Articolo metodologico

PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare

DOI:

10.3791/57950

⸱

3 luglio 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNA circolanti hanno indicato la promessa come biomarcatori per malattie cardiovascolari e infarti miocardici acuti. In questo studio, descriviamo un protocollo per l'estrazione di miRNA, trascrizione d'inversione e digitali PCR per la quantificazione assoluta dei miRNA nel siero dei pazienti con la malattia cardiovascolare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circolanti nel siero i microRNA (Mirna) hanno indicato la promessa come biomarcatori per la malattia cardiovascolare ed infarto miocardico acuto (AMI), rilasciato dalle cellule cardiovascolari nella circolazione. Mirna circolanti sono altamente stabili e possono essere quantificati. L'espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato per la patologia e alcuni miRNA Visualizza alta tessuto e specificità di malattia. Trovare nuovi biomarcatori per le malattie cardiovascolari è di importanza per la ricerca medica. Abbastanza recentemente, reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR) è stata inventata. dPCR, combinato con sonde fluorescenti idrolisi, consente specifica diretta quantificazione assoluta. dPCR esibisce qualità tecniche superiori, tra cui una bassa variabilità, alta linearità e alta sensibilità rispetto alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Così, dPCR è un metodo più accurato e riproducibile per quantificare direttamente Mirna, specialmente per l'uso in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center. In questa pubblicazione, descriviamo come eseguire efficacemente PCR digitale al fine di valutare il numero di copia assoluta nei campioni di siero.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mirna circolanti sono stati identificati come promettenti marcatori per un certo numero di malattie, compreso la malattia cardiovascolare1. I miRNA sono piccoli, non codificanti molecole di RNA singolo-incagliato (lunghe circa 22 nucleotidi) sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale attraverso l'alterazione della traduzione di RNA messaggero e d'influenza gene expression2 e vengono rilasciati nella circolazione negli Stati sia fisiologiche che patologiche. L'espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato alla patologia e alcuni miRNA Mostra alto tessuto e malattia specificità1. Nelle malattie cardiovascolari, Mirna sono diventati i candidati attraenti come nuovi biomarcatori perché sono notevolmente stabili nel siero e può facilmente essere quantificati con l'aiuto di PCR metodologia3. Il valore potenziale di Mirna come biomarcatori per infarto del miocardio è stato valutato in piccoli studi, ma una convalida in larghe coorti è carente2. Ad esempio, miR-499 è trovato altamente espressi nel muscolo del miocardio, e ha dimostrato di essere significativamente aumentata in un AMI4,5,6. Inoltre, esso regola programmato la morte delle cellule (apoptosi) e la differenziazione dei cardiomiociti e così è compreso in parecchi meccanismi segue un AMI7. A parte alcuni piccoli studi che riferiscono una superiorità e il valore incrementale di Mirna per la diagnosi di AMI, la superiorità o uguaglianza di alto-sensibilità troponine cardiache non è ancora stato dimostrato in studi su larga scala2,5 ,6,8. Ulteriori studi prospettici in larghe coorti sono, pertanto, necessari per valutare il potenziale valore diagnostico di Mirna. Inoltre, metodi di quantificazione di miRNA devono essere ottimizzate e9di protocolli standardizzati utilizzando comparabili. Analisi standardizzate possono ridurre risultati incoerenti e possono aiutare Mirna a diventare potenziali biomarcatori per l'applicazione clinica di routine, come biomarcatori devono essere quantificati in modo riproducibile per garantire la loro applicabilità clinica.

Recentemente, dPCR è stato introdotto come un'analisi di punto finale. Esso suddivide il campione in circa 20.000 reazioni individuali10. Il sistema di dPCR utilizza quindi una matematico Poisson analisi statistica dei segnali fluorescenti (reazioni positive e negative), che consente una quantificazione assoluta senza una curva standard10. Quando si combinano dPCR con sonde fluorescenti idrolisi, la quantificazione assoluta diretta altamente specifica dei miRNA è reso possibile. Reazione a catena della polimerasi digitale ha dimostrato che mostra qualità tecniche superiori (tra cui una variabilità in diminuzione, una maggiore riproducibilità quotidiana, un alto grado di linearità e un'alta sensibilità) per quantificare i livelli di miRNA nella circolazione rispetto al quantitativo in tempo reale PCR10,11. Queste qualità tecniche superiori potrebbe contribuire ad per attenuare le attuali limitazioni sull'utilizzo di Mirna circolanti come biomarcatori e può condurre all'istituzione di Mirna come biomarcatori in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center e come metodo diagnostico in generale. In uno studio precedente, abbiamo recentemente applicato dPCR per la quantificazione assoluta di Mirna in pazienti con IMA in circolazione e sono stati in grado di dimostrare il potenziale diagnostico superiore rispetto alla quantificazione dei miRNA qPCR12.

In questa pubblicazione, vogliamo dimostrare che l'utilizzo di dPCR è un metodo accurato e riproducibile per quantificare direttamente la circolazione cardiovascolari Mirna. La quantificazione assoluta di miRNA livelli nel siero, usando la PCR digitale, Mostra il potenziale per l'uso in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center. In questa pubblicazione, descriviamo in dettaglio come eseguire efficacemente PCR digitale e come rilevare il numero di copie di miRNA assoluta nel siero.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. estrazione di miRNA da Plasma/siero

Nota: Al fine di quantificare i miRNA in modo appropriato, l'isolamento di microRNA corretta dal plasma/siero è un passo cruciale. Una cosa fondamentale da tenere a mente, soprattutto perché esistono diversi protocolli, è di aderire al flusso di lavoro stesso durante l'elaborazione dei campioni. In questo protocollo, miRNA è estratta da 50 µ l di siero. Non utilizzare più di 200 µ l come questo limite il processo di estrazione corretta.

  1. Preparare il siero o scongelare i campioni congelati.
  2. Aggiungere 250 µ l (5 volumi) di reagente di lisi commerciale 50 µ l di siero. Sostenere la lisi nel Vortex. Posizionare il tubo con il lisato sul banco a temperatura ambiente per 5 min.
  3. Spike il lisato con 3,5 µ l di controllo di spike (1,6 x 107 copie / µ l) e mescolare nel Vortex.
  4. Aggiungere 50 µ l di cloroformio (cioè, un importo pari per quanto riguarda il campione di siero di partenza) per la separazione di fase. Agitare energicamente il tubo per 15 s. posto il tubo sul banco a temperatura ambiente per 2-3 min.
  5. Per la separazione di fase, centrifugare la provetta a 12.000 x g a 4 ° C per 15 min.
    Nota: I campioni sono ora separati in una fase acquosa superiore contenente il RNA, un bianco interfase e una fase organica inferiore, rosa.
  6. Trasferire la fase acquosa superiore (100 µ l) contenente il RNA in un nuovo tubo. Non trasferire qualsiasi materiale bianco interfase come questo falsifica il conteggio corretto di RNA.
  7. Aggiungere 150 µ l (cioè, 1,5 volte il volume del campione trasferito) di etanolo al 100%. Mescolare i materiali li pipettando su e giù. Non centrifugare li e rapidamente passare al passaggio successivo.
  8. Pipettare 250 µ l del campione su una colonna commerciale spin in un tubo di raccolta da 2 mL. Chiudere il coperchio. Centrifugare la colonna > 8.000 x g e a temperatura ambiente per 15 s. scartare il flusso continuo.
  9. Aggiungere 700 µ l di numero di buffer di lavaggio commerciale 1 nella colonna di selezione. Chiudere il coperchio e centrifugare la colonna > 8.000 x g e a temperatura ambiente per 15 s. scartare il tampone di lavaggio di prova generale.
  10. Aggiungere 500 µ l di numero di buffer di lavaggio commerciale 2 nella colonna di selezione. Chiudere il coperchio e centrifugare colonna in > 8, 000 x g a temperatura ambiente per 15 s. scartare il tampone di lavaggio di prova generale.
  11. Pipettare 500 µ l di etanolo di 80% per la colonna di spin. Chiudere il coperchio, centrifugare la colonna a > 8, 000 x g e a temperatura ambiente per 2 min. gettare la provetta di raccolta con il flusso continuo.
  12. Trasferire la colonna di rotazione ad un nuovo tubo di raccolta da 2 mL. Centrifugare la colonna a tutta velocità con un coperchio aperto ad asciugare la membrana. Gettare la provetta di raccolta con il flusso continuo.
  13. Trasferire la colonna di spin in un nuovo tubo di raccolta di 1,5 mL. Eluire il RNA applicando 30 µ l di acqua RNAsi-libera direttamente al centro della membrana. Chiudere il coperchio. Centrifugare la colonna a tutta velocità per 1 min.
  14. Conservare il RNA-70 ° C.
    Nota: Il deposito di RNA purificato in acqua RNAsi-libera tra-70 ° C a-20 ° C non assicura nessuna degradazione del RNA per 1 anno. Seguendo il protocollo del produttore, l'importo minimo di RNAsi-libera di acqua per diluire il RNA è 10 µ l. utilizzando meno di 10 µ l insufficientemente può idratare la membrana e riducono il rendimento di RNA totale.

2. trascrizione inversa

Nota: Il DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato utilizzando il seguente protocollo di trascrizione inversa (RT) di 15 µ l (volume di reazione totale).

  1. Scongelare il kit RT sul ghiaccio. Mantenere gli enzimi nel congelatore finchè possibile impedire loro di degradante e loro si sono fermati prima dell'uso. Scongelare i primer RT sul ghiaccio e li spin giù prima dell'uso.
  2. Preparare il mix master come descritto nella tabella 1.
  3. Unire 10 µ l di mix master e 5 µ l di RNA estratto per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  4. Centrifugare la piastra ben a 2.000 x g a 4 ° C per 2 min.
  5. Utilizzare il protocollo di ciclo termico descritto in tabella 2 per la trascrizione d'inversione.
    Nota: Come descritto di seguito, cDNA può direttamente essere trattato nella macchina digitale PCR (Vedi Tabella materiali); in alternativa, può essere conservato a-20 ° C.

3. gocciolina generazione e digitali PCR

Nota: Digital PCR è stata effettuata utilizzando il seguente protocollo di 40 µ l.

  1. Scongelare il mix commerciale dPCR, il cDNA preparato e gli iniettori PCR sul ghiaccio. Centrifugare a loro poco prima dell'uso.
  2. Preparare il mix master, come descritto in tabella 3.
  3. Aggiungere 1,33 μL/pozzetto del prodotto RT ed e centrifugare.
  4. Pipettare 20 μL del campione in ciascun pozzetto della cassetta 8 pozzetti (media riga).
    Nota: Se la cassetta 8 pozzetti non è completamente riempita, riempire i pozzetti rimanenti con controlli non modello (NTCs) che omettono di cDNA (cioè, il prodotto di RT producerat con acqua invece di RNA estratto) o buffer commerciale dPCR. La NTC serve come un controllo di contaminazione. Acqua non deve essere utilizzato nei restanti pozzetti, perché che potrebbe compromettere la qualità della formazione delle gocce.
  5. Pipettare 70 μL dell'olio di generazione di goccia per le sonde in pozzi di petrolio (riga inferiore) della cassetta 8 pozzetti.
  6. Posizionare una guarnizione sopra la cassetta 8 pozzetti e inserire la cassetta nel generatore di goccia. Chiudere il generatore di goccia. Attendere che le spie 3 sono verde fisso.
    Nota: Le goccioline vengono ora generate.
  7. Lentamente e con cautela trasferire 40 μL del campione formato della gocciolina (riga superiore) in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti di pipettaggio.
  8. Dopo aver completato la formazione della gocciolina sui campioni, sigillare la piastra PCR con un foglio di dPCR PERFORABILE a 180 ° C per 4 s.
  9. Posizionare la piastra PCR a lamina-sigillato nel ciclatore e azionarla come descritto nella tabella 4, ad un tasso di rampa di 2,5 ° C/s.

4. gocciolina lettura e l'analisi

  1. Trasferire la piastra dal termociclatore alla base del proprietario del piatto. Serrare la piastra PCR posizionando ilvertice il portatarga sulla piastra di PCR.
  2. Avviare il software commerciale dPCR.
  3. Immettere il nome di esempio, il nome dell'esperimento e il bersaglio nel setup. Selezionare la quantificazione assoluta.
  4. Avviare la gocciolina lettura facendo clic su Esegui. Selezionare FAM/HEX o FAM/VIC come chimica di rilevamento quando si lavora con sonde di idrolisi.
    Nota: Il software commerciale dPCR quindi auto-analizzerà i dati.
  5. Controllare i numeri di goccia nella tabella dei risultati per garantire una generazione corretta della gocciolina.
  6. Selezionare tutti i pozzetti con la stessa miRNA quantificato e fare clic su analizza. Utilizzare il blot 2D per contrassegnare le goccioline positive e correggere manualmente i dati auto-analizzati (Figura 1).

5. correggere i calcoli sul campione

  1. Normalizzare l'esempio moltiplicando il campione per il fattore di normalizzazione (NF).
    NF = mediana [c. elegans miR-39 misure]tutti i campioni/ [c. elegans miR-39]dato campione
  2. Calcolare la concentrazione nel siero di miRNA finale, regolazione per fattori di diluizione (DF).
    [miRNA] finale = [miRNA]valore raw x DFRT x DFdPCR x DFEx
    Dove:
    [miRNA] valore non elaborato = il miRNA quantificato dal software commerciale dPCR;
    DFRT = il fattore di diluizione del modello nella trascrizione d'inversione;
    DFdPCR = il fattore di diluizione del modello in dPCR;
    DFEx = il fattore di diluizione nell'estrazione.

6. serie di diluizioni di Oligonucleotide sintetico

  1. Scongelare i liofilizzati oligonucleotide sintetico sul ghiaccio. Brevemente e centrifugare.
  2. Diluire il liofilizzato oligonucleotide sintetico in acqua priva di nucleasi a una concentrazione finale di 10 pmol / µ l. brevemente centrifuga esso.
  3. Diluire in acqua priva di nucleasi come descritto nella tabella 5. Centrifugare la diluizione brevemente tra ogni fase di diluizione a 8.000 x g per 10 s.
  4. Proseguire con la trascrizione d'inversione come descritto nel passaggio 2 e analizzare i campioni con PCR digitale come descritto nei passaggi 3 e 4.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PCR digitale combinato con sonde fluorescenti idrolisi consente ai ricercatori di quantificare direttamente gli importi assoluti di miRNA specifici in copie / µ l. Come l'esempio in dPCR è partizionata in circa 20.000 singole reazioni di PCR, dPCR non richiede tecniche replica10. Il sistema di dPCR utilizza un'analisi statistica di Poisson matematica dei segnali fluorescenti (differiscono tra reazioni positive e negative) che consente una quantificazione assoluta s...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Digitale PCR è un metodo relativamente nuovo end-point di PCR che permette la quantificazione assoluta diretta degli acidi nucleici all'interno di un campione. Il metodo possiede particolari vantaggi, tra cui una variabilità in diminuzione, una maggiore riproducibilità quotidiana e una sensibilità superiore11,12. Inoltre, dovuto il partizionamento del campione in analisi di endpoint e circa 20.000 singole reazioni, dPCR è più robusto per sostanze interferenti nel...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RNA-Extraction
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland217184Kit per l'estrazione di microRNA. Il kit contiene il tampone commerciale RWT (chiamato numero uno nel manoscritto)... e RPE (chiamato numero due nel manoscritto).
miRNeasy Picco di siero/plasma in controllo; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmolQiagen-Campione & Assay Technologies, Hilden, Deutschland219610Spike-in per la normalizzazione, Sequenza: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Trascrizione inversa
Kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA (1000 reazioni)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USAKit 4366597per la trascrizione inversa di microRNA
TaqMan MicroRNA Assays MApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Saggi utilizzati nella trascrizione inversa
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Numero di test 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Numero di test 000200
Piastra PCR, 96 pozzetti, segmentata, semi-gonnaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAAB0900Piastra a 96 pozzetti per trascrizione inversa
Microseal ' B’ sigillo SealsBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USAMSB1001Lamina per garantire una corretta conservazione
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1851196Cycler utilizzato per la trascrizione inversa
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5pTecnologie DNA integrate PersonalizzatoSequenza: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
Supermix per sonde (No dUTP)Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863024Supermix utilizzato nella generazione di goccioline
TaqMan MicroRNA AssaysApplied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Saggi utilizzati nella PCR digitale (sonda di idrolisi fluorescente)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Saggio numero 001352, primer commerciali
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA4440887Numero di saggio 000200, primer commerciali
DG8 Cartucce e guarnizioniBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864007Cartuccia preleva fino a 8 campioni per la generazione di goccioline
Cartuccia DG8 HolderBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863051Contiene cartucce per la generazione di goccioline
Olio per la generazione di goccioline per sondeBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863005Olio utilizzato per la generazione di goccioline
ddPCR Piastre a 96 pozzettiBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA12001925 Piastra a 96 pozzetti per ddPCR
PCR Piastra termosaldabile, lamina, perforabileBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1814040Lamina perforabile, compatibile con il lettore di gocce
ddPCR Olio per lettore di gocceBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863004Olio utilizzato per la lettura delle goccioline
Generatore di gocce QX100 o QX200Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863002Generatore di gocce, genera le goccioline dall'emulsione campione/olio
PX1 PCR Sigillante per piastreBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1814000Sigilla la piastra prima della PCR
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1851196Cycler utilizzato per il lettore di gocce ddPCR
QX100 o QX200Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863003Legge goccioline positive e negative alla PCR con un rilevatore ottico
Controllo tampone ddPCR per sondeBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863052Controllo del bianco  e per riempire i pozzetti rimanenti di 8-well cassette
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864011Programma per la lettura delle goccioline
Prism Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USAProgramma per l'analisi statistica

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
  2. Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
  3. Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
  4. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
  5. Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
  6. Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
  7. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
  8. Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
  9. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
  10. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
  11. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  12. Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
  13. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
  14. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
  15. Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
  16. Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
  17. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Quantificazione dei microRNAFormazione di gocciolineTrascrizione inversaCampioni di sieroSonde di idrolisi fluorescentiQuantificazione assoluta

Articoli correlati