Articolo metodologico

In Situ Misurazione e la correlazione di densità delle cellule ed emissione di luce di batteri bioluminescenti

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DOI:

10.3791/57881

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28 giugno 2018

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1Institute of Biochemistry, Graz University of Technology

In questo articolo

Sommario

I batteri bioluminescenti regolano la produzione di luce attraverso una varietà di meccanismi, come quorum sensing. Questo nuovo metodo consente l'indagine in situ della bioluminescenza e la correlazione di emissione luminosa di densità delle cellule. Un artificiale bioluminescenti Escherichia coli sistema permette la caratterizzazione di operoni lux , Lux proteine e loro interazione.

Abstract

C'è un numero considerevole di specie batteriche in grado di emettere luce. Tutti condividono lo stessa cluster genico, vale a dire l'operone lux . Nonostante questa somiglianza, questi batteri mostrano variazioni estreme di caratteristiche come comportamento di sviluppo, l'intensità dell'emissione luminosa o regolamento della bioluminescenza. Il metodo presentato qui è un saggio di nuova concezione che combina la registrazione di crescita delle cellule e l'intensità di emissione di luce bioluminescente nel tempo utilizzando un lettore di piastra. La conseguente crescita e le caratteristiche di emissione luminosa possono essere collegate alle funzioni importanti del ceppo batterico rispettivo, come ' quorum sensing regolamento. La coltivazione di una gamma di batteri bioluminescenti richiede un supporto specifico (ad es., mezzo di acqua di mare artificiale) e definito le temperature. La facile da maneggiare, non bioluminescenti standard-ricerca batterio Escherichia coli (Escherichia coli), d'altra parte, può essere coltivata a buon mercato in elevate quantità in scala di laboratorio. Sfruttare la Escherichia coli introducendo un plasmide contenente l' intero lux operone può semplificare le condizioni sperimentali e inoltre apre molte possibilità per le future applicazioni. L'espressione di tutti i geni di lux utilizzando un ceppo di e. coli espressione è stata realizzata tramite la costruzione di un plasmide di espressione tramite clonazione di Gibson e l'inserimento di quattro frammenti contenenti sette geni lux e tre geni di costola di l'operone lux-nervatura in un vettore di pET28a. Espressione genica di e. coli basato lux può essere indotta e controllato tramite aggiunta di isopropile-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) conseguente bioluminescenti Escherichia coli cellule. I vantaggi di questo sistema sono per evitare ' quorum sensing regolamento restrizioni e composizioni complesse medie insieme a condizioni di crescita non standard, come definito temperature. Questo sistema consente l'analisi dei geni di lux e la loro interazione, mediante l'esclusione del gene del rispettivo dall'operone lux , o anche aggiunta di nuovi geni, lo scambio di geni da un ceppo batterico luxAB da un altro, o analisi dei complessi della proteina, ad esempio luxCDE.

Introduzione

L'emissione di luce da organismi viventi (bioluminescenza) è un processo affascinante trovato in batteri, funghi, insetti, nematodi, pesci e calamari1. Emissione di luce bioluminescente emerge da una reazione di chemiluminescenza in cui energia chimica (parzialmente) si trasforma in energia luminosa ("luce fredda"). In batteri bioluminescenti, heterodimeric enzima luciferasi catalizza la monooxygenation della lunga catena, aldeidi alifatiche, come tetradecanal, agli acidi corrispondenti accompagnata da emissione di luce con un massimo a 490 nm2, 3.

Diagramma delle reazioni biochimiche; sintesi della luce tramite luciferasi LuxAB; n=4,6,8,10; FMNH2+O2.
Figura 1 : Schema di reazione generale di luciferasi batterica. La luciferasi batterica (LuxAB) catalizza la monooxygenation della lunga catena di aldeidi (CH3(CH2)nCHO) utilizzando ridotto mononucleotide di flavin (FMNH2) e ossigeno molecolare (O2), producendo i prodotti a catena lunga acidi (CH3(CH2)nCOOH), flavina mononucleotide (FMN), acqua (H2O) e l'emissione di luce centrato a 490 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'energia rilasciata durante questa ossidazione provoca uno stato eccitato FMN-4a-idrossido, che serve come la luce che emettono luciferina4. Le proteine coinvolte nella batterica bioluminescenza, vale a dire LuxCDABEG, sono codificati dall'operone lux e sono altamente conservati nel corso di vari ceppi batterici2,5. I geni luxA e luxB codificare per la luciferasi heterodimeric; prodotti del gene di luxC, di luxDe di luxE sono componenti di una riduttasi di acido grasso complessa; e luxG codifica per una Flavina reduttasi6. Un numero di bioluminescenti sulfurei (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) portatori del gene di ulteriori LUF . È stato riferito che LUF è una proteina omodimerica che lega la flavina insolito derivato 6-(3'-(R)-miristil)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Sono stati identificati altri geni che sono responsabili per la sintesi di riboflavina (ad esempio, ribEBH) e inoltre sono stati segnalati geni regolatori, che svolgono un ruolo nel quorum regolamento rilevamento della bioluminescenza, soprattutto per del vibrione fischeri e Vibrio harveyi6,13. Nonostante l'ordine di gene altamente conservata, batteri bioluminescenti mostrano forti variazioni nelle caratteristiche come comportamento di sviluppo, l'intensità dell'emissione luminosa, o regolamento di bioluminescenza2,5,14 .

