasi e in diversi modelli, all’interno le trachee larvale. Il btl-Gal4 driver è espresso in tutto il sistema trachea a partire dal suo sviluppo nell’embriogenesi e continuando attraverso la vita larvale. Al contrario, espressione Gal4 dal taglio(ue)-Gal4 driver solo inizia alla fine della vita embrionale, dopo morfogenesi delle trachee ed è limitato alle sezioni posteriore estreme dei tronchi dorsale, i principali vasi longitudinali di il sistema trachea. atterramento di UIF con questa linea di Gal4 non può pertanto ridurre la uif espressione abbastanza presto o largamente sufficiente a produrre qualche livello di soglia di ipossia da innescare i comportamenti misurato in questo test.
Uno studio precedente trovato che terza larve instar esposte a bassi livelli di ossigeno (10%) mostrano crescita è diminuito e ha ritardato l’inizio di pupariation 14. Il btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larve studiate qui ha diventato il terzo instar, ma gli effetti sui loro tassi di crescita e impupamento erano più pronunciati: erano considerevolmente più piccoli rispetto ai controlli con molto poco tessuto adiposo sotto la epidermide (Figura 3) e solo una piccola frazione (~ 10%) ha tentato di pupariation. Queste differenze suggeriscono il btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larve ha avvertito un maggior grado di ipossia, uif atterramento nelle trachee era presente durante tutta la loro vita larvale, o perché ha prodotto un più privazione dell’ossigeno severa nel terzo instar. A questo punto è chiaro come perdita di funzione di uif nelle trachee potrebbe impedire il trasporto dell’ossigeno. Le trachee di btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larve sono state prontamente visibile attraverso la cuticola (Figura 3), un’indicazione che conteneva aria e non sono stati danneggiati al punto che fluido voce funzione compromessa. È formalmente possibile quindi che il danno trachea creato da perdita di funzione di uif non suscitare ipossia ma piuttosto qualche altro difetto che inibisce il tunneling. Per i genotipi studiati in precedenza, abbiamo determinato che il mancato traforo è associato con i livelli elevati di LDH mRNA7, l’indicatore canonico di glicolisi e di ipossia in ritardo terzo instar larve 15. Così, la conferma definitiva di ipossia per il btl-Gal4 > UAS –uif RNAi larve (e nelle larve esaminate in futuro utilizzo di questo test) comporterebbe RT-PCR per valutare i livelli di mRNA LDH o l’uso di un indicatore disponibile in commercio per misurare livelli di ossigeno intracellulare (ad esempio vedere 16).
The authors have nothing to disclose.
Karen M. Qiang è stato il destinatario di 2016 di George J. Schroepfer Research Award alla Rice University. Fanli Zhou è il destinatario di una borsa di studio di insegnamento presso la Rice University. I servizi del centro Stock Drosophila Bloomington, l’impianto di Harvard TRiP, il centro di risorse di Drosophila Vienna sono ringraziano.
REAGENTS | |||
Dehydrated yeast | |||
Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
EQUIPMENT | |||
50 ml polypropylene beakers | |||
6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |