Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

Summary

Gli ioni del potassio contribuiscono per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e concentrazione extracellulare di K⁺ è un regolatore fondamentale dell'eccitabilità cellulare. Descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K⁺-selettivi microelettrodi. Utilizzando tali elettrodi consente la misurazione delle dinamiche di concentrazione K⁺ elettricamente evocate nelle fette hippocampal adulti.

Abstract

Gli ioni potassio contribuiscono in modo significativo per il potenziale di membrana di riposo delle cellule e, di conseguenza, la concentrazione extracellulare di K⁺ è un regolatore cruciale dell'eccitabilità delle cellule. Alterato le concentrazioni extracellulari di K⁺ effetto l'eccitabilità cellulare e potenziali di membrana riposo spostando gli equilibri tra stati chiusi, aperti e inattivati per canali ionici voltaggio-dipendenti che sono alla base di potenziale di azione Iniziazione e conduzione. Quindi, è prezioso per misurare direttamente extracellulare K⁺ dinamiche in salute e stati malati. Qui, descriviamo come fare, calibrare e utilizzare monopolare K⁺-selettivi microelettrodi. Li abbiamo distribuito in fette di cervello hippocampal adulto per misurare elettricamente evocate K⁺ concentrazione dinamica. L'uso giudizioso di tali elettrodi è una parte importante di tool-kit necessari per valutare i meccanismi biofisici e cellulari che controllano le concentrazioni extracellulari di K⁺ nel sistema nervoso.

Introduction

Concentrazioni di ioni di potassio sono strettamente regolati nel cervello, e le loro fluttuazioni esercitano una potente influenza sul potenziale di membrana di riposo di tutte le cellule. Alla luce di questi contributi critici, un obiettivo importante di biologia è determinare i meccanismi biofisici e cellulari che vengono utilizzati per regolare strettamente la concentrazione di K⁺ nello spazio extracellulare in vari organi del corpo^{1 , 2}. un requisito importante in questi studi è la capacità di misurare le concentrazioni di K⁺ con precisione. Anche se molti componenti che contribuisco....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l'Istituto nazionale di guida alla salute per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di ricerca degli animali del cancelliere presso la University of California, Los Angeles. Tutti i topi sono stati alloggiati con cibo e acqua disponibile ad libitum in un ambiente di luce-buio di 12 h. Tutti gli animali erano sani senza evidenti modifiche comportamentali, non sono stati coinvolti in studi precedenti e sono stati sacrificati durante il ciclo di luce. Dati per gli esperimenti sono stati raccolti da topi adulti (6-8 settimane di vita per tutti gli esp....

Results

Per la determinazione selettiva di extracellulare K⁺, abbiamo preparato microelettrodi iono-selettivi, rivestiti con uno strato idrofobico attraverso silanizzazione delle pipette di vetro borosilicato pulito (Figura 1A). Questo rivestimento permette lo ionoforo K⁺ contenente valinomicina per riposare sulla punta dell'elettrodo e consentire solo K⁺ di flusso attraverso una stretta apertura presso la punta dell'elettrodo (

Discussion

Il metodo che descriviamo qui ci ha permesso di valutare K⁺ dinamiche in risposta alla stimolazione elettrica dei collaterals Schaffer in fettine ippocampali acute da topi adulti. Il nostro metodo di preparazione K⁺ microelettrodi selettiva dello ione è simile a precedenti procedure descritte^12,13,14,15. Tuttavia, questo metodo presenta vantaggi rispetto alle configurazion.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: Topi consanguinei C57BL/6NTac	Taconic	Stock#B6
Microscopio	Olympus	BX51
Estrattore di elettrodi	Sutter	P-97
Ag/AgCl pellet macinato	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Puntale personalizzata microfil 28G	Strumenti di precisione mondiali	CMF28G
Asta di tungsteno	A-M Systems	716000
Elettrodi stimolanti bipolari	FHC	MX21XEW(T01)
Isolatore di stimolo	Strumenti di precisione mondiali	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Pipette in vetro borosilicato World	precision instruments	1B150-4
Scheda da A a D	Digidata 1322A	Axon Instruments
Amplificatore di segnale	Multiclamp 700A o 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Cloruro di sodio	Sigma	S5886
Cloruro di potassio	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Bicarbonato di sodio	Sigma	S5761
Fosfato di sodio monobasico	Sigma	S0751
D-glucosio	Sigma	G7528
Cloruro di calcio	Sigma	21108
Cloruro di magnesio	Sigma	M8266
valinomicina	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimetil-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassio tetrakis (4-clorofenil)borato	Sigma	60591-100mg
5% dimetildiclorosilano in eptano	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Azienda chimica	14964
Acido cloridrico	Sigma	H1758-500mL
Saccarosio	Sigma	S9378-5kg
Micromanipolatore per pipette	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Obiettivo	Olympus	PlanAPO 10xW