Molti modificati ceppi o plasmidi contenenti parti o interi lux operoni sono noti, sfruttando la bioluminescenza come sistemi reporter. Varie applicazioni ad esempio per determinare l'attività del promotore, monitoraggio di contaminazioni batteriche in ambiente o campioni di alimenti, bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), in vivo imaging delle infezioni negli organismi eucarioti, Pyrosequencing e così via sono stati stabiliti15,16,17. È interessante notare che, i tre più frequentemente utilizzati reporter bioluminescenti sistemi sono derivati da firefly nordamericano (Photinus pyralis), l'agente patogeno enterico di nematodi (Photorhabdus luminescens) e la viola di mare (Renilla reniformis). Nessuno di questi sistemi è di origine batterica, ma l'uso di geni di lux e operons dalle origini batteriche sta guadagnando più interesse per la ricerca applicata16. L'applicazione meno abbondante delle proteine di bioluminescenza da fonti batteriche è principalmente a causa della bassa stabilità e longevità dei batteri derivati luminescenti proteine che possono essere connesse al loro habitat marini. I batteri bioluminescenti degli habitat marini non sono coltivabili in condizioni di laboratorio standard. Questi batteri richiedono mezzi specifici di sviluppo e condizioni, quali artificiali mare acqua media e bassa crescita/temperature d'incubazione (ad es., 28 ° C).

Per semplificare il confronto delle caratteristiche di operone lux o singola lux geni di una gamma di differenti ceppi batterici bioluminescenti, un metodo per standardizzare l'analisi e l'espressione di operone lux è un prerequisito. Così, l'idea di integrare l'operone intero lux-nervatura il batterio Escherichia coli (Escherichia coli) di standard-ricerca emerse. Per questo scopo, Assemblea di Gibson si è rivelata uno strumento utile per integrare frammenti multipli lineari, sovrapposti nel vettore di uno espressione senza la necessità di siti di restrizione specifici. Questo metodo è adatto anche quando inserti di DNA sono troppo grandi (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operone size) per essere amplificato tramite PCR. Un operone lux può essere suddivisa in più frammenti sovrapposti, poi essere assemblati in plasmide un'espressione e infine la sequenza verificato prodotto di montaggio può essere trasformato direttamente in un appropriato Escherichia coli sistema per ad alto rendimento proteina espressione18,19,20. Oltre la facile trattare l'espressione genica di e. coli basato lux , un metodo semplice che combina la registrazione di crescita delle cellule e di emissione di luce bioluminescente è rimasto per essere stabilito. Il metodo qui descritto consente la misura in situ e la correlazione di densità delle cellule e di emissione di luce di batteri bioluminescenti.

L'analisi dei geni di lux e ordine operone lux e regolazione di vari batteri bioluminescenti con, da un lato, un artificiale bioluminescenti Escherichia coli sistema contenente l'operone intero lux-costola di P. mandapamensis 27561 e, da altro lato, un'analisi di lettore di piastra di nuova concezione che combina la registrazione in situ di densità delle cellule e di emissione di luce, aiuta ad per acquisire ulteriori informazioni sui vari sistemi batterici lux . Questa caratterizzazione fondamentale e confronto di luciferasi ed enzimi correlati può portare a alternative ai sistemi già affermati reporter con attività e una maggiore stabilità.

Protocollo

1. progettazione, preparazione e l'espressione di lux Operon in Escherichia coli

Nota: Vedi Tabella materiali per informazioni sul kit commerciali utilizzati in questa sezione.

  1. Per trasferire l'operone lux in Escherichia coli scegliere un vettore standard domestico con siti di restrizione appropriato e gene di resistenza agli antibiotici di interesse (ad es., pET28a; NcoI, XhoI, kanamicina).
  2. Progettare i frammenti e sovrapposizione degli iniettori per il montaggio di Gibson basato sulla sequenza del DNA di Photobacterium mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
  3. Impostare una reazione standard di PCR con gli iniettori progettati e il DNA genomico isolato di Photobacterium mandapamensis 27561 come modello (Vedi Materiale supplementare per primer e le condizioni).
    Nota: Isolamento di DNA genomic del ceppo batterico rispettivo migliora l'efficacia PCR.
  4. Purificare il prodotto PCR tramite purificazione spin-colonna.
  5. Eseguire una digestione di limitazione del vettore isolato pET28a con NcoI e XhoI a 37 ° C per 45 min.
  6. Purificare il vettore linearizzato e i frammenti PCR via agarosio gel elettroforesi e spin-colonna successiva purificazione.
  7. Determinare la concentrazione di DNA di ogni frammento e il vettore linearizzato e calcolare le quantità ottimale per l'assemblaggio secondo il protocollo20,21.
    Nota: L'efficacia dell'assembly dipende dalla dimensione del frammento e il numero e deve essere regolata a seconda protocollo20,21 del produttore.
  8. Dopo che unisce tutti i frammenti e il buffer in un tubo PCR, incubare la miscela di assemblaggio in una macchina PCR a 50 ° C per 1 h.
  9. Trasformare il prodotto vettoriale assemblato secondo i protocolli standard di trasformazione per la trasformazione di plasmide batterico di Escherichia coli in un appropriato Escherichia coli sistema per la replica di plasmide ad alto rendimento (ad es., Escherichia coli TOP10 o XL-1).
  10. Scegli colonie dalla piastra di trasformazione e striscia su nuove lastre per isolamento del DNA.
  11. Isolare il DNA del plasmide secondo protocolli standard.
  12. Per verificare il corretto assemblaggio del plasmide compresi tutti i frammenti, innanzitutto eseguire una PCR della Colonia secondo protocolli standard usando gli iniettori specifici per ogni frammento assemblato.
  13. Inoltre alla Colonia PCR ed elettroforesi del gel dell'agarosi successive, è possibile preparare tutti i vettori di montaggio isolato per il sequenziamento del DNA verificare il corretto assemblaggio e la sequenza del DNA.
  14. Trasformare il plasmide verificato secondo i protocolli standard di trasformazione per la trasformazione di plasmide batterico di Escherichia coli in un appropriato Escherichia coli sistema per la produzione di proteine ad alto rendimento (e.g.,E. coli BL21).
    Nota: Continuare direttamente con protocollo di espressione qui sotto. Per conservarli più a lungo, si raccomanda la preparazione di uno stock di glicerolo.

