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Articolo metodologico

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

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DOI:

10.3791/57870

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1 settembre 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, CRCINA, 2Immunotherapy, Graft, Oncology, LabEx IGO, 3Hopital de Nantes, Hotel Dieu

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Abstract

Multiforme di glioblastoma (GBM), il cancro primario del cervello più frequenti e più aggressivo negli adulti, è generalmente associato con una prognosi difficile, e sono state proposte terapie efficienti scarse nell'ultimo decennio. Tra i candidati promettenti per la progettazione di nuove strategie terapeutiche, immunoterapie cellulari sono stati designati per eliminare altamente invasive e chemio-radioresistenti cellule del tumore, probabilmente coinvolti in una ricaduta rapida e mortale di questo cancro. Così, somministrazioni di trapianto allogeneic GBM-reattiva effettori delle cellule immuni quali linfociti T Vϒ9Vδ2 umani, in prossimità del tumore sarebbe rappresenta un'opportunità unica per fornire efficiente e altamente concentrato agenti terapeutici direttamente nella sito di tumori maligni del cervello. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept preclinici per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di questi cellulari immunoterapie che si basano sulle iniezioni di stereotactic dei linfociti umani allogenici all'interno letti tumore intrabrain.

Introduzione

GBM (che grado astrocitoma IV), è il più frequente e aggressivo cancro cerebrali primari negli adulti. Nonostante i trattamenti aggressivi che combinano la chirurgia e la radio-chemioterapia, GBM rimane associato con una prognosi estremamente infausta (sopravvivenza mediana di 14,6 mesi e un 2-anno-mortalità > 73%)1. Questo evidenzia che pochi progressi terapeutici efficienti siano stati convalidati sopra gli ultimi dieci anni2. Tra i candidati per la progettazione delle più efficaci strategie terapeutiche3,4,5, immunoterapie6 sono attualmente esplorati per tenere traccia ed eliminare altamente tumore invasivo e radio/chemio-resistenti cellule, ritenuto sospettate per il loro contributo chiave a tumore rapido e fatale ricaduta7. Vari potenziali bersagli immunologici sono stati individuati e proposti per immunoterapie, che coinvolgano naturale o modificate αβ o linfociti T ϒδ quali antigeni tumorali specifici GBM o indotta da stress molecole8,9, 10. La possibilità di amministrare gli GBM-reattiva effettori delle cellule immuni selezionati rappresenta un'opportunità unica per fornire elevate quantità di linfociti effettori direttamente nel sito di malignità residua. Per supportare questa strategia, abbiamo recentemente dimostrato che modelli basati su topi immunodeficienti xenotrapianti GBM umani primari di orthotopic fedelmente ricapitolano lo sviluppo dei tumori cerebrali in pazienti GBM9,11. Inoltre, questi modelli sono stati utilizzati per dimostrare l'efficacia antitumorale forte dei linfociti Vϒ9Vδ2T passivamente trasferiti umani allogenici.

Questo protocollo descrive la procedura sperimentale critica per raggiungere immunoterapie stereotactic dei tumori cerebrali, come GBM, basato sul trasferimento adottivo di linfociti T allogenici. Illustrato nell'articolo: (i) l'amplificazione dei linfociti terapeutici allogenici T effettori immuni, quali linfociti umani di Vϒ9Vδ2T; (ii) la preparazione di questi linfociti T effettori per iniezione; (iii) la procedura per l'amministrazione stereotactic all'interno del cervello, vicino al tumore. Questo articolo fornisce inoltre la comprensione del comportamento di questi effettori cellulari dopo iniezione stereotactic.

L'approccio terapeutico qui presentata si basa sull'iniezione di 20 x 106 cellule effettrici per dose per ogni mouse immunodeficienti di cervello del tumore-cuscinetto. Un passo di espansione iniziale in vitro è necessaria per produrre grandi quantità di cellule del sistema immunitario. Pertanto, espansioni delle cellule aspecifiche sono effettuati usando la fitoemagglutinina (PHA-L) e irradiato le cellule allogeniche alimentatore: cellule mononucleari sangue periferico (PBMCs) da donatori sani e delle cellule B-linfoblastoidi Epstein Barr Virus EBV-trasformati linee (BLCLs), derivati da PBMCs di infezione in vitro con EBV-contenente cultura surnatante dalla linea cellulare Marmoset B95-8, in presenza di 1 µ g/mL ciclosporina-A.

Le cellule immunitarie effettrici reattive GBM sono rispetto e selezionate da in vitro saggi9. Queste cellule effettrici sono attivate e amplificato mediante protocolli standard, secondo la loro natura (ad es., umano Vγ9Vδ2 T linfociti9 o umano anti-herpes virus αβ T linfociti12) con una purezza minima di > 80%, come ordinariamente controllato dall'analisi cytometric. La procedura di espansione delle cellule riportata di seguito si applica a varie sottopopolazioni di linfociti umani.

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Protocollo

Il seguente procedura che coinvolge animali soggetti è stato eseguito secondo le linee guida istituzionali (contratto n. 00186.02; comitato etico regionale della Pays de la Loire [Francia]). PBMCs umano sono stati isolati da sangue raccolto da donatori sani informati (Etablissement Français du Sang Nantes, Francia). Tutti i passaggi sono eseguiti in condizioni di sterilità.

1. non-specifico espansione dei linfociti T citotossici effettori

  1. Preparare e irradiare le cellule di alimentatore a 35 Gy. Per la stimolazione di 2 x 105 - 4 x 105 cellule effettrici, preparare 10 x 106 PBMCs e 1 x 106 BLCLs da tre distinti donatori sani.
  2. Risospendere le cellule di alimentatore sia cellule effettrici in 15 mL di RPMI completato con 10% FCS inattivati al calore, di 2 mM L-Glutammina, di penicillina (100 UI/mL) e di streptomicina (0,1 µ g/mL) e del-2 ricombinante di 300 IU/mL.
  3. Aggiungere PHA-L ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL, mescolare accuratamente e distribuire 150 µ l della sospensione delle cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti con fondo U.
  4. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 in atmosfera umidificata.
  5. Controllare ogni giorno la piastra fino a grandi cellule ciuffi forma nei pozzetti cultura (~ giorno 7).
  6. Trasferire le cellule in un matraccio di cultura a 1 x 106 cellule/mL nel terreno di coltura fresco.
  7. Determinare il numero totale delle cellule contando (2 volte alla settimana) e mantenerli a 1 x 106 cellule/mL nel terreno di coltura fresco.
    Nota: Le cellule immunitarie effettrici dovrebbero essere pronte per la somministrazione terapeutica presso lo stato di riposo (di solito 3 settimane dopo stimolo di amplificazione iniziale). La purezza e la reattività di queste cellule effettrici dovrebbe essere controllati prima in vivo iniezioni (ad es., con saggi in vitro ).

2. preparazione di cellule effettrici pre-operatoria

  1. Dopo aver controllato il conteggio delle cellule effettrici, raccogliere le cellule effettrici in un tubo da 50 mL mediante centrifugazione (300 x g per 5 min).
    Nota: Per compensare eventuali perdite, preparare un eccesso di cellule (ad es., 50 x 106).
  2. Con attenzione rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 15 mL di PBS sterile e centrifugare per 5 minuti a 300 x g per eseguire il lavaggio.
  3. Attentamente e completamente rimuovere il supernatante e quindi risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS sterile.
  4. Trasferire le cellule sedimento in una microprovetta 1,5 mL per centrifugazione a 300 x g per 5 min.
  5. Attentamente e completamente eliminare il surnatante pipettando lentamente.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 8 µ l di PBS sterile per topo.
    Nota: Questo è un passo fondamentale.
  7. Misurare il volume della sospensione cellulare utilizzando una micropipetta. Se necessario, aggiungere PBS sterile (20 x 106 cellule in 15 µ l di PBS per dose) e mescolare con cura.
  8. Controllare, usando una micropipetta, che il volume finale del mouse è tra 15 e 20 μL (imperativamente < 20 µ l).
  9. Mantenere le cellule su ghiaccio fino a iniezione stereotactic.
    Nota: più di 3-h punti temporali non sono stati testati.

3. stereotassica iniezione

  1. Installazione dell'apparecchio
    1. Assemblare e calibrare una piccola cornice stereotassica animale secondo le istruzioni del produttore per garantire la precisione delle iniezioni intracraniche (ad es., siringa dimensioni, volume desiderato e tasso di iniezione).
      Nota: Un tasso di infusione lenta è consigliabile (cioè, 2-3 µ l/min).
    2. Installare il materiale sotto un armadietto di sicurezza microbica (MSC) per mantenere la sterilità degli strumenti e per proteggere i topi dalle infezioni.
      Nota: posto "blocchi isotermici" in un bagno di acqua a 37 ° C. Questo sistema limita l'ipotermia dei topi durante l'intervento chirurgico. Termofori, che sono necessari per la cura post-operatoria, deve essere usato durante il monitoraggio continuo della temperatura.
  2. Preparazione pre-operatoria di animale
    1. Anestetizzare un mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) a 10 µ l/g di peso corporeo del mouse.
    2. Eseguire un test di pizzico di punta per garantire la completa anestesia e analgesia dell'animale.
      Nota: Ogni movimento è un'indicazione di non-profonda analgesia e, in questo caso, un paio di minuti è necessari prima di ripetere l'operazione.
    3. Una volta che il mouse è adeguatamente anestetizzato, usare le forbici per rimuovere il pelo dal sito chirurgico (tra le due orecchie, fino al naso).
  3. Preparazione pre-operatoria delle cellule
    1. Attentamente risospendere le cellule con una pipetta (più volte) prima di ogni iniezione per prevenire qualsiasi cella che ragruppa.
    2. Disegnare con attenzione il volume di sospensione cellulare richiesto (15-20 µ l) nella microsiringa 22-G per evitare l'aspirazione di bolle.
      Nota: Questo passaggio cella-caricamento nella microsiringa è importante ridurre al minimo le variazioni nei volumi iniettati. Ricaricare le cellule per ogni iniezione individuale tra procedure per prevenire qualsiasi cella che ragruppa e garantire un numero pari di somministrazione di cellule effettrici nella coorte.
    3. Quindi, posizionare la siringa nella pompa a siringa adattato.
  4. Assistenza processuale
    1. Disinfettare il sito chirurgico con tamponi imbevuti di soluzione al 5% povidone-iodio almeno 3 x.
    2. Posizionare una pomata oftalmica lubrificante negli occhi del mouse per evitare qualsiasi asciugatura delle cornee.
    3. Posizione del mouse anestetizzato sulla cornice stereotassica, su un blocco isotermico caldo coperto con un involucro di plastica sterile per mantenere la temperatura del mouse durante la chirurgia e limitare la mortalità.
      Nota: Il mouse naso e denti dovrebbero essere opportunamente posizionati sopra la barra di dente, per garantire un flusso respiratorio adeguato durante la procedura.
    4. Una volta che il mouse è posizionato sopra la barra di dente, stringere le barre di orecchio saldamente sotto le orecchie del mouse per immobilizzare la testa.
      Nota: Fare attenzione a non danneggiare i timpani o compromettere la respirazione.
    5. Fare un'incisione sagittale della pelle di 1-2 cm del midline con forbici sterili lungo la parte superiore del cranio dall'anteriore al posteriore per esporre il cranio.
    6. Identificare l'intersezione delle suture sagittali e coronale (Bregma) per servire come punti di riferimento per la localizzazione stereotassica prima dell'iniezione (illustrato nella Figura 1).
    7. Posto la microsiringa sopra questo punto.
    8. Spostare la microsiringa laterale di destra 2 e 0,5 mm anteriore del Bregma.
    9. Utilizzando un microdrill, fare un piccolo foro nel cranio con una punta sterile alle coordinate predeterminate. Fare attenzione a rimanere superficiale al fine di evitare qualsiasi lesione traumatica del cervello.
      Nota: Nel presente protocollo, le cellule immuni sono state iniettate all'interno di un tumore stabilito (una settimana dopo l'iniezione delle cellule del tumore). La pelle dovrebbe essere riaperta (cicatrice) e l'iniezione viene eseguita presso le stesse coordinate usate per l'impianto delle cellule del tumore (il foro è generalmente ancora presento fino a 2 settimane dopo l'iniezione). Le coordinate sono state selezionate per l'iniezione di cellule del tumore ed effettrici nel parenchima cerebrale13,14.
  5. Iniezione di cellule immunitarie effettrici
    1. Inserire con cautela la microsiringa nel foro e, muovendo lentamente, in avanti l'ago 3 giù nella dura e poi indietro 0,5 mm ad una profondità finale di 2,5 mm prima di iniettare le cellule effettrici.
    2. Eseguire l'iniezione di cellule effettrici a 2-3 µ l/min e monitorare i topi lungo tutto il tempo di iniezione.
    3. Una volta completata l'iniezione, ritirare l'ago per solo 1 mm e conservare la microsiringa in luogo per un ulteriore minuto prima lentamente ritirando completamente la microsiringa, per evitare eventuali perdite dalla sede di infusione.
      Nota: Dopo la rimozione dell'animale dal dispositivo stereotassica, pulire immediatamente l'apparecchiatura di iniezione per i prossimi esperimenti.
  6. Assistenza post-operatoria e follow-up del mouse
    1. Rimuovere l'animale dalla cornice stereotassica e immediatamente applicare soluzione 5% povidone-iodio nel sito di incisione e chiudere la pelle con una sutura chirurgica appropriata.
    2. Applicare gel di lidocaina 2% direttamente sulla ferita e 0.15 µ g/g di buprenorfina per amministrare un'iniezione sottocutanea per analgesia post-operatoria.
    3. Posto indietro il mouse anestetizzato per sua gabbia sopra un rilievo di riscaldamento impostato a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea di un mouse appropriato ed evitare qualsiasi ipotermia.
      Nota: Involucro separato non è necessario.
    4. Monitorare il mouse fino a quando non è completamente recuperato dall'anestesia e trasferirlo in una camera di alloggiamento.
      Nota: Ad oggi, questo protocollo è ben supportato come poche complicazioni impreviste si sono verificati (< 5% dei topi iniettati).
    5. Ogni giorno monitorare i topi e li eutanasia quando vengono osservati eventuali segni di salute in declino (ad es., postura ricurva, mobilità ridotta, prostrazione o perdita di peso significativa [≥ 15%]).

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Risultati

Questo studio descrive la strategia del trasferimento adottivo di cellule effettrici immuni cellulari all'interno del cervello di topi portatori di tumore, basato su stereotactic iniezioni eseguite direttamente all'interno della base del tumore.

Per ridurre al minimo qualsiasi rischio di ferita di cervello connessa con un volume di grande iniezione, la sospensione di cellule effettrici deve essere concentrato (20 x 106

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Discussione

Un trasferimento adottivo di selezionato nativo o cellule effettrici immuni ingegnerizzati rappresenta un promettente approccio per trattare efficacemente i tumori, quali i tumori al cervello infiltrativo, avendo cura di limitare le reattività contro le cellule non trasformate15, 16,17,18. Tuttavia, il sistema nervoso centrale, che comprende il cervello, ha una particolare condizione immune, i...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il personale dell'ospedale universitario animale impianto (UTE) di Nantes per zootecnia e cura, il cellulare e tessutale, funzione di memoria dell'Università di Nantes (MicroPICell) di imaging per l'imaging e l'impianto di citometria (Cytocell) da Nantes per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa n #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) e il Consorzio europeo Transcan2 di ERA-Net (Immunoglio). La squadra è finanziata dalla Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Questo lavoro è stato realizzato nel contesto di LabEX IGO e i programmi di IHU-Cesti, supportato con la nazionale Ricerca agenzia Investissements d'Avenir tramite i programmi ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, rispettivamente. Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e della regione Pays de la Loire. Gli autori ringraziano Chirine Rafia per fornire aiuto nella correzione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PBMCda 3 diversi donatori sani
BLCLda 3 diversi donatori
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)Gibco31870-025
FCSDutscherS1810-500
L-glutamminaGibco25030-024
penicillina/streptomicinaGibco15140-122
IL-2Novartisproleuchina
PHA-LSigmaL4144
Telaio stereotassicoStoelting Co.51600
Adattatore per mouse per fotogramma stereotassico   Stoelting Co.51624
iniettore pompa microsiringa WPIUMP3-4
Siringa NanoFilWPINF34BV-2
NSG topiCharles RiverNSGSSFE07S
KetaminaMerialImalg. ne 1000
XilazinaBayerRompur 2%
ForbiciWPI201758
PinzeWPI501215
OmniDrill 115/230VWPI503598
Vicryl 4-0EthiconVCP397H
XilocainaAstrazeneca3634461

Riferimenti

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