Vi proponiamo un protocollo di espansione delle cellule su microcarriers macroporosa e loro uso come sistema di consegna in un bioreattore di perfusione per inizializzare una matrice di tessuto decellularizzati. Abbiamo anche diverse tecniche per determinare la proliferazione delle cellule e l'attuabilità delle cellule coltivate su microcarriers. Inoltre, dimostriamo la funzionalità delle cellule dopo le culture di bioreattore.
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Articolo metodologico
Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ingegneria tissutale è un settore promettente, focalizzato sullo sviluppo di soluzioni per la crescente domanda su tessuti e organi in relazione alle finalità di trapianto. Il processo per generare tali tessuti è complesso e comprende un'appropriata combinazione di tipi cellulari specifici, impalcature e stimoli fisici o biochimici per guidare la crescita delle cellule e differenziazione. Microcarriers rappresentano uno strumento attraente per espandere le cellule in un microambiente tridimensionale (3D), poiché forniscono maggiore superficie--rapporti di volume e imitare più da vicino la situazione in vivo rispetto ai metodi tradizionali bidimensionali. Il sistema vascolare, approvvigionamento di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule e per garantire la rimozione dei rifiuti, costituisce un elemento importante quando generazione progettato tessuti. Infatti, maggior parte dei costrutti non riuscire dopo essere impiantati a causa della mancanza di supporto vascolare. In questo studio, presentiamo un protocollo per l'espansione delle cellule endoteliali su microcarriers basati su collagene ricombinante in condizioni dinamiche in boccetta spinner e bioreattori e spieghiamo come determinare in questa vitalità cellulare impostazione e funzionalità. Inoltre, proponiamo un metodo per la consegna delle cellule per scopi di vascolarizzazione senza passaggi aggiuntivi distacco necessari. Inoltre, mettiamo a disposizione una strategia per valutare la vascolarizzazione delle cellule potenziale in un bioreattore di aspersione su una matrice biologica decellularizzato. Noi crediamo che l'uso dei metodi presentati potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie basate sulle cellule per una vasta gamma di applicazioni nella pratica clinica di ingegneria tissutale.
Introduzione
Un problema generale in applicazioni di ingegneria del tessuto è di produrre una massa elevata delle cellule con il fenotipo di differenziazione corretta nella posizione di bisogno. L'applicazione di microcarriers per affrontare questo problema iniziato nel 1967 con sempre maggiore importanza fino ad oggi nei campi come ingegneria tissutale ortopedici per generazione su larga scala di pelle, ossa, cartilagine e tendini1. Essi consentono la movimentazione di culture aderente in modo simile a quello di sospensione culture2 espandendo cellule su substrati di Microscala tridimensionale (3D). Quindi le cellule esperienza un a....
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Protocollo
hBMSCs sono stati isolati dalla testa del femore di pazienti di osteoartrite che subiscono la chirurgia di sostituzione della testina del femore. La procedura è stata eseguita sotto l'approvazione del comitato etico locale dell'Università di Wuerzburg e consenso informato dei pazienti. Cellule endoteliali microvascolari primarie sono state isolate da biopsie di prepuzio dei donatori giovanile. Loro in qualità di rappresentante legale fornito pieno consenso informato per iscritto. Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale dell'Università di Wuerzburg (votazione 182/10).
1. isolamento di hBMSCs e HDMECs
- Derivate da midol....
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Risultati
Come mostrato in Figura 1A, abbiamo ottenuto elevato numero di cellule vitali su microcarriers la RCP dopo 7 giorni di cultura, determinato dalla macchiatura live/dead. Tali risultati sono stati confermati da analisi di SEM, in cui sono stati osservati microcarriers completamente colonizzata intorno i pori, parzialmente surclassando li (Figura 1B). D'altra parte, gli esperimenti in cui le cellule non sono state seminate in modo u.......
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Discussione
Uno degli obiettivi principale di microcarrier è l'espansione di cellule pur mantenendo la loro differenziazione al fine di fornire le cellule al posto del bisogno. Il metodo rappresentato introdurre RCP microcarriers dove le cellule erano in grado di allegare, proliferare e colonizzare il microcarriers con densità elevata delle cellule. Ciò è stata osservata da live/dead colorazione, in cui oltre il 90% delle cellule vitali sono stati rilevati mentre solo poche cellule morte sono state ottenute dopo 7 giorni di culture .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dall'Unione europea settimo quadro programma FP7/2007-2013 sotto accordo di finanziamento n ° 607051 (BIO-ispirare). Ringraziamo Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm Manufacturing Europe B.V., per l'assistenza tecnica durante la produzione di RCP e Werner Stracke dall'Istituto Fraunhofer per silicato ricerca ISC, per assistenza con l'analisi di SEM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4',6-Diamidino-2-fenilidridicloridrato (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acido acetico 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Bilancia analitica Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbato-2-fosfato | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreattore | Cattedra di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa, Wuerzburg, Germania | ||
| Microscopio a campo chiaro Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Provette per centrifuga (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Soluzione di collagene R 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Sigma-Aldrich | D8537 | Modificato, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio |
| Eosina 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Etanolo 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | denaturato |
| (FCS) | Bio& VEDI FCS | . ADD.0500 | non inattivato a caldo |
| BZ-9000 | Keyence | ||
| Ematossilina | Morfito | 10231.01000 | |
| Esametildisilazano | Sigma-Aldrich | 440191 | grado di reagente, ≥ 99% |
| Incubatore per bioreattore | Cattedra di Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa, Wuerzburg, Germania | ||
| di Doppia Colorazione a Cellule Vive/Morte | Fluka | 04511KT-F | |
| Piastra di agitazione magnetica | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | Lettore di micropiastre 10X |
Tecan Infinite M200 | Tecan | ||
| Ago 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papaina da lattice di papaya | Sigma-Aldrich | P4762 | polvere liofilizzata, ≥ 10 unità/mg di proteina |
| Paraffina | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillina/Streptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pompa peristaltica | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsKit per il dosaggio del DNA | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Microscopio elettronico a scansione Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Soluzione di idrossido di sodio 1,0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Firacci per spinner (25 mL) | Siringa Wheaton | 356879 | |
| 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Fiasche per colture tissutali (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0,4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
Riferimenti
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods ....
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Ristampe e permessi
