Articolo metodologico

Metodi di consegna orale RNA double-stranded per indurre RNAi nel floema e insetti Pentatomomorfi pianta-sap-alimentazione

DOI:

10.3791/57390

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4 maggio 2018

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1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

In questo articolo

Sommario

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In questo articolo vengono illustrate le tecniche romanzo sviluppati per la consegna orale del RNA double-stranded (dsRNA) attraverso i tessuti vascolari delle piante per interferenza del RNA (RNAi) in sap floema insetti d'alimentazione.

Abstract

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Floema e pianta sap alimentazione insetti invadono l'integrità delle colture e frutti per recuperare le sostanze nutrienti, nel processo di danneggiare le colture alimentari. Gli insetti Pentatomomorfi rappresentano un certo numero di parassiti economicamente sostanziali delle piante che causano danni alle colture di alimentazione su sap del floema. Il marrone marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) e l'Asian psyllid agrumi (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) sono parassiti di insetto ematofago introdotti in Nord America, dove essi sono un parassita agricolo dilagante di agrumi, riga e colture di base e specialità di alto valore, come pure un parassita di fastidio quando raccolgono al chiuso. Resistenza agli insetticidi in molte specie ha portato allo sviluppo di metodi alternativi di strategie di lotta. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediata RNA interference (RNAi) è un meccanismo per studi di genomica funzionali che ha applicazioni potenziali come uno strumento per la gestione dei parassiti di insetto il silenziamento genico. DsRNA esogenicamente sintetizzato o short interfering RNA (siRNA) può innescare altamente efficiente del silenziamento genico attraverso la degradazione del RNA endogeno, che è omologo a quello presentato. Uso efficace e ambientale di RNAi come biopesticidi molecolare per biocontrollo di insetti Pentatomomorfi richiede la consegna in vivo di RNAds attraverso l'alimentazione. Qui dimostriamo metodi per la consegna di dsRNA agli insetti: caricamento di dsRNA in fagiolini per immersione e assorbimento di gene-specific del dsRNA con consegna orale attraverso l'ingestione. Inoltre abbiamo delineato non transgenica pianta approcci di recapito utilizzando spray fogliare, inzuppare di radice, iniezioni di tronco così come granuli di argilla, che può essere essenziale per il rilascio prolungato di dsRNA. Consegna efficiente di dsRNA ingerito per via orale è stata confermata come un dosaggio efficace per indurre una diminuzione significativa nell'espressione del gene targeting, come ormone giovanile l'acido O-metiltransferasi (JHAMT) e vitellogenina (Vg). Questi metodi innovativi rappresentano strategie per la consegna di dsRNA da usare nella protezione delle colture e superare le sfide ambientali per la gestione dei parassiti.

Introduzione

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Gli insetti Pentatomomorfi comprendono alcuni dei parassiti economicamente più significativi di agriculturebecause delle loro capacità per conseguire crescita demografica elevata e diffondere malattie delle piante. BMSB, H. halys Stål, è un parassita invasivo che è stato accidentalmente introdotto nell'emisfero occidentale a Allentown, in Pennsylvania, dall'Asia (Cina, Taiwan, Corea e Giappone) con il primo avvistamento segnalato nel 19961. Sin dalla sua introduzione, BMSB è stato rilevato in 43 Stati, con le popolazioni più alte nel Mid-Atlantic (DE, MD, PA, NJ, VA e WV), così come in Canada e in Europa e rappresenta una potenziale mi....

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Protocollo

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1. BMSB allevamento

  1. Posteriore BMSB insetti secondo la pratica di laboratorio standard e precedentemente descritti63.
  2. Sollevare gli insetti ACP (d. citri) su Citrus macrophylla in una serra (22 ° C) e luce naturale. Uso adulto ACP, a circa 5-7 giorni post eclosion.

2. selezione di regioni del Gene e la sintesi In Vitro di dsRNA

  1. Selezionare geni specifici per BMSB da precedentemente pubblicati transcriptome profili32.
  2. Garantire le regioni di interesse selezionato variano tra 200 e 500 paia di basi.
  3. Eseguire la re....

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Risultati

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Consegna di verdure dsRNA mediata attraverso alimentazione in BMSB 4th instar ninfe è stato testato per lo sviluppo di biopesticidi molecolare mediante RNAi per parassiti di insetto invasivi. BMSBs feed utilizzando loro stiletti aghiformi da un meccanismo conosciuto come lacerare e lavare, causando notevoli danni alle colture. Fagioli verdi organici snelli, p. vulgaris L., sono stati utilizzati per verificare se le sostanze nutrienti o dsRNA poteva essere recapitata

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Discussione

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RNAi ha dimostrato di essere uno strumento importante per esplorare la funzione biologica del gene e regolazione, con un grande potenziale per essere utilizzato per la gestione dei parassiti di insetto19,68,69,70, 71. il design e la scelta di un appropriato geni per silenziamento in una determinata specie di insetti e il metodo di consegna della dsRNA(s) corr.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono con gratitudine Donald Weber e Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) per fornire BMSB e HB per la sperimentazione e mantenere le colonie; e Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) e Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) per manutenzione di Colonia, preparazione dei campioni e le analisi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BMSB (H. halys) insetti USDA
ACP (D. citri) insetti Fagiolini biologici USDA
N/A
Piante di agrumiSoluzione di
J.T. Baker
colorante alimentare verdeMcCormick & Co., Inc
Camere Thermo Forma Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Cultura)Sigma
Primers IDT DNA
SensiMix SYBRBioline
qPCR ABI 7500Applied Biosystems 
Flacone sprayN/A
ParafilmAmerican Can Company
TaKaRa Ex TaqClontech
QIAquickQiagen
ipoclorito di sodio USDA

Riferimenti

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  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys i....

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Carico di fagioliniirrorazione fogliareiniezione nel troncodrenaggio del suologranuli di argillaanalisi RT PCR

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