2. espressione dei ceppi modificati e. coli

  1. Preparare una coltura durante la notte (ONC) per l'espressione tramite l'inoculazione di un volume adeguato di LB medium (ad es., 100 mL) con il brodo precedentemente preparato glicerolo delle cellule e. coli BL21 trasformati con il plasmide assemblato o direttamente da un piastra di trasformazione. Aggiungere 100 µ l di kanamicina (50 mg/mL; gene di resistenza agli antibiotici di pET28a) e incubare l'ONC a 37 ° C e 120 giri/min in un agitatore incubatore durante la notte.
  2. Inoculare la cultura principale espressione (ad esempio, 800 mL di terreno LB) con 8 mL dell'ONC e 800 µ l di kanamicina (50 mg/mL).
  3. Incubare la principale coltura a 37 ° C e 120 giri/min in un agitatore incubatore fino a quando la densità delle cellule raggiunge un OD600 di 0.6 - 0.8 (circa 2,5 h).
  4. Ridurre la temperatura di incubazione a 28 ° C.
  5. Indurre l'espressione della proteina con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 0,1 mM.
    Nota: Test empirici hanno mostrato che la riduzione della temperatura di 28 ° C ha dato la massima intensità di luce.
  6. Osservare le cellule fino a quando iniziano a shining (circa 1h).
    Nota: A seconda dello scopo dell'espressione, le cellule sono coltivate fino al giorno successivo e quindi vengono raccolte, o le cellule possono essere tenuti agitazione fino a quando sono brillanti (massimo 48 ore). Raccolta le cellule e la purificazione di qualsiasi proteine può essere fatto secondo le procedure standard.

3. espressione di ceppi batterici bioluminescenti

Nota: Ceppi batterici bioluminescenti richiedono mezzo di crescita specifico medio/artificiali mare acqua per la crescita e la produzione di luce.

  1. Preparare mezzo di acqua di mare artificiale, composto da due componenti medie preparati separatamente.
    Nota: La preparazione del mezzo di acqua di mare artificiale è stata adattata dal protocollo originale22. I seguenti importi sono per mezzo liquido 1l o terreno agar 1 L.
    1. Per mezzo di acqua di mare artificiale, pesano i seguenti sali: 28,13 g NaCl, 0,77 g KCl, 1,60 g CaCl2 · 2H2O, 4,80 g MgCl2 · 6H2O, 0,11 g NaHCO3e 3,50 g MgSO4 · 7H2O.
    2. Aggiungere 1 L di acqua distillata e sciogliere tutti i componenti.
    3. Per mezzo di LB, pesano i seguenti ingredienti: Estratto di lievito 10 g, 10 g peptone e per le piastre di agar, un ulteriore 20 g di agar.
    4. Aggiungere 250 mL di acqua di rubinetto e sciogliere i componenti.
    5. Autoclave sia preparato media separatamente a 121 ° C per 20 min.
    6. Per piastre di agar, 250 mL di terreno LB si combinano con 750 mL di mezzo di acqua di mare artificiale direttamente dopo la sterilizzazione in autoclave e preparare piatti.
    7. Per mezzo di liquido, unire 250 mL di terreno LB con 750 mL di mezzo di acqua di mare artificiale direttamente dopo la sterilizzazione in autoclave o quando raffreddato.
      Nota: Il mezzo di acqua di mare artificiale può ottenere torbido attraverso precipitazione del sale.
  2. Inoculare i ceppi batterici bioluminescenti su piastre di agar media dell'acqua di mare artificiale ed incubare per una notte a 24-30 ° C.
    Nota: Deposito di lungo tempo dei ceppi batterici normalmente avviene attraverso congelamento delle scorte di glicerolo di coltura batterica. Ceppi dovrebbero sempre essere striati su piastre di agar in primo luogo per assicurare condizioni uniformi di partenza per tutti i ceppi, prima dell'uso per colture liquide, a causa di una fase di ritardo nella crescita dopo lo scongelamento.
  3. Preparare un ONC inoculando 100 mL liquido di acqua mare artificiale con una singola Colonia dalla piastra. Incubare le ONC a 24-30 ° C e 120 giri/min in un agitatore incubatore durante la notte.
  4. Inoculare 800 mL di mezzo di acqua di mare artificiale con 8 mL di ONC.
  5. Incubare le cellule batteriche a 24-30 ° C e 120 giri/min in un agitatore incubatore.
    Nota: Il profilo di intensità della luce di batteri bioluminescenti varia fortemente con la temperatura. A seconda i meccanismi regolatori della produzione luce del rispettivo ceppo batterico, emissione di luce può iniziare dopo circa 1-6 h.
  6. Osservare, coltura batterica delle cellule fino a quando iniziano a shining (circa h 1-6).
    Nota: A seconda dello scopo dell'espressione, le cellule sono coltivate fino al giorno successivo e quindi vengono raccolte, o le cellule possono essere mantenute agitazione fino a quando sono brillanti. Raccolta le cellule e la purificazione di qualsiasi proteine può essere fatto secondo le procedure standard.

4. l'analisi in Vivo attività per ceppi batterici bioluminescenti e modificate e. coli ceppi

Nota: Stoccaggio di lungo tempo dei ceppi è normalmente acieved attraverso il congelamento delle scorte di glicerolo di coltura batterica. Ceppi dovrebbero sempre essere striati su piastre di agar in primo luogo per assicurare condizioni uniformi di partenza per tutti i ceppi, prima dell'uso per colture liquide, a causa di una fase di ritardo nella crescita dopo lo scongelamento.

  1. Striscia il ceppo batterico bioluminescente desiderato o modificate Escherichia coli ceppo su una piastra di agar e incubare a 28 ° C durante la notte.
    Nota: La temperatura di incubazione può variare da ceppo a ceppo e deve essere valutata empiricamente. Per essere in grado di confrontare i ceppi batterici bioluminescenti e modificate ceppi di Escherichia coli , condizioni di crescita devono essere identici.
  2. Inoculare 3 mL di terreno con il rispettivo ceppo con una singola Colonia da una piastra di agar e incubare le cellule a 28 ° C e 180 giri/min in un agitatore incubatore per circa 1-2 h.
  3. Misurare la densità delle cellule di un 01:10 diluizione della cultura liquido a 650 nm. Calcolare il rapporto e il volume per 1 mL di coltura con un OD650 di 0.05.
    Nota: L'analisi del lettore successive piatto sarà determinare la densità delle cellule a 650 nm per evitare interferenze dall'emissione luminosa dei ceppi.
  4. Dispensare il volume calcolato di cultura e media in un piatto di parete nero di 24 pozzetti con fondo di vetro. Per la modificate Escherichia coli ceppo, aggiungere 1 µ l di kanamicina (resistenza agli antibiotici del vettore pET28a) e 1 µ l di IPTG (induzione dell'espressione genica) ai campioni. Mettere un coperchio sulla piastra per evitare l'evaporazione durante le misurazioni.
    Nota: Per assicurare che il vettore di pET28a contenente l'operone intero lux non si perde la cultura di e. coli , kanamicina dovrà essere aggiunti ad ogni campione di Escherichia coli nei pozzetti della piastra e per assicurare che la produzione luce di e. coli le cellule possono essere misurate, deve essere indotto l'espressione genica di IPTG. Per evitare interferenze crosstalk e misurazione, piatti ben murato di nero con fondo di vetro e coperchio trasparente ha mostrato i migliori risultati. Tuttavia, area interattiva può essere osservato e posizioni ben devono essere scelti con cura.
  5. Avviare la misurazione in un lettore di piastra.
    Nota: Il protocollo di lettore di piastra è basato su uno script appositamente sviluppato per questo test (Vedi Materiale supplementare) che unisce due misurazioni, assorbanza e bioluminescenza. Punti di dati vengono raccolti ogni 10 min con agitazione permanente tra le misure ed una temperatura costante di 28 ° C.

Risultati

L'ordine di gene dell'operone lux - luxCDABFEG - è altamente conservata in vari ceppi2,5,14. Per la progettazione del plasmide, le informazioni di sequenza è stata presa dal ceppo batterico bioluminescente Photobacterium mandapamensis 27561 e relativo ordine genico è stato mantenuto lo stesso, e, inoltre, sono stati considerati sequenze non codificanti tra singoli geni. Una descrizione schematica della strategia clonazione applicata Gibson è raffigurata in Figura 2. Quattro frammenti in totale, luxCDAB, LUF, luxEG e ribEBH, con 20-40 coppia di basi sovrapposte sequenze sono stati generati. Dopo aver seguito tutti i passaggi del Gibson Assemblea20, sequenziamento del DNA ha confermato il corretto assemblaggio del plasmide, compresi tutti i frammenti. La mappa vettoriale di pET28a di prodotto l'assemblaggio finale contenente l'operone lux-nervatura è raffigurata in Figura 3. Un vantaggio significativo di questo vettore pET28a modificate è l'utilizzo di standardizzata le condizioni di crescita di e. coli e controllata ad induzione con IPTG.

Per misurare l'emissione luminosa di batteri bioluminescenti e la densità delle rispettive cellule, è stato sviluppato un metodo di lettura basato su piastra. Il metodo per il lettore di piastra è stato generato unendo gli script di singola misura per la densità delle cellule e di intensità luminosa. Questo romanzo script attivata la misurazione di OD650 e intensità della luce ogni 10 min per un utente definito periodo di tempo, che deve essere regolato per il tempo di generazione dei batteri usati per analizzare il rispettivo (ad es., 10h). La misura della densità ottica è stata realizzata a 650 nm per evitare interferenze con l'emissione di luce. Come prova di concetto e per assicurare la salute e il comportamento corretto di crescita delle cellule e. coli , sono state effettuate misure di riferimento. Nella Figura 4 il confronto di e. coli BL21 cellule, cellule di e. coli BL21 contenente un vettore vuoto pET28a ed e. coli BL21 cellule contenenti il vettore di pET28a con l'operone lux-nervatura inserto sono presentati. Per il ceppo di quest'ultimo, è stato aggiunto nessun IPTG per analizzare l'emissione di luce a causa della permeabilità del promotore T7. Tutte le tre misure di riferimento mostrano una curva di crescita sigmoidale con tre fasi di crescita (fase stazionaria ed esponenziale di ritardo,). Solo le cellule e. coli BL21, contenente il vettore di pET28a con l'inizio di inserto operone lux-costola di emettere luce, ma in contrasto con le misure cui espressione è indotta tramite l'aggiunta di IPTG e la luce viene emessa dopo 30 min, le cellule non-indotta solo iniziano a brillare dopo circa 5 h e mostrare una molto minore emissione di luce (ca. 4 volte) rispetto al sistema indotto.

Figura 5 dà un confronto delle curve di crescita e intensità di luce dell'operone lux espressa in e. coli e il ceppo batterico bioluminescente mandapamensis p. 27561, nel mezzo di LB o nel mezzo di acqua di mare artificiale, usando il romanzo stabilito il metodo in situ . Per confrontare questi batteri, le misurazioni sono state eseguite a una temperatura di incubazione di 28 ° C. Questa temperatura diminuisce il tasso di crescita del modificate Escherichia coli ceppo in mezzo LB così come mezzo di acqua di mare artificiale, ma per temperature inferiori di ceppi batterici bioluminescenti sono cruciali. Questa dipendenza dalla temperatura è visibile in Figura 5A, come p. mandapamensis 27561 Mostra una densità molto più elevata delle cellule di Escherichia coli. Inoltre, mentre per i ceppi di Escherichia coli , LB medium permette la generazione di più alta densità delle cellule, per naturale ceppi batterici bioluminescenti, mezzo di acqua di mare artificiale è comodo ed essenziale per bioluminescenza. La densità delle cellule registrato correlano con le rispettive intensità di luce, come illustrato nella Figura 5B. Degno di nota, la bioluminescenti Escherichia coli cellule simili da raggiungere maxima di emissione della luce in entrambi mezzo di acqua di mare medio così come artificiale LB, anche se le intensità più alte sono state registrate in diversi momenti. In contrasto con questa osservazione, mandapamensis p. 27561 è praticabile con tassi di crescita molto ridotta nel mezzo di LB, ma le cellule batteriche non ha fatto emettere luce a tutti (Figura 5B). Nel mezzo di acqua di mare artificiale, mandapamensis p. 27561 Mostra un massimo di emissione di luce a circa 1 x 104 conteggi al secondo, che è quasi un fattore di 200 più basso di e. coli. Figura 5 C rappresenta unità relative di luce dove la bioluminescenza è normalizzata per la OD. Questi risultati confermano che non solo è stato l'inserimento di un plasmide contenente l'operone lux in e. coli funzionale e di successo, ma anche che questo modificato Escherichia coli ceppo è una valida alternativa con ancora più elevata emissione di luce rendimenti e senza la limitazione di bioluminescenza batterica di batteri, marina, come un complesso acqua di mare le temperature medie e inferiori.

Inoltre, una misura a lungo termine dell'espressione genica e. coli basato lux-nervatura oltre 24 h è stata realizzata per analizzare la longevità dell'emissione luminosa (Figura 6). Emissione di luce è durato 19,5 h, molto più lungo di ceppi batterici (ad es., p. mandapamensis 27561) dove una diminuzione graduale è stato osservato con conseguente emissione di luce molto bassa dopo 10 h.

Per illustrare le limitazioni di analisi sviluppato, la figura 7 Mostra i risultati della misurazione di tre ceppi batterici bioluminescenti, vale a dire Photobacterium mandapamensis S1, Photobacterium mandapamensis TH1 e del vibrione harveyi 14126. Per il primo ceppo (S1), il metodo funziona molto bene e Mostra un'intensità di bioluminescenza massima di quasi 2 x 106. Per gli altri due ceppi (TH1 e 14126), l'intensità massima della luce non può essere determinata perché l'intensità della luce generata da entrambi ha superato il limite di rilevazione delle impostazioni strumento utilizzato. Il valore di guadagno definito per il metodo sviluppato (script) per questi due ceppi è stato impostato troppo alto. Tuttavia, l'inizio dell'attività di bioluminescenza possa essere confrontato tra loro. P. mandapamensis TH1 e p. mandapamensis S1 avvia splendente dopo circa 1 h e un valore di650 OD di 0,1 - 0,2, rispettivamente. Al contrario, V. harveyi 14126 comincia ad emettere luce dopo circa 5,5 h ad un valore di650 OD di 1.0. L'osservata insorgenza di emissione luminosa è accompagnata da un aumento esponenziale OD, come pure la bioluminescenza. È noto che è alla base della bioluminescenza della V. harveyi 14126 ' quorum sensing regolamento e pertanto una specifica cella densità che permette l'attivazione dell'operone lux , che può essere osservato chiaramente in Figura 713. Questo risultato dimostra che con questo romanzo in situ analisi del lettore piatto che è possibile confrontare facilmente i batteri bioluminescenti e anche approssimativamente definire un meccanismo di regolazione di questi ceppi determinando se un quorum sensing regolamento può essere osservato o no.

