Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.
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Articolo metodologico
Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo articolo, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule atriali cardiomiociti (ACMs) da un modello del ratto della sindrome metabolica (MetS)-correlate a insufficienza cardiaca con frazione di eiezione preservata (HFpEF). La prevalenza di MetS-correlati HFpEF è in aumento, e malattie del miocardio atriale associati rimodellamento atriale e fibrillazione atriale sono clinicamente altamente rilevanti come rimodellamento atriale è un preannunciatore indipendente della mortalità. Studi con cardiomiociti isolati unicellulare utilizzati frequentemente per corroborare e integrare i risultati in vivo . Rarefication vaso circolatorio e fibrosi del tessuto interstiziale rappresentano un fattore potenzialmente limitante per l'isolamento di singole cellule successo di ACMs da modelli animali di questa malattia.
Abbiamo affrontato questo problema con l'ausilio di un dispositivo in grado di regolare manualmente la pressione intraluminale delle cavità cardiache durante la procedura di isolamento, sostanzialmente aumentando il rendimento della ACMs morfologicamente e funzionalmente intatto. Le cellule acquisite possono essere utilizzate in una varietà di diversi esperimenti, come coltura cellulare e formazione immagine funzionale del calcio (cioè, accoppiamento eccitazione-contrazione).
Forniamo il ricercatore con un protocollo passo dopo passo, un elenco di soluzioni ottimizzate, approfondite istruzioni per preparare l'attrezzatura necessaria e una completa guida sulla risoluzione dei problemi. Mentre l'implementazione iniziale della procedura potrebbe essere piuttosto difficile, un efficace adattamento permetterà al lettore di eseguire isolamenti di ACM di state-of-the-art in un modello del ratto di MetS-relative HFpEF per un ampio spettro di esperimenti.
Introduzione
MetS descrive un cluster di fattori di rischio per diabete mellito tipo 2 e malattie cardiovascolari e include un aumento della pressione sanguigna arteriosa, dislipidemia (trigliceridi di sollevato e abbassato il colesterolo della lipoproteina ad alta densità), aumentato il digiuno glucosio e l'obesità centrale1. La prevalenza in tutto il mondo dei MetS è stimata essere di 25 – 30% e costantemente aumentante2. HFpEF è una sindrome clinica eterogenea, spesso associata a MetS. Il rimodellamento cardiaco durante HFpEF e le sue fasi precedenti (cioè, cardiopatia ipertensiva) è accompagnato anche da un rimodellament....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico locale (TVA T0060/15 e T0003-15) ed eseguiti in accordo con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Institute of Health, U.S.A).
Nota: Un diagramma di flusso della procedura semplificata è illustrato nella Figura 1.
1. predisposizioni
- Preparare i buffer secondo la tabella 1.
| Soluzione | PB |
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Risultati
A 21 settimane di età, 60 – 90% di vitali ACMs (stimato come descritto al punto 6.1), dopo il riadattamento del calcio (passo 5.4 – 5,7), possono essere isolati dai ratti obesi ZSF-1 da questo metodo (Figura 4A). Nei ratti, ACMs sono caratterizzati da una diversa e più fenotipo eterogeneo rispetto al sistema VCMs24,25. Figura 4B Mostra un ACM individuali con membrane cons.......
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Discussione
Qui, abbiamo descritto prima un protocollo per l'isolamento di singole cellule ACMs da un modello del ratto di MetS-correlati HFpEF che mostra contrassegnato rimodellamento atriale22. La procedura è in modo univoco impegnativa come eccessivo tessuto adiposo può rendere la preparazione chirurgica, nonché l'inserimento di una canula dell'aorta, sempre più difficile. La guida alla risoluzione forniti in tabella 2 indirizzi i problemi più comuni della procedura di isolamento.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da DZHK (centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, D.B.), EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) e da BMBF (Ministero tedesco dell'istruzione e della ricerca), così come la Bosnia-Erzegovina-Charité scienziato clinico programma finanziato della Charité - Universitätsmedizin Berlin e Berlin Institute of Health (F.H.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ZSF-1 Ratto obeso | Charles River Laboratories, Inc. | Forbici | |
| per iride fini | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Ropeps (curvo, seghettato) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Pinze per tessuti (dritte, 1 x 2 denti) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Pinze da legatura (angolate) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Ghigliottina per roditori e piccoli animali | Kent Scientific Corp. | Camera | |
| a basso costo 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Set per infusione con ali a farfalla 21 G | Hospira, Inc. | ||
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Ago ipodermico | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modificare l'ago per fare la cannula |
| Braun Original Perfusor Siringa 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Siringa 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Becher 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Piastra di Petri Duroplan (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Sutura Seraflex USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR monouso Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| in polistirolo | |||
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Sigma-Aldrich, Inc. | ||
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-butandione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Soluzione di cloruro di calcio (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Eparina | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurano) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminina da Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma murino membrana basale | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo piatto con fondo in vetro 500µ l 0,005 mm | WillCo Wells BV | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µ M per 20 minuti presso RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µ M per 45 min a 37 gradi C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM per 30 min a 37 gradi C |
| Recipiente di reazione incamiciato 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Recipiente di reazione incamiciato 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Trappola per bolle incamiciata | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED termostati a circolazione | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 pompa peristaltica | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Termometro 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscopio | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Software di imaging ZEN 2.3 | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Controller riscaldatore a canale singolo TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| Sistema di perfusione a 8 canali | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| Riscaldatori per soluzioni in linea multilinea a 8 canali | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
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