Articolo metodologico

Costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura

DOI:

10.3791/57357

⸱

1 maggio 2018

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1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la costruzione di una libreria dei fagi-visualizzato anticorpo sintetico con diversità su misura. Gli anticorpi sintetici hanno vaste applicazioni dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica.

Abstract

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Domanda per gli anticorpi monoclonali (mAbs) nella ricerca di base e la medicina è in aumento ogni anno. Tecnologia dell'ibridoma è stato il metodo dominante per lo sviluppo di mAb dal suo primo rapporto nel 1975. Come una tecnologia alternativa, metodi di visualizzazione dei fagi per sviluppo di mAb sono sempre più attraente poiché Humira, il primo anticorpo dei fagi-derivato e uno dei Best-Seller mAbs, è stato approvato per il trattamento clinico dell'artrite reumatoide nel 2002. Come un non-animale basato su tecnologia di sviluppo di mAb, esposizione dei fagi bypassa l'immunogenicità dell'antigene, umanizzazione e manutenzione degli animali che sono richiesti da ibridomi tradizionale tecnologia basato lo sviluppo di anticorpi. In questo protocollo, descriviamo un metodo per la costruzione di librerie Fab dei fagi-visualizzato sintetiche con le diversità del9-10 1010 ottenibili con un singolo elettroporazione. Questo protocollo si compone di: 1) preparazione delle cellule electro-competente ad alta efficienza; 2) estrazione di uracile-contenenti DNA single-stranded (dU-ssDNA); 3) metodo di Kunkel base mutagenesi oligonucleotide-diretta; 4) elettroporazione e calcolo della dimensione di biblioteca; 5) analisi della proteina A/L-based enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per la piegatura e la valutazione della diversità funzionale; e 6) analisi di sequenza del DNA della diversità.

Introduzione

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anticorpi monoclonali hanno vaste applicazioni che vanno dalla ricerca di base alla malattia diagnostica e terapeutica. A partire dal 2016, mAbs più di 60 sono stati approvati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration (USFDA) per il trattamento clinico delle malattie autoimmuni, il cancro e malattie infettive1,2.

Nel 1975, Kohler e Milstein segnalato una tecnica per la generazione continua di anticorpi di una singola specificità clonale da una fonte cellulare indicata come 'ibridomi' e questa tecnica è successivamente diventato una pietra miliare nella medicina e nell'industria3 ,4. Generazione di anticorpi monoclonali da questo metodo richiede vari passaggi tra cui la produzione dell'antigene, l'immunizzazione del mouse, estrazione dei linfociti B, fusione di cellule B con cellule di mieloma per formare cellule di ibridoma immortale, selezione clonale e per le applicazioni terapeutiche, umanizzazione è necessaria per evitare di anticorpo umano anti-topo (HAMA)4,5. Tuttavia, per questa tecnologia, gli antigeni incluse proteine altamente conservati tossine e agenti patogeni sono relativamente inefficaci nell'innescare la risposta immunitaria in vivo per mAb produzione5.

Nel 1978, Hutchison et al ha segnalato l'uso di un oligonucleotide di mutagenesi diretta di un residuo in un singolo filamento batteriofago virus6. Nel 1985, Smith ha riferito che frammenti di gene estraneo possono essere fuso nel telaio con del gene che codifica la proteina di cappotto dei fagi III e pertanto possono essere visualizzati sulla superficie dei fagi senza compromettere la sua infettività7. Questi lavori pionieristici gettato le basi per la successiva costruzione di librerie anticorpali dei fagi-visualizzati nel sistema immunitario, ingenuo, e sintetico forme con i formati del frammento variabile singola catena (scFv) e antigene-legante frammento (Fab) per terapeutico mAb sviluppo8,9. Dal punto di vista tecnico, lo sviluppo dei fagi dell'anticorpo basato su display offre un approccio complementare allo sviluppo basato su ibridoma mAb che possa aiutare ad per aggirare le limitazioni che possono rappresentare alcuni antigeni e processo di umanizzazione che anticorpi derivati ibridoma spesso richiedono5. A partire dal 2016, 6 phage display-derivato mAbs sono state approvate nel mercato compreso Humira, uno dei più riusciti mAbs utilizzato per il trattamento dell'artrite reumatoide, e molti dei fagi display-derivato dell'anticorpo candidati sono attualmente in varie fasi della clinica indagine10.

Per librerie anticorpali fagiche immunitario e ingenuo, la diversità di dideterminazione regioni (CDR) nella catena leggera e pesante è derivato dal repertorio immune naturale (vale a dire, dalle cellule di B). Al contrario, la diversità di CDRs in librerie anticorpali sintetico dei fagi è interamente artificiale. Approcci sintetici per la costruzione della libreria forniscono il controllo preciso sopra il disegno della diversità di sequenza e offrono opportunità per studi meccanicistici di struttura dell'anticorpo e funzionano11,12. Inoltre, il framework per le librerie sintetiche può essere ottimizzato prima costruzione della libreria per facilitare a valle, lo sviluppo industriale su larga scala11,12.

Nel 1985, Kunkel segnalati un approccio di mutagenesi basate su modelli single-stranded DNA (ssDNA) per introdurre le mutazioni sito-diretta in batteriofago M13 efficientemente13. Questo approccio è stato successivamente utilizzato ampiamente per costruzione delle librerie dei fagi-visualizzato. Oligonucleotidi di DNA sintetizzati chimicamente progettati per introdurre diversità nella Fab CDRs sono incorporati in un phagemid con un modello di spina dorsale dell'anticorpo. In questo processo, il phagemid è espressa come un uracile-contenente ssDNA (dU-ssDNA) e gli oligonucleotidi sono ricotto sul CDRs ed estesa per sintetizzare DNA a doppia elica (dsDNA) in presenza di DNA di T7 polimerasi e T4 DNA ligasi. Infine, generato ds-DNA può essere introdotto in Escherichia coli mediante elettroporazione.

Per elevata diversità, costruzione della libreria dei fagi-visualizzati, elettroporazione ad alta tensione di una miscela di due componenti delle cellule electro-competenti e covalenza dsDNA circolare chiusa (CCC-dsDNA) deve essere preparato con cura. Sidhu et per volta la preparazione di cellule competenti di electro e DNA da metodi tradizionali e notevolmente migliorato biblioteca diversità14.

In questo protocollo, descriviamo un metodo per la costruzione di librerie Fab dei fagi-visualizzato sintetiche con le diversità del9-10 1010 ottenibili con un singolo elettroporazione. La figura 1 Mostra una panoramica della libreria costruzione tra cui: 1) preparazione delle cellule electro-competente ad alta efficienza; 2) estrazione di dU-ssDNA; 3) metodo di Kunkel base mutagenesi oligonucleotide-diretta; 4) elettroporazione e calcolo della dimensione di biblioteca; 5) proteina A/L-based ELISA per la piegatura e la valutazione della diversità funzionale; e 6) analisi di sequenza del DNA della diversità. Tutti i reagenti, ceppi e attrezzature sono elencati nella tabella del materiale. La tabella 1 Mostra la configurazione di reagente.

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Protocollo

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Nota: Puntali sterili con filtro devono essere utilizzati in tutto quando si tratta dei fagi per evitare la contaminazione per pistola pipetta e la zona circostante. Zona asettica o cappa deve essere utilizzato quando esperimenti di manipolazione con batteri e fagi. Zona di esperimento dei fagi dovrà essere ripulita utilizzando 2% sodio dodecil solfato (SDS) seguito da etanolo al 70% per evitare la contaminazione dei fagi. Per effettuare diluizioni seriali nel presente protocollo, le nuove punte devono essere utilizzati per ogni diluizione.

1. preparazione di Electro-competenti delle cellule di e. Coli 320

  1. Pre-riscaldare piastra di agar LB/tet (preparati e conservati a 4 ° C per meno di 1 - settimana-vecchio) presso Incubatore 37 ° C per 1 h. utilizzare un ciclo di inoculazione sterile o la punta sterile per striscia fuori uno stock di glicerolo di cellule di e. coli 320 sulla piastra di agar LB/tet pre-riscaldata in una direzione a zig-zag zione delicatamente lungo la superficie della piastra. Incubare la piastra a incubatore 37 ° C durante la notte per circa 12-15 h.
  2. Il giorno seguente, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile o la punta sterile per prendere una singola Colonia ben separata lungo la linea a zig-zag e inoculare in 10 mL di terreno di 2YT/tet in un tubo da 50mL fondo tondo immergendo il ciclo in mezzo e mescolare brevemente.
  3. Incubare a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min per circa 3-4 h fino a OD600 viene raggiunta a circa 0.4-0.8 (crescita del log di fase). Monitor OD600 a 2 h. Durante questo periodo, pre-riscaldare le piastre di agar 5 LB/tet (preparati e conservati a 4 ° C per meno di 1 - settimana-vecchio) in un incubatore a 37 ° C per almeno 1 h.
  4. Aggiungere dei fagi helper di 20 μL M13KO7 da Stock in laboratorio con titolo circa 1 x 1013 colony forming unit (cfu) /mL in 180 μL di sterile 1 X PBS in provette da 1,5-mL sterilizzato nell'autoclave per preparare 10 diluizioni seriali dieci volte.
  5. Aliquota 4 mL sterilizzato nell'autoclave e liquido 2YT agar superiore in 5 X 14 mL fondo tubi tondi, etichettare ogni provetta con una diluizione dalla quinta alla nona della diluizione dieci volte, rispettivamente e incubare in un'incubatrice di 65 ° C per mantenere l'agar superiore 2YT allo stato liquido.
  6. Mix 500 μL di fase di registro 320 Escherichia coli cellule nella provetta di diluizione M13KO7 (scegliere il quinto diluizione dieci volte alla nona diluizione dieci volte) ed incubare in un incubatore a 37 ° C per 5-10 min.
  7. Durante l'incubazione del passaggio 1.6, trasferimento 2YT agar superiore da passo 1.5 a temperatura ambiente (TA) raffreddare per circa 5 min a 42 ° C. Utilizzare il polso interno per verificare la temperatura di 2YT agar superiore; dovrebbe rimanere come liquido. Trasferire ciascuna miscela di diluizione da passo 1.5 a ciascuna provetta di agar superiore 2YT corrispondente. Stringere il coperchio di ogni provetta e miscelare capovolgendo più volte delicatamente e brevemente per evitare la generazione di bolle.
  8. Attentamente ogni versate lungo il bordo di una piastra di agar LB/tet pre-calda (dal punto 1.3) e inclinano la piastra leggermente per completamente e uniformemente riempire il piatto con la miscela, evitando l'introduzione di bolle. Tenere le piastre a temperatura ambiente per circa 5-10 min per solidificare l'agar superiore all'interno di ogni piatto e incubare le piastre di agar superiore 2YT a 37 ° C durante la notte per circa 15-18 h.
  9. Scegliere la piastra di diluizione dopo una notte crescita dal passaggio 1.8 con intorno 100-200 targhe medie, singoli, ben separati per inoculazione di placca. Usare una mano per tenere la piastra di agar contro una sorgente di luce e l'altra mano per tenere una pistola di pipetta caricata con una pipetta sterile lungo verticalmente pugnalare l'agar superiore e raccogliere una piastra singola e ben separata.
    1. Inclinano il puntale della pipetta leggermente per separare top agar con placca. Pipetta su e giù più volte per sloggiare l'agar con placca in un tubo di cultura di fondo tondo 14-mL pre-caricato con 1 mL di terreno di 2YT/kan/tet (Vedi tabella 1).
    2. Ripetere questa procedura per prendere 3-5 placche in totale. Lo scopo di raccogliere diverse placche è per garantire successo inoculazione, come una targa può essere debole e relativamente piccolo se confrontato con una colonia di batteri. Crescere le placche per 8 h a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
  10. Trasferire un filmato di crescere cultura in 50 mL di terreno di 2YT/kan/tet in un pallone di sconcertato da 250 mL. Crescere a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte per circa 12 h.
  11. Inoculare 2-L tre boccette sconcertati che contiene 900 mL di superbroth/tet/kan medio ogni 5 ml della coltura durante la notte. Incubare a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min per 6-7 h a OD600 intorno a 0.6-0.8.
  12. Raffreddare i tre fiaschi di coltura batterica in un bagno di ghiaccio per 5 min con costante agitando delicatamente a mano. La procedura seguente dovrebbe essere fatto in una stanza fredda, sul ghiaccio, con attrezzature e soluzioni prechilled.
  13. Utilizzare assorbanza tessuto asciugamano per asciugare il vetro esterno di ciascuna beuta; usare una mano per inclinare la bottiglia 1-L autoclavato centrifuga sulla panca e l'altra mano per versare il mezzo delicatamente da ciascuna beuta in ogni bottiglia di centrifuga.
  14. Spin a 5.000 × g e 4 ° C per 10 min a pellet i batteri.
  15. Dopo centrifugazione, delicatamente decantare il supernatante in un becher di rifiuti autoclavato 5-L.
  16. Riempire ogni flacone con 100 mL di filtrato sterile 1,0 mM HEPES, pH 7.4 e aggiungere un'ancoretta magnetica in autoclave ad ogni bottiglia per aiutare nella risospensione del pellet a 200 giri/min. Il turbinio e sloggiare il pellet intero da pareti della bottiglia ogni alcuni minuti durante l'agitazione magnetica. Una volta che la pallina è dissolto, riempire ogni bottiglia con un ulteriore 400 mL di filtrato sterile 1,0 mM HEPES, pH 7.4.
  17. Centrifugare a 5.000 × g e 4 ° C per 10 min. decantare il supernatante, mantenendo l'ancoretta in bottiglia.
  18. Ripetere i passaggi da 1,16-1,17 una volta.
  19. Ogni risospendere in 500 mL di filtrato sterile, 10% glicerolo ultrapura con l'ausilio delle barre mescolare. Il turbinio e sloggiare il pellet intero da pareti della bottiglia ogni alcuni minuti durante l'agitazione magnetica.
  20. Centrifugare e decantare come descritto al punto 1.17. Ripetere il passaggio 1.19 una volta. Utilizzare forcipe autoclavato lungo-braccio per rimuovere la barra per l'agitazione.
  21. Centrifugare a 5.000 × g e 4 ° C per 15 min. decantare il supernatante e rimuovere qualsiasi residuo di surnatante da ogni flacone di centrifuga con una pipetta.
  22. Aggiungere 3,0 mL di glicerolo al 10% ultrapura a una bottiglia e Risospendere delicatamente la pipettando. Trasferire la sospensione nel flacone successivo e ripetere fino a quando tutti i pellet sono risospese e combinati in una bottiglia. Circa 6 mL di cellule altamente concentrate sono ottenuti con un titolo di circa 3 x 1011 cfu/mL.
  23. Pre-chill per microcentrifuga da 1,5 mL sterilizzato nell'autoclave e scatola di immagazzinaggio di un tubo di 96 pozzetti senza divisori a-80 ° C per almeno 1 h prima di questo passaggio. Trasferire la microcentrifuga pre-refrigerati a camera fredda su ghiaccio prima di pipettaggio aliquote della sospensione pellet cellulare. Utilizzare una pipetta per aliquota 350 µ l di sospensione cellulare in ciascuna provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
  24. Trasferire le aliquote in un contenitore di scatola schiuma riempito con azoto liquido per congelamento flash (3-5 min).
    1. Trasportare la scatola della gomma piuma con azoto liquido per un congelatore a-80 ° C (vedi passo 1,23).
    2. Rimuovere la scatola di immagazzinaggio del tubo per microcentrifuga da 1,5 mL dal congelatore-80 ° C (vedi passo 1,23) e mettere il ghiaccio.
    3. Utilizzare rapidamente una rete metallica per setacciare le aliquote da azoto liquido e metterli in scatola per la conservazione di tubo. Conservare a-80 ° C.
      Attenzione: Azoto liquido può causare ustioni e cura deve essere presa per la protezione di sicurezza. Utilizzare un phagemid Fab spina dorsale per verificare l'efficienza delle celle electro-competente preparate (lo stock di phagemid Fab spina dorsale dovrebbe essere in acqua ultrapura (MilliQ) a 400 ng / µ l). Scongelare 1 μg della spina dorsale Fab phagemid in acqua ultrapura di 10 µ l e un'aliquota di 350 μL di 320 electro-competente sul ghiaccio e prechill una cuvetta di elettroporazione di 0,2 centimetri gap sul ghiaccio.
  25. Aggiungere il 350 μL electro-competente 320 celle al 10 µ l di DNA dopo lo scongelamento e Miscelare pipettando diverse volte, mantenendo le miscele sul ghiaccio. Evitare l'introduzione di bolle.
  26. Pre-riscaldare 15 mL di terreno SOC in un tubo da 50mL in bagnomaria a 37 ° C per almeno 30 min prima di elettroporazione. Trasferire il composto di 360 μL in cuvetta ed eseguire elettroporazione seguendo le istruzioni del produttore.
  27. Salvato immediatamente le cellule dopo elettroporazione aggiungendo 1 mL di terreno SOC pre-riscaldato (da passo 1,27) e pipettaggio. Trasferire il mezzo dalla cuvette in un pallone di 125 mL pre-caricato con 5 mL di pre-riscaldato Soc.
  28. Sciacquare la cuvetta due volte, ogni volta con 1 mL di mezzo SOC pre-riscaldato e trasferire il mezzo al pallone da 125mL (vedi passo 1,27). Aggiungere il pre-riscaldato SOC terreno in un volume finale di 10 mL al pallone da 125mL.
  29. Incubare la coltura delle cellule di 10 mL per 30 min a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
  30. Effettuare diluizioni seriali per determinare l'efficienza di trasfezione e il tasso di pre-infezione M13KO7.
    1. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 180 μL di 2YT media in ciascun pozzetto di una singola colonna di una piastra microtiter di 96.
    2. Fare dieci volte seriale 8 diluizioni: trasferire 20 μL di cultura dal passaggio 1,29 per il primo pozzetto della piastra, mix pipettando e trasferire 20 μL di miscela al successivo bene. Ripetere questo passaggio fino alla fine della diluizione seriale.
    3. Piastra 10 μL di ogni diluizione seriale sulle piastre LB/carb, LB/kan e LB/tet in duplice copia.
    4. Incubare per una notte a 37 ° C.
    5. Formula di calcolo di efficienza: si supponga che M è il numero medio di Colonia contato dalla piega diluita 10N (N è da 1-8). L'efficienza di trasfezione Escherichia coli 320 electro-competente delle cellule del phagemid Fab spina dorsale dalla piastra LB/carb è uguale a M X 10N + 3 cfu / µ g. Il tasso di pre-infezione M13KO7 è stimato dal rapporto delle colonie in LB/kan e LB/tet. La percentuale di cellule competenti di Escherichia coli 320 transfettate con la spina dorsale Fab phagemid è stimata dal rapporto delle colonie in LB/carb e LB/kan.

2. preparazione contenente uracile ssDNA (dU-ssDNA) dal modello Phagemid

Nota: A precedentemente segnalato phagemid Fab spina dorsale è stato utilizzato come modello per dU-ssDNA preparazione15. L'architettura della spina dorsale Fab phagemid è illustrata nella Figura 2. Un kit di spin di plasmide (QIAprep Spin M13) viene utilizzato per l'estrazione di dU-ssDNA con lievi modifiche.

  1. Pre-riscaldare una piastra LB/cmp (preparati e conservati a 4 ° C per meno di 1 - settimana-vecchio) in un incubatore a 37 ° C per 1 h. striscia fuori uno stock di glicerolo di cellule di Escherichia coli CJ236 (o un altro ceppo di dut−/ung−) con Anse sterili o suggerimenti sulla piastra LB/cmp pre-riscaldata. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte per circa 12-15 h.
  2. Scegli una singola Colonia con una punta sterile e inoculare in 2 mL di terreno di 2YT/cmp in una provetta di turno-fondo 14 mL in polipropilene.
  3. Incubare il mezzo a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min per 3-4 h fino a OD600 viene raggiunta a circa 0.4-0.8 (crescita del log di fase).
  4. Aggiungere dei fagi di 5-10 μL di modello di Fab spina dorsale nella cultura e incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 30 min consentire l'infezione fagica.
  5. Dopo l'incubazione, utilizzare una punta sterile per striscia fuori 10 μL di coltura su una piastra di LB/carb pre-riscaldata a 37 ° C. Incubare a 37 ° C durante la notte per circa 12-15 h.
  6. Selezionare una singola Colonia del CJ236 di e. coli contenenti spina dorsale Fab phagemid a inoculare una coltura starter di 3ml 2YT/carb/cmp in una provetta di turno-fondo 14 mL in polipropilene, crescere a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte per circa 12 h.
  7. Inoculare la coltura starter 0,3 mL in 30 mL 2YT/carb/cmp in un flacone di 250 mL sconcertato.
  8. Incubare la coltura cellulare a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min per 3-4 h fino a OD600 viene raggiunta a circa 0.4-0.8 (crescita del log di fase).
  9. Aggiungere il M13KO7 (titolo stock, laboratorio di circa 1 x 1013 cfu/mL) alla cultura da passo 2.8 con una molteplicità di infezione (MOI) di circa 10 e il titolo finale degli M13KO7 è circa 1 x 1010 cfu/mL.
  10. Incubare a 200 giri/min e 37 ° C per 1 h.
  11. Pallina la cultura mediante centrifugazione in un tubo di turno-fondo 50 mL a 5.000 × g e 25 ° C per 20 min.
  12. Decantare il supernatante e risospendere il sedimento con 30 mL di fresco 2YT/carb/kan/uridina. Trasferire la risospensione in un nuovo flacone di 250 mL sconcertato.
  13. Incubare a 200 giri/min e 25 ° C per 22-24 h.
  14. Trasferire la cultura dal punto 2.13 in una provetta di turno-fondo 50 mL e centrifugare la coltura a 12.000 × g per 20 minuti per separare il fago supernatante dal pellet cellulare batterica. Trasferire il surnatante fago in un nuovo tubo tondo-fondo 50 mL e aggiungere 1/5 il volume finale della soluzione PEG/NaCl per precipitare il fago. Mescolare bene e incubare in ghiaccio per 30 min per far precipitare le particelle dei fagi.
  15. Centrifugare a 12.000 × g e 4 ° C per 30 min. decantare il supernatante e centrifugare a 4.000 × g e 4 ° C per 2 min. aspirare il supernatante rimanente.
  16. Risospendere il pellet di fago in 2 mL di filtrato sterile 1X PBS e trasferimento per provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 12.000 × g per 5 min in una microcentrifuga da banco per rimuovere eventuali detriti batterici residui e trasferire il surnatante fago in nuove provette microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a 4 ° C.
  17. Verificare l'efficienza di incorporazione di uracile in CJ236 di Escherichia coli mediante confronto fianco a fianco con 320 di e. coli .
    1. Aggiungere 180 μL di 2YT media in ciascun pozzetto di una singola riga di una piastra a 96 pozzetti.
    2. Fare dieci 10 volte seriale diluizioni: trasferire 20 μL del surnatante fago al primo pozzetto della piastra, Miscelare pipettando e trasferire ben 20 μL di miscela a quella successiva. Ripetere questo passaggio fino alla fine della diluizione seriale.
    3. Aggiungere 10 μL di fago dalle ultime otto diluizioni seriali di infettare 90 μL di e. coli CJ236 e 320 di e. coli in fase di log (OD600 = 0.4-0.8). Incubare a 37 ° C per 30 min con agitazione delicata.
    4. Piastra 10 μL dalla diluizione seriale di ogni infezione in e. coli CJ236 e 320 di e. coli sulle piastre 2YT/Carb in duplice copia.
    5. Incubare per una notte a 37 ° C.
    6. Formula di calcolo del titolo: si supponga che M è il numero medio di Colonia contato dalla piega diluita 10N (N è da 1 a 10). Il titolo da e. coli CJ236 o e. coli 320 è uguale a M X 10N + 2 cfu/mL. Stimare l'efficienza dell'incorporazione di uracile dal rapporto titolo di e. coli CJ236 e 320 di e. coli .
  18. Aggiungere volume 1/100 di buffer precipitazione dei fagi MP nel fago surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e girare sottosopra delicatamente per mescolare per diverse volte. Incubare a temperatura ambiente per almeno 2 min dei fagi particelle sono precipitate da terreno di coltura, e quindi, una soluzione nuvolosa dovrebbe essere visibile a questo punto.
  19. Applicare il campione dal punto 2.18 a una colonna di spin del plasmide (ad esempio, QIAprep) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. La capacità legante della colonna uno spin per ssDNA può raggiungere almeno 10 µ g. centrifuga a 6.000 × g e 25 ° C per 30 s in una microcentrifuga da banco. Scartare il flusso-attraverso la quale è nel tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Particelle dei fagi rimangono legate alla matrice colonna in questa fase.
  20. Aggiungere 0,7 mL della lisi dei fagi UT-MLB e buffer obbligatorio (Vedi discussione) alla colonna e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 min.  Centrifugare a 6.000 x g e a 25 ° C per 30 s e scartare il flusso continuo.
  21. Aggiungere un altro 0,7 mL di tampone UT-MLB e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 min.
  22. Centrifugare a 6.000 × g per 30 s. scartare il flusso continuo. In questa fase, la proteina del cappotto dei fagi è separata dal dU-ssDNA, che rimane legato alla matrice colonna.
  23. Aggiungere 0,7 mL di etanolo contenente di wash buffer PE seguendo le istruzioni del produttore. Centrifugare a 6.000 × g per 30 s e scartare il flusso continuo.
  24. Ripetere il passaggio 2.23, poi centrifugare ancora una volta a 6.000 × g per 30 s per rimuovere residui buffer PE.
  25. Trasferire la colonna ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 100 μL di tampone di eluizione EB (10 mM Tris· CL, pH 8.5) al centro della membrana colonna.
  26. Incubare a temperatura ambiente per 10 min e centrifugare a 6.000 × g per 1 min eluire il dU-ssDNA. Circa, 1,5-2,5 μg dU-ssDNA/mL coltura può essere ottenuta.
  27. Analizzare il DNA eluito per electrophoresing 1 μL su una TAE del gel dell'agarosi di 1%. Il DNA deve essere visualizzato come una banda principalmente singola con senza sbavature.
  28. Determinare la concentrazione di DNA di misurare l'assorbanza su uno spettrofotometro nanodrop a 260 nm (un260 = 1.0 per 33 ng/μL di ssDNA). Le concentrazioni tipiche dU-ssDNA sono nel raggio di 200-500 ng/μL.

3. metodo di Kunkel basato mutagenesi Oligonucleotide-diretta

Note: Si consiglia di condurre reazioni su piccola scala prima di reazioni di fondo scala per garantire la qualità dei componenti del oligonucleotide e reazione mutagene. Un fumetto di metodo di Kunkel basato del oligonucleotide-regia mutagenesi è illustrata nella Figura 3. Varie dell'amminoacido diversità vengono introdotti nelle regioni di CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3 con IMGT numerazione nomenclatura16 (tabella 2). Il teorico dell'amminoacido diversità di ogni CDR, aminoacido teorica totale diversità e sequenze di oligonucleotidi sono elencati nella tabella 2.

  1. Fosforilazione del oligonucleotide con chinasi di polinucleotide T4
    1. Combinare 0,6 μg di oligonucleotidi mutageni, progettato per mutare un CDR singolo, con 2 μL 10 X buffer TM, 2 μL 10 mM ATP e 1 μL 100 mM DTT. Aggiungere ultrapura H2O a un volume totale di 18 μL in una provetta da 1,5 mL. Per la costruzione della libreria, 4 reazioni di fosforilazione separate e parallele sono impostate corrisponde a CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL3, rispettivamente.
    2. Aggiungere 20 U (2 uL) della chinasi di polinucleotide T4 a ciascun tubo e incubare per 1h a 37 ° C (reazione 1, tabella 3). Utilizzare immediatamente per ricottura.
  2. Ricottura di oligonucleotidi per il modello
    1. A 20 μg di dU-ssDNA modello, aggiungere 25 μL di tampone di TM X 10, 20 μL di ogni soluzione del oligonucleotide fosforilato e ultrapura H2O ad un volume finale di 250 μL in una provetta 0,5 mL. Mescolare bene e trasferire in provette per PCR 0,20 mL (50 µ l) come reazione 2 nella tabella 3. Queste quantità di DNA forniscono un rapporto molare di 3:1 tra oligonucleotide e modello, supponendo che il rapporto di lunghezza di oligonucleotidi e modello è 1: 100.
    2. Incubare la reazione in una macchina PCR a 90 ° C per 3 min, 50 ° C per 3 min e 20 ° C per 5 min.
  3. Enzimatico di sintesi della CCC-dsDNA
    1. Alla miscela del oligonucleotide/modello 250 μL ricotto, aggiungere 10 μL di 10 mM ATP, 10 μL di miscela del dNTP 25mm, 15 µ l di 100 mM DTT, Weiss 30 unità T4 DNA ligasi e 30 U T7 polimerasi come reazione 3 nella tabella 3.
    2. Incubare la reazione nel tubo da 1,5 mL a 20 ° C durante la notte.
    3. Lavare e concentrare il CCC-dsDNA sintetizzato in un dispositivo di filtro centrifugo 0.5 mL con una membrana di dimensione del poro di 30 kDa a TA.
      1. Trasferire la miscela di reazione durante la notte per il dispositivo di filtro e aggiungere ultrapura H2O 400 µ l di volume finale. Spin a 14.000 × g per 10 min; il volume è inferiore a 50 μL.
      2. Scartare il flusso attraverso, aggiungere 400 µ l di ultrapura H2O nel filtro e girano a 14.000 × g per 10 min.
      3. Ripetere il punto 3.3.3.2 ancora una volta.
      4. Capovolgere il filtro in una microcentrifuga pulito per recuperare il CCC-dsDNA. Spin a 1.000 × g per 2 minuti; il volume recuperato è generalmente circa 20-40 μL. Il CCC-dsDNA recuperato possa essere utilizzato immediatamente per elettroporazione di e. coli o congelato a-20 ° C per un uso successivo. Normalmente 20-40 μg CCC-DNA può essere ottenuta.
    4. Electrophorese 1,0 µ l del prodotto di reazione eluiti a fianco il modello dU-ssDNA per visualizzare il risultato della reazione.

4. elettroporazione e calcolo delle dimensioni della libreria

  1. Raffreddare il CCC-dsDNA purificato (20 μg in un volume massimo di 50 μL) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e una cuvetta di elettroporazione di 0,2 centimetri gap sul ghiaccio.
  2. Pre-riscaldare 20ml di media SOC in una provetta conica per centrifuga in polipropilene da 50mL in bagnomaria a 37 ° C per almeno 30 min.
  3. Scongelare un'aliquota di 350 μL di electro-competente e. coli 320 sul ghiaccio. Aggiungere le cellule del DNA e mescolare accuratamente pipettando diverse volte. Evitare l'introduzione di bolle.
  4. Trasferire il composto in cuvetta ed eseguire elettroporazione seguendo le istruzioni del produttore. Ad esempio, quando viene utilizzato il sistema di elettroporazione di BTX ECM-630, le impostazioni rilevanti sono 2,5 kV intensità di campo, 125 Ω resistenza e capacità di 50 µF.
  5. Salvare immediatamente le cellule elettroporate aggiungendo 1 mL di terreno SOC pre-riscaldato e trasferimento in 17 mL di terreno SOC in un matraccio da 125mL. Sciacquare la cuvetta due volte con 1 mL di medium SOC e trasferimento al pallone stesso (volume finale è di 20 mL).
  6. Incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
  7. Determinare l'efficienza di elettroporazione.
    1. Aggiungere 180 μL di 2YT media in ciascun pozzetto di una singola colonna di una piastra microtiter di 96.
    2. Fare dieci volte seriale 8 diluizioni: trasferire 20 μL della cultura 20 mL nel primo pozzetto della piastra, mescolare con il pipettaggio e trasferire 20 μL di miscela bene a altro. Ripetere questo passaggio fino alla fine della diluizione seriale.
    3. Piastra 10 μL di ciascuna delle diluizioni seriali su una piastra LB/carb in duplice copia. Piastra di 100 µ l restanti da ciascuna delle diluizioni seriali su piastre LB/carb separate per croce-verifica del conteggio di Colonia. Queste piastre fornirà anche singoli cloni per analisi di sequenza ed ELISA (Vedi sezione 5).
    4. Incubare per una notte a 37 ° C.
    5. Contare le colonie dai duplicati μL 10 sulla piastra LB/carb. Si supponga che M sia la Colonia Media numero contato su 10N piega piastra LB/carb (N è da 1-8). La dimensione di raccolta totale è uguale a 2 M X 10N + 3 colonie.
  8. Aliquotare la cultura dal punto 4.6 equamente in due 2-L sconcertati boccette, ciascuno contenente 500 mL di mezzo di 2YT/carb/kan per la generazione della libreria dei fagi.
  9. Incubare a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte per circa 16 h.
  10. Trasferire la cultura a due bottiglie 1-L autoclavato centrifuga e centrifugare per 30 min a 12.000 × g a 4 ° C.
  11. Trasferire il surnatante in due nuove bottiglie di centrifuga in autoclave 1-L e aggiungere 1/5 il volume finale della soluzione PEG/NaCl per precipitare il fago. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  12. Centrifuga per 30 min a 12.000 × g e 4 ° C. Attentamente decantare il supernatante ed evitare di disturbare il precipitato dei fagi. Centrifugare per 1 min a 4.000 x g e rimuovere il surnatante con una pipetta rimanente.
  13. Risospendere il pellet di fago con 20 mL di filtrato sterile 1 X PBS buffer e trasferirlo in una nuova provetta 50 mL.
  14. A pellet la materia insolubile mediante centrifugazione per 5 min a 12.000 × g e 4 ° C. Trasferire il surnatante in una provetta da 50 mL nuova.
  15. Misurare la concentrazione dei fagi mediante lo spettrofotometro (OD268 = 1.0 per una soluzione di 5 X 1012 fago/mL).
  16. Regolare la concentrazione dei fagi a 5 X 1012 fago/mL in 1X PBS con 10% glicerolo ultrapura.
  17. Aliquotare 1 mL di soluzione dei fagi per microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzare le librerie immediatamente per il panning o conservare a-80 ° C.

5. qualità valutazione di proteina A / L diretta analisi ELISA obbligatoria e sequenziamento

  1. Scegliere casualmente 96 singole colonie sulla piastra LB/carb dal passaggio 4.7.3 in una piastra di coltura ben 96-profondo contenente 800 μL di 2YT/carb in ciascun pozzetto. Incubare per 3-4 h a 37 ° C con agitazione a 1.000 giri/min a OD600 = 0.4-0.8.
  2. Aggiungere 100 μL di M13KO7 (1 X 1011 cfu/mL) in ciascun pozzetto di una 96-profonda ben cultura piastra con una pipetta multicanale. Incubare a 37 ° C con agitazione a 1.000 giri/min per 1 h.
  3. Aggiungere 100 μL di 2YT contenente 10 X concentrazione di kanamicina (500 μg/mL) ad ogni pozzetto con una pipetta multicanale. Incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 1.000 giri/min.
  4. Sciogliere la proteina L a 1 µ g/mL in 1X PBS. Cappotto 3/4 dei pozzi in un piatto di polistirolo di legame alle proteine 384 pozzetti elevata con 30 µ l/pozzetto di soluzione della proteina L. Incubare per una notte a 4 ° C.
  5. Scartare la soluzione di rivestimento di proteina L durante la notte dal punto 5.4. Aggiungere 50 µ l di M-PBST (la soluzione bloccante) a tutti i pozzetti della piastra di polistirolo legame 384 pozzetti alta con una pipetta multicanale. Incubare le piastre su un agitatore per micropiastre per 1 h a TA.
  6. Rotazione verso il basso la cultura durante la notte dal punto 5.3 in una piastra a 96 pozzetti profondi cultura a 3.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il fago è nel surnatante.
  7. Scartare la soluzione bloccante dal punto 5.5. Aggiungere 15 μL di M-PBST e 15 μL di ogni fago surnatante (punto 5.6) 3 dei pozzi della proteina L rivestito come triplice copia e 1 controllo bene come negativo non rivestiti, usando una pipetta multicanale. Incubare per 1h a RT con agitazione a 200 giri/min.
  8. Scartare la soluzione dei fagi. Lavare la piastra 6 volte con 80 μL di PBST da una rondella di piatto automatizzato.
  9. Aggiungere 15 μL di M-PBST e 15 µ l di proteina A-HRP (1:1, 500 diluito in 1X PBS) ad ogni pozzetto con una pipetta multicanale e incubare per 1h a RT con agitazione a circa 200 giri/min.
  10. Scartare la soluzione di proteina A-HRP/M-PBST. Lavare la piastra 6 volte con 80 μL di PBST.
  11. Aggiungere substrato TMB (30 μL/pozzetto) con una pipetta multicanale e incubare per 2-3 minuti fino a quando il colore si sviluppa. Fermare la reazione con 1,0 M H3PO4 (30 μL/pozzetto).
  12. Leggere le piastre spettrofotometro a 450 nm. Cloni positivi sono definiti come coloro che presentano un rapporto medio di assorbanza450 OD di pozzi di proteina L per il bene superiore a 3.0 M-PBST.
  13. In un 96-profondo bene, infettare 50 μL di 320 in 2YT/tet in fase di log con 5 μL del fago stesso utilizzato per l'ELISA (punto 5.6) per 30 minuti a TA.
  14. Aggiungere 950 μL di 2YT/carb il 96-largo passaggio 5.13 bene e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 1.000 giri/min.
  15. Estrarre il DNA phagemid da kit di estrazione del DNA di mini-preparazione. Utilizzare il primer a Monte di VL (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') e VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') per l'analisi di sequenza valutare la diversità di sequenza di biblioteca.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguendo il diagramma di flusso della costruzione favolosa biblioteca (Vedi Figura 1), abbiamo preparato M13KO7 helper dei fagi pre-infettato 320 Escherichia coli cellule electro-competenti. L'efficienza di queste cellule electro-competente è stimato come 2 X 109 cfu / µ g quando la spina dorsale phagemid Fab per la costruzione della libreria è stata utilizzata (Figura 4).

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per costruire alta diversità, dei fagi-visualizzato Fab biblioteche, controllo di qualità sono necessari punti di controllo per monitorare le varie fasi del processo di costruzione, tra cui la competenza delle celle electro-competenti, qualità del modello dU-ssDNA, efficienza di CCC-dsDNA sintesi, titolo dopo elettroporazione, Fab pieghevole e diversità dell'amminoacido di CDRs mediante analisi di sequenza di cloni di Fab-fago.

Alta resa e purezza di dU-ssDNA è essenziale per tasso di alta mut...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori apprezzano Dr. Frederic Fellouse dal laboratorio Sidhu per osservazioni critiche sulla costruzione della libreria di Kunkel metodo basata sintetica dei fagi Fab. Gli autori apprezzano la signora Alevtina Pavlenco e gli altri membri dal laboratorio Sidhu per il prezioso aiuto di preparazione ad alta efficienza elettro-competenti le cellule e. coli e alta qualità dU-ssDNA. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No.: 81572698, 31771006) a DW e dall'Università di ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) al laboratorio di ingegneria dell'anticorpo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
1,0 M H3PO4FisherAC29570
1,0 M Tris, pH 8,0Invitrogen15568-025
10 mM ATPInvitrogen18330-019
100 mM ditiotreitoloFisherBP172
100 mM dNTP miscelaGE Healthcare28-4065-60soluzione contenente 25 mM ciascuno di dATP, dCTP, dGTP e dTTP.
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgarosioFisherBP160
Carbenicillina, carbSigmaC1389100 mg/mL in acqua,  0,22 μ m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 100 μ g/mL.
Cloramfenicolo, cmpSigmaC0378100 mg/mL in etanolo, 0,22 μ m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 10 μ g/mL.
EDTA 0,5 M, pH 8,0InvitrogenAM9620G
agar granulatoVWRJ637-500G
H2O2 substrato di perossidasiKirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamicina, kanFisherAC6112950 mg/mL in acqua,  0,22 μ m filtro-sterilizzazione, concentrazione di lavoro: 50 μ g/mL.
KH2PO4SigmaP2222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
Nanodrop FisherND2000C
NaOHFisherSS256! ATTENZIONE Il NaOH provoca ustioni.
Latte in polvere NON magroSangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
Proteina A-HRP coniugatoInvitrogen101123
QIAprep Spin M13 KitQiagen22704
Kit di estrazione del gel QIAquickQiagen28706
Kit di purificazione QIAquick PCRQiagen28104
Proteina ricombinante LFisher77679
T4 DNA polimerasiNew England BiolabsM0203S
T4 polinucleotide chinasiNew England BiolabsM0201S
T7 DNA polimerasiNew England BiolabsM0274S
Tetraciclina, tetSigmaT766050 mg/mL in acqua, 0. 22 μ m filtro-sterilizzare, concentrazione di lavoro: 10 μ g/mL.
TryptoneFisher0123-07-5
Tween-20 SigmaP2287
Glicerolo ultrapuroInvitrogen15514-011
UridinaSigmaU375025 mg/mL in etanolo, concentrazione di lavoro: 0,25 μ g/mL.
Estratto di lievitoVWRDF0127-08
NameCompany Catalog NumberComments
Strains
E.coli CJ236New England BiolabsE4141Genotipo: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Utilizzato per la preparazione di dU-ssDNA.
E.coli SS320Lucigen60512Genotipo: [F'proAB+lacIq lacZΔ M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ (araABC-leu)7679 e Delta; lacX74 galUgalK rpsL thi. Ottimizzato per l'elettroporazione ad alta efficienza e la produzione di batteriofagi filamentosi.
M13KO7New England BiolabsN0315S
NomeAzienda Numero di catalogoComments
>Equipment
0.2-cm gap electroporation cuvettaBTX
96-pozzetto 2mL Piastre a pozzetti profondiFisher278743
96 pozzetti Maxisorppiastre Nunc151759
Flaconi deflettoriCorning
Centrifuga da bancoEppendorf5811000096
Flaconi per centrifugaNalgene
ECM-630 ElettroporatoreBTX
Magnetic ancoretteNalgene
Thermo Fisher centrifugaFisher
Agitatore ad alta velocitàTAITEKMBR-034P
Agitatore per micropiastreQILINBEIERQB-9002
Gestore di liquidi per 96 e 384 pozzettiRAININ
Pipetta multicanaleRAININE4XLS
Amicon concentratoreMerckUFC803096

Riferimenti

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