Figura 8 Mostra un esempio di una cultura espressione di e. coli BL21 cellule che harboring il plasmide assemblato pET28a contenente l'operone lux dopo induzione con IPTG. Dopo circa un ora dopo induzione, le cellule di e. coli avviare brillante con un colore blu-verde. Figura 8 A Mostra l'espressione di e. coli cultura fotografato nella luce e nella figura 8B dà la stessa cultura nel buio. Figura 8 C raffigura una piastra di agar di mezzo di acqua di mare artificiale con S1 p. mandapamensis incandescente nel buio nella stessa caratteristica di colore blu-verde per bioluminescenza batterica.

Diagramma del flusso di lavoro di Gibson Assembly: progettazione del primer, concentrazione del DNA, trasformazione plasmidica, sequenziamento.
Figura 2 : Rappresentazione schematica della Gibson applicata clonazione strategia. Passaggio (I): primer sovrapposti (frecce colorate; ca. 20-40 coppia di basi si sovrappongono) sono stati progettati. Primer sovrapposti contengono sequenze ricottura composto della rispettiva regione 5' e 3' di un frammento e la rispettiva regione 3' e 5' del segmento adiacente. Passo (II): I frammenti progettati per il montaggio sono generati tramite reazioni di PCR standard. Passo (III): Il vettore di destinazione è linearizzato di digestione di limitazione (ad es., NcoI, XhoI). Passo (IV): Le concentrazioni di DNA di tutti i frammenti e il vettore linearizzato devono essere determinati a regolare concentrazione appropriata per l'assemblaggio di Gibson (secondo il protocollo del produttore). Passo (V): Tutti i frammenti e il vettore linearizzato con concentrazioni nel DNA ottimizzati sono combinati con il mix master Assemblea Gibson (T5 esonucleasi, DNA polimerasi e DNA ligasi) e vengono incubate a 50 ° C per 1 h. passo (VI): il prodotto di assemblaggio è trasformato secondo protocolli standard in un appropriato Escherichia coli ceppo per la replica di plasmide ad alto rendimento (ad es., Escherichia coli TOP10 o XL-1). Passo (VII): Per verificare il corretto assemblaggio del plasmide, sequenziamento del DNA del plasmide assemblato deve essere eseguita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

mappa plasmidico dell'operone lux, vettore pET28a, espressione genica, promotore lac, diagramma circolare del DNA
Figura 3 : Mappa vettoriale, di pET28a, contenente l'operone lux-rib . L'operone lux-costola di mandapamensis p. 27561 viene inserito nel polylinker di pET28a nell'ordine originale di gene (luxCDABFEG-ribEBH). Utilizzato per la clonazione di siti di restrizione NcoI e XhoI. I vari frammenti utilizzati per l'assemblaggio di Gibson dell'operone sono luxCDAB a orange, LUF in verde, luxEG in blu e ribEBH in lavanda; geni all'interno di un frammento sono mostrati come una scatola separata. Sequenze non codificanti tra ogni gene dell'operone sono inclusi nella strategia di clonazione applicata. La dimensione finale del plasmide di pET28a contenente l'operone intero lux-nervatura è 14.625 paia di basi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Curva di crescita BL21 e grafico della bioluminescenza; OD e bioluminescenza nel tempo; espressione genetica.
Figura 4 : Confronto tra curve di crescita e di intensità di luce di ceppi di riferimento. OD a 650 nm e l'intensità di bioluminescenza nei conteggi al secondo sono stati misurati ogni 10 min oltre 10 h a 28 ° C. Tutte le misure sono i valori medi di tre replicati biologici con quattro ripetizioni tecniche ogni. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. E. coli BL21 cellule (quadrati grigi), cellule di e. coli BL21 contenente un vuoto pET28a vector (cerchi grigi), ed e. coli BL21 cellule contenenti il vettore di pET28a con l'inserto di operone lux-rib (diamante nero) sono state analizzate per assicurare la corretta crescita comportamento delle nostre cellule di Escherichia coli . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Grafici di crescita batterica e bioluminescenza; E. coli vs. P. mandapamensis in LB e mezzi di acqua marina.
Figura 5 : Confronto delle curve di crescita e intensità di luce dell'operone lux espressa in e. coli (piazze) e p. mandapamensis 27561 (cerchi) in mezzo LB (aperti simboli) o mezzo di acqua di mare artificiale (simboli riempiti). Tutte le misure sono i valori medi di tre replicati biologici con quattro ripetizioni tecniche ogni. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti ad una temperatura di incubazione di 28 ° C. (A) misure di densità (OD) ottico a 650 nm sono stati effettuati ogni 10 min per 10 h. espressione di e. coli lux operone (pannello sinistro) è rispetto ai mandapamensis p. 27561 (pannello di destra) in mezzo acqua mare medio e artificiale di LB. Densità delle cellule sono determinati a 650 nm per evitare interferenze di bioluminescenza. (B) misurazione dell'intensità della luce (bioluminescenza [conteggi/s]) è stato effettuato ogni 10 min per 10 h. espressione di e. coli lux operone (pannello sinistro) viene confrontato con mandapamensis p. 27561 (pannello di destra) in LB mare medio e artificiale mezzo di acqua. (C) luce relativa intensità (RLU/OD) dell'operone lux espressa in e. coli (pannello di sinistra) e p. mandapamensis 27561 (pannello di destra) sono determinati dalla normalizzazione bioluminescenza a densità cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dinamica di crescita, bioluminescenza, grafico RLU/OD; Risultati sperimentali nel tempo in pochi minuti.
Figura 6 : Confronto delle curve di crescita e intensità di luce di e. coli basato su espressione genica lux per 24 h. OD a 650 nm e l'intensità di bioluminescenza nei conteggi al secondo sono stati misurati ogni 10 min oltre 24 h a 28 ° C. Tutte le misure sono i valori medi di tre replicati biologici con quattro ripetizioni tecniche ogni. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Inoltre, l'intensità di luce relativa (RLU/OD) dove la bioluminescenza è normalizzato di densità delle cellule sono rappresentati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafico della crescita batterica e della luminescenza; analisi della densità ottica, della bioluminescenza, dell'RLU/OD rispetto al tempo.
Figura 7 : Confronto tra batteri bioluminescenti per valutare potenziali ' quorum sensing regolamento. Emissione di luce e densità delle cellule sono misurati ogni 10 min per 10 h e rappresentano i valori medi di tre replicati biologici con quattro ripetizioni tecniche ogni. Barre di errore rappresentano deviazioni standard. Misurazioni di Photobacterium mandapamensis TH1 (quadrati neri), Vibrio harveyi 14126 (cerchi grigi) e S1 Photobacterium mandapamensis (diamanti grigi) sono stati confrontati a vicenda; (A) raffigura la densità ottica (OD) a 650 nm, (B) la luce intensità (bioluminescenza [conteggi/s]) e (C) intensità di luce relativa (RLU/OD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati di bagliore di fermentazione; Coltura bioluminescente in pallone, struttura chimica a emissione verde.
Figura 8 : Bioluminescenza in mezzi liquidi e sulle piastre di agar. (A) pallone da 5 L con il mezzo di LB 2 L inoculati con e. coli BL21 cellule che esprimono il plasmide di operone lux pET28a fotografato in luce. (B) la stessa cultura come in (A) fotografata al buio. Foto A e B sono state scattate circa 2 h dopo l'induzione dell'espressione. (C) piastra di agar medio di acqua di mare artificiale con cultura striato di S1 p. mandapamensis fotografato al buio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La costruzione di un plasmide di espressione contenente quattro frammenti che compongono l'operone intero lux-costola di mandapamensis p. 27561 è stata realizzata via Gibson clonazione. Questa espressione genica di e. coli basato lux permettono alle cellule di Escherichia coli emettere luce. Evitando ' quorum sensing regolamento e le condizioni di crescita non standard sono notevoli vantaggi di questo sistema.

I vantaggi di usando strategia clonazione Gibson sono la facilità di montaggio di più frammenti di DNA lineari, alta flessibilità e senza necessità di restrizione specifici siti18,19,20. Questo metodo consente di cambiare facilmente un operone lux , esclusione di singoli geni o cluster genici o l'introduzione di nuovi geni o lo scambio di geni da un ceppo con un altro. Un prerequisito per l'applicazione di questo metodo è la disponibilità della sequenza del gene di operone rispettivi lux . Solo per un piccolo numero di batteri bioluminescenti è l'intera sequenza di DNA dell'operone rispettivi lux noti e/o disponibili. Molte di queste sequenze sono frammentati perché siano generate mediante sequenziamento shotgun. Nel caso l'indagato mandapamensis p. 27561 l'intera sequenza di DNA dell'operone lux è noto e disponibile dal database NCBI gene (GenBank: DQ988878.2).

Un passo critico nel protocollo dell'Assemblea di Gibson è il calcolo della concentrazione del DNA dei singoli frammenti. Nel protocollo di montaggio del produttore è stato consigliato di utilizzare 0,2 - 0,5 pmols e un volume totale di 20 µ l per 4-6 frammenti20,21. Nel nostro caso, dove luxCDABFEG-ribEBH è composto da 4 frammenti, le concentrazioni e volumi totali erano pmol 0.1 e 45 µ l, rispettivamente, a seconda del rendimento dei prodotti di PCR. Da un lato, la concentrazione doveva essere ridotto e d'altra parte, il volume doveva essere aumentata. Tuttavia, l'Assemblea ha lavorato molto bene e sequenziamento del DNA ha confermato l'inserimento corretto al primo tentativo. Questa scoperta ha confermato assembly Gibson come un metodo robusto e adatto per le nostre indagini, che possono essere facilmente modificate18,19,20.

L'analisi del lettore neoformata piatto è un facile da gestire metodo. Consente una semplice analisi primaria di nuovo o (ONU-) noto ceppi batterici bioluminescenti e dà già un primo accenno sul meccanismo di regolamentazione della produzione di luce (ad es., ritardo a luminescenza a densità bassa delle cellule). Inoltre, le condizioni di crescita in combinazione con la produzione di luce possono essere valutate facilmente semplicemente cambiando crescita medio o temperatura.

Con il lettore di piastra sono state effettuate a 28 ° C. La ragione di questa impostazione insolita è la sensibilità di temperatura di ceppi di batteri bioluminescenti, dove le temperature superiori ai 30 ° C portano a meno o addirittura nessuna crescita e/o emissione di luce. Notare che il lettore è in grado di mantenere una temperatura definita nel corso del tempo con la limitazione della mancanza di un sistema di raffreddamento attivo. Pertanto, la temperatura ambiente deve essere inferiore alla temperatura di misura.

Come un proof of concept, il confronto tra il costrutto di Escherichia coli con il ceppo bioluminescente p. mandapamensis (Figura 5) su un lato e le misure di riferimento (Figura 4) d'altra parte sono stati eseguiti e confermare l'affidabilità di questo sistema di nuova costituzione. Inoltre, la misurazione a lungo termine ha assicurato la longevità dell'emissione luminosa (Figura 6). Ma si deve considerare che i valori OD non sono affidabili di sopra una certa densità ottica, a seconda delle caratteristiche del dispositivo di misura usato (circa 15 h nel caso di specie) dove sarebbe necessaria una diluizione appropriata per una misura nella della gamma lineare del rivelatore. Queste varianze alte in valori OD rendono queste misure di lungo periodo di tempo non affidabile. Misure più corte come 10h si raccomanda pertanto utilizzando la messa a punto sperimentale segnalato qui.

Limitazioni del test lettore piastra stabilito possono essere visto nella Figura 7. La difficoltà consiste nel trovare un'impostazione appropriata della misurazione. Il valore di guadagno regola la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore (PMT). Il guadagno è l'amplificazione del segnale in PMT, significato che un fattore di guadagno superiore aumenterà il segnale. Se il guadagno è impostato troppo basso, il rapporto segnale-rumore diventa più grande e intensità di luce di batteri bioluminescenti splendenti "bassi" non può essere misurata (eventuali segnali più vicino allo zero, dati non indicati). La sfida in un'analisi bioluminescente è impostare il guadagno quindi i risultati di misura per tutti i ceppi batterici rimanere all'interno della gamma dello strumento. Inoltre, la gamma di misurazione per luminescenza dipende il tempo di intervallo di misurazione (ad es., massimo di 2.000.000 per 1 s).

Il guadagno è stato impostato a 2800, empiricamente, che è stato testato e scelto per il lettore di piastra specifica utilizzato per l'istituzione di questo metodo. L'impostazione del guadagno usato permette la registrazione di massima luce emessa dalla bioluminescenti sistema di Escherichia coli , mandapamensis p. 27561 e p. mandapamensis S1 senza un overflow, ma per i ceppi di p. mandapamensis TH1 e V. harveyi 14126 il guadagno era troppo alto. Di conseguenza, questi ceppi di quest'ultimi superino il limite di rilevamento e l'intensità della luce reale massima non può essere misurato. Questa limitazione tecnica potrebbe impedire il confronto di batteri bioluminescenti, che mostrano forti variazioni nella massima emissione luminosa, anche se le condizioni di crescita e densità delle cellule potrebbe essere paragonabile.

Posizionamento dei ceppi batterici analizzati entro i piatti usati bene deve essere valutata empiricamente. Sebbene neri piastre a pozzetti con fondo in vetro sono stati utilizzati, diafonia tra i campioni è stata osservata. L'intensità della luce di ceppi specifici è così alta, che tutti i pozzi vicini mostrerà false positive emissioni luminose (ad es., vuoto). Pertanto, è importante misurare due diversi ceppi sia separatamente che con una certa separazione spaziale a vicenda.

Ci sono già molti ceppi di e. coli conosciuti che contengono parti dell'operone lux per l'ultima volta e sono principalmente orientate all'applicazione15,16,17. I metodi descritti qui, mirano a ricerca fondamentale, ad esempio la possibilità di analizzare ciascun gene lux separatamente. Anche se la ricerca della bioluminescenza ha una lunga storia, ci sono ancora molte questioni aperte. Escluse o introducendo geni dall'operone lux , lo scambio di geni luxAB con geni di un altro ceppo, o analizzare proteina complessi, incorporato nel facile gestire il sistema di e. coli e ulteriore applicazione della piastra analisi di lettore, potrebbe essere possibile ottenere ulteriori informazioni sui processi di regolamentazione e le funzioni dei geni di lux .

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Vogliamo ringraziare Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) per il suo sostegno nell'instaurazione lo script auto-scritto per il lettore di piastra. Questo lavoro è stato sostenuto dagli austriaci "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) a PM (P24189) e il programma di dottorato di ricerca "DK enzimologia molecolare" (W901) al PM.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NEBuilder Kit di clonazione per l'assemblaggio del DNA ad alta fedeltàNew England Biolabs Inc.E2621Sper 10 rxn
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad
Phusion polimerasi Thermo ScientificF530S
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltàNew England Biolabs Inc.M0491S
GeneJet Kit di purificazione del DNA genomicoThermo ScientificK0721per 50 rxn
Enzimi di restrizione e tampone (NcoI, XhoI)New England Biolabs Inc.R3193S/R0146S
Kit di pulizia per gel e PCR Wizard SVPromegaA9282per 250 rxn
Kit di estrazione del gel Monarch DNA New England Biolabs Inc.#T1020Sper 50 rxn
GeneJet Plasmid Miniprep Kit Thermo ScientificK0503per 250 rxn
GoTaq G2 DNA polimerasiPromegaM7841
Piastra sensopiastra nera a 24 pozzetti con fondo in vetroGreiner Bio One662892
Lettore di piastre FLUOStar Omega BMG Labtech
OPTIMA/Mars Software di analisiBMG LabtechVersione 2.20
Microsoft Excel 2010Microsoft
Multitron Standard Incubator ShakerInfors AG

Riferimenti

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