MicroRNA circolanti hanno indicato la promessa come biomarcatori per malattie cardiovascolari e infarti miocardici acuti. In questo studio, descriviamo un protocollo per l'estrazione di miRNA, trascrizione d'inversione e digitali PCR per la quantificazione assoluta dei miRNA nel siero dei pazienti con la malattia cardiovascolare.
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Articolo metodologico
PCR digitale per quantificare circolanti microRNA nell'infarto miocardico acuto e la malattia cardiovascolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Circolanti nel siero i microRNA (Mirna) hanno indicato la promessa come biomarcatori per la malattia cardiovascolare ed infarto miocardico acuto (AMI), rilasciato dalle cellule cardiovascolari nella circolazione. Mirna circolanti sono altamente stabili e possono essere quantificati. L'espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato per la patologia e alcuni miRNA Visualizza alta tessuto e specificità di malattia. Trovare nuovi biomarcatori per le malattie cardiovascolari è di importanza per la ricerca medica. Abbastanza recentemente, reazione a catena della polimerasi digitale (dPCR) è stata inventata. dPCR, combinato con sonde fluorescenti idrolisi, consente specifica diretta quantificazione assoluta. dPCR esibisce qualità tecniche superiori, tra cui una bassa variabilità, alta linearità e alta sensibilità rispetto alla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). Così, dPCR è un metodo più accurato e riproducibile per quantificare direttamente Mirna, specialmente per l'uso in ampi studi clinici cardiovascolari del multi-center. In questa pubblicazione, descriviamo come eseguire efficacemente PCR digitale al fine di valutare il numero di copia assoluta nei campioni di siero.
Introduzione
Mirna circolanti sono stati identificati come promettenti marcatori per un certo numero di malattie, compreso la malattia cardiovascolare1. I miRNA sono piccoli, non codificanti molecole di RNA singolo-incagliato (lunghe circa 22 nucleotidi) sono coinvolti nella regolazione post-trascrizionale attraverso l'alterazione della traduzione di RNA messaggero e d'influenza gene expression2 e vengono rilasciati nella circolazione negli Stati sia fisiologiche che patologiche. L'espressione quantitativa di miRNA specifici possa essere collegato alla patologia e alcuni miRNA Mostra alto tessuto e malattia specificità
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Protocollo
1. estrazione di miRNA da Plasma/siero
Nota: Al fine di quantificare i miRNA in modo appropriato, l'isolamento di microRNA corretta dal plasma/siero è un passo cruciale. Una cosa fondamentale da tenere a mente, soprattutto perché esistono diversi protocolli, è di aderire al flusso di lavoro stesso durante l'elaborazione dei campioni. In questo protocollo, miRNA è estratta da 50 µ l di siero. Non utilizzare più di 200 µ l come questo limite il processo di estrazione corretta.
- Preparare il siero o scongelare i campioni congelati.
- Aggiungere 250 µ l (5 volumi) di reagente di lisi commerciale 50 µ l di siero. Sostenere la li....
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Risultati
PCR digitale combinato con sonde fluorescenti idrolisi consente ai ricercatori di quantificare direttamente gli importi assoluti di miRNA specifici in copie / µ l. Come l'esempio in dPCR è partizionata in circa 20.000 singole reazioni di PCR, dPCR non richiede tecniche replica10. Il sistema di dPCR utilizza un'analisi statistica di Poisson matematica dei segnali fluorescenti (differiscono tra reazioni positive e negative) che consente una quantificazione assoluta s.......
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Discussione
Digitale PCR è un metodo relativamente nuovo end-point di PCR che permette la quantificazione assoluta diretta degli acidi nucleici all'interno di un campione. Il metodo possiede particolari vantaggi, tra cui una variabilità in diminuzione, una maggiore riproducibilità quotidiana e una sensibilità superiore11,12. Inoltre, dovuto il partizionamento del campione in analisi di endpoint e circa 20.000 singole reazioni, dPCR è più robusto per sostanze interferenti nel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit per l'estrazione di microRNA. Il kit contiene il tampone commerciale RWT (chiamato numero uno nel manoscritto)... e RPE (chiamato numero due nel manoscritto). |
| miRNeasy Picco di siero/plasma in controllo; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Campione & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in per la normalizzazione, Sequenza: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Trascrizione inversa | |||
| Kit di trascrizione inversa TaqMan MicroRNA (1000 reazioni) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | Kit 4366597 | per la trascrizione inversa di microRNA |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Saggi utilizzati nella trascrizione inversa |
| has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Numero di test 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Numero di test 000200 |
| Piastra PCR, 96 pozzetti, segmentata, semi-gonna | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | Piastra a 96 pozzetti per trascrizione inversa |
| Microseal ' B’ sigillo Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Lamina per garantire una corretta conservazione |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler utilizzato per la trascrizione inversa |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo has-miR-499-5p | Tecnologie DNA integrate Personalizzato | Sequenza: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR | |
| Supermix per sonde (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix utilizzato nella generazione di goccioline |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Saggi utilizzati nella PCR digitale (sonda di idrolisi fluorescente) |
| has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Saggio numero 001352, primer commerciali |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Numero di saggio 000200, primer commerciali |
| DG8 Cartucce e guarnizioni | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartuccia preleva fino a 8 campioni per la generazione di goccioline |
| Cartuccia DG8 Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Contiene cartucce per la generazione di goccioline |
| Olio per la generazione di goccioline per sonde | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Olio utilizzato per la generazione di goccioline |
| ddPCR Piastre a 96 pozzetti | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 Piastra a 96 pozzetti per ddPCR | |
| PCR Piastra termosaldabile, lamina, perforabile | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Lamina perforabile, compatibile con il lettore di gocce |
| ddPCR Olio per lettore di gocce | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Olio utilizzato per la lettura delle goccioline |
| Generatore di gocce QX100 o QX200 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Generatore di gocce, genera le goccioline dall'emulsione campione/olio |
| PX1 PCR Sigillante per piastre | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Sigilla la piastra prima della PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler utilizzato per il lettore di gocce ddPCR |
| QX100 o QX200 | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Legge goccioline positive e negative alla PCR con un rilevatore ottico |
| Controllo tampone ddPCR per sonde | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Controllo del bianco e per riempire i pozzetti rimanenti di 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Programma per la lettura delle goccioline |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Programma per l'analisi statistica |
Riferimenti
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al.
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Ristampe e permessi
