Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

Summary

Mitophagy, la degradazione selettiva dei mitocondri, è stato implicato nell'omeostasi mitocondriale ed è liberalizzato in varie malattie umane. Tuttavia, convenienti metodi sperimentali per misurare l'attività di mitophagy sono molto limitati. Qui, forniamo un test sensibile per misurare l'attività di mitophagy mediante citometria a flusso.

Abstract

Mitophagy è un processo di rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati o non necessari utilizzando macchinari di autofagia. Stretti legami sono state trovate fra mitophagy difettoso e varie malattie umane, tra cui le malattie neurodegenerative, cancro e malattie metaboliche. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che mitophagy è coinvolto nei processi cellulari normali, quali la differenziazione e lo sviluppo. Tuttavia, il ruolo preciso di e meccanismi molecolari alla base di mitophagy richiedono ulteriore studio. Pertanto, è fondamentale per sviluppare un metodo robusto e conveniente per misurare i cambiamenti nell'attività di mitophagy. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per valutare quantitativamente mitophagy attività tramite citofluorimetria usando la proteina fluorescente mitocondrio-mirati Keima (mt-Keima). Questa analisi di citometria a flusso è in grado di analizzare più rapidamente e con sensibilità rispetto ai metodi convenzionali di microscopia o immunoblotting basato mitophagy attività. Questo protocollo può essere applicato per analizzare l'attività di mitophagy in vari tipi cellulari.

Introduction

I mitocondri sono organelli che sono essenziali per la fisiologia e la proliferazione delle cellule. I mitocondri sono responsabili della generazione più dell'80% del rifornimento di ATP tramite fosforilazione ossidativa, e forniscono anche vari intermedi metabolici per biosintesi e metabolismo^1,2. Oltre ai loro ruoli nella fornitura di energia e metabolismo, i mitocondri giocano un ruolo centrale in molti altri processi importanti, tra cui la generazione di specie (ROS) reattive dell'ossigeno, nella regolazione della morte cellulare e intracellulare Ca^{2 +} dynamics³ . Le alterazioni nella funzione mitocondriale sono state associate con malattie umane, compreso il cancro, diabete mellito e vari neurodegenerative malattie^4,5. Aumentata la disfunzione mitocondriale e mutazioni del DNA mitocondriale sono anche pensate di contribuire ai processi di invecchiamento normale^6,7,8. Di conseguenza, il controllo di qualità è una questione cruciale in mitocondri. I mitocondri sono organelli altamente dinamici che possono continuamente cambiare la loro forma tra reti allungate e forma breve, frammentato. Dinamiche di mitocondri svolge un ruolo importante nel mantenimento della funzione dei mitocondri, come pure la loro degradazione attraverso