Articolo metodologico
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Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la costruzione di una libreria dei fagi-visualizzato anticorpo sintetico con diversità su misura. Gli anticorpi sintetici hanno vaste applicazioni dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica.
Domanda per gli anticorpi monoclonali (mAbs) nella ricerca di base e la medicina è in aumento ogni anno. Tecnologia dell'ibridoma è stato il metodo dominante per lo sviluppo di mAb dal suo primo rapporto nel 1975. Come una tecnologia alternativa, metodi di visualizzazione dei fagi per sviluppo di mAb sono sempre più attraente poiché Humira, il primo anticorpo dei fagi-derivato e uno dei Best-Seller mAbs, è stato approvato per il trattamento clinico dell'artrite reumatoide nel 2002. Come un non-animale basato su tecnologia di sviluppo di mAb, esposizione dei fagi bypassa l'immunogenicità dell'antigene, umanizzazione e manutenzione degli animali che sono richiesti da ibridomi tradizionale tecnologia basato lo sviluppo di anticorpi. In questo protocollo, descriviamo un metodo per la costruzione di librerie Fab dei fagi-visualizzato sintetiche con le diversità del9-10 1010 ottenibili con un singolo elettroporazione. Questo protocollo si compone di: 1) preparazione delle cellule electro-competente ad alta efficienza; 2) estrazione di uracile-contenenti DNA single-stranded (dU-ssDNA); 3) metodo di Kunkel base mutagenesi oligonucleotide-diretta; 4) elettroporazione e calcolo della dimensione di biblioteca; 5) analisi della proteina A/L-based enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per la piegatura e la valutazione della diversità funzionale; e 6) analisi di sequenza del DNA della diversità.
anticorpi monoclonali hanno vaste applicazioni che vanno dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica. A partire dal 2016, mAbs più di 60 sono stati approvati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (USFDA) per il trattamento clinico delle malattie autoimmuni, il cancro e malattie infettive1,2.
Nel 1975, Kohler e Milstein segnalato una tecnica per la generazione continua di anticorpi di una singola specificità clonale da una fonte cellulare indicata come 'ibridomi' e questa tecnica è successivamente diventato una pietra miliare nella medicina e nell'industria....
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Nota: Puntali sterili con filtro devono essere utilizzati in tutto quando si tratta dei fagi per evitare la contaminazione per pistola pipetta e la zona circostante. Zona asettica o cappa deve essere utilizzato quando esperimenti di manipolazione con batteri e fagi. Zona di esperimento dei fagi dovrà essere ripulita utilizzando 2% sodio dodecil solfato (SDS) seguito da etanolo al 70% per evitare la contaminazione dei fagi. Per effettuare diluizioni seriali nel presente protocollo, le nuove punte devono essere utilizzati per ogni diluizione.
1. preparazione di Electro-competenti delle cellule di e. Coli 320
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Seguendo il diagramma di flusso della costruzione favolosa biblioteca (Vedi Figura 1), abbiamo preparato M13KO7 helper dei fagi pre-infettato 320 Escherichia coli cellule electro-competenti. L'efficienza di queste cellule electro-competente è stimato come 2 X 109 cfu / µ g quando la spina dorsale phagemid Fab per la costruzione della libreria è stata utilizzata (Figura 4).
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Per costruire alta diversità, dei fagi-visualizzato Fab biblioteche, controllo di qualità sono necessari punti di controllo per monitorare le varie fasi del processo di costruzione, tra cui la competenza delle celle electro-competenti, qualità del modello dU-ssDNA, efficienza di CCC-dsDNA sintesi, titolo dopo elettroporazione, Fab pieghevole e diversità dell'amminoacido di CDRs mediante analisi di sequenza di cloni di Fab-fago.
Alta resa e purezza di dU-ssDNA è essenziale per tasso di alta mut.......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Gli autori apprezzano Dr. Frederic Fellouse dal laboratorio Sidhu per osservazioni critiche sulla costruzione della libreria di Kunkel metodo basata sintetica dei fagi Fab. Gli autori apprezzano la signora Alevtina Pavlenco e gli altri membri dal laboratorio Sidhu per il prezioso aiuto di preparazione ad alta efficienza elettro-competenti le cellule e. coli e alta qualità dU-ssDNA. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No.: 81572698, 31771006) a DW e dall'Università di ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) al laboratorio di ingegneria dell'anticorpo.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| 1,0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1,0 M Tris, pH 8,0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM ditiotreitolo | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP miscela | GE Healthcare | 28-4065-60 | soluzione contenente 25 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP e dTTP. |
| 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarosio | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillina, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in acqua, 0,22 μ m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 100 μ g/mL. |
| Cloramfenicolo, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in etanolo, 0,22 μ m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 10 μ g/mL. |
| EDTA 0,5 M, pH 8,0 | Invitrogen | AM9620G | |
| agar granulato | VWR | J637-500G | |
| H2O2 substrato di perossidasi | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamicina, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in acqua, 0,22 μ m filtro-sterilizzazione, concentrazione di lavoro: 50 μ g/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop Fisher | ND2000C | ||
| NaOH | Fisher | SS256 | ! ATTENZIONE Il NaOH provoca ustioni. |
| Latte in polvere NON magro | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Proteina A-HRP coniugato | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| Kit di estrazione del gel QIAquick | Qiagen | 28706 | |
| Kit di purificazione QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | |
| Proteina ricombinante L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polimerasi | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polinucleotide chinasi | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polimerasi | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetraciclina, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in acqua, 0. 22 μ m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 10 μ g/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 Sigma | P2287 | ||
| Glicerolo ultrapuro | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridina | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in etanolo, concentrazione di lavoro: 0,25 μ g/mL. |
| Estratto di lievito | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotipo: dut- ung- thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Utilizzato per la preparazione di dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotipo: [F'proAB+lacIq lacZΔ M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ (araABC-leu)7679 e Delta; lacX74 galUgalK rpsL thi. Ottimizzato per l'elettroporazione ad alta efficienza e la produzione di batteriofagi filamentosi. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| >Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvetta | BTX | ||
| 96-pozzetto 2mL Piastre a pozzetti profondi | Fisher | 278743 | |
| 96 pozzetti Maxisorp | piastre Nunc | 151759 | |
| Flaconi deflettori | Corning | ||
| Centrifuga da banco | Eppendorf | 5811000096 | |
| Flaconi per centrifuga | Nalgene | ||
| ECM-630 Elettroporatore | BTX | ||
| Magnetic ancorette | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuga | Fisher | ||
| Agitatore ad alta velocità | TAITEK | MBR-034P | |
| Agitatore per micropiastre | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Gestore di liquidi per 96 e 384 pozzetti | RAININ | ||
| Pipetta multicanale | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentratore | Merck | UFC803096 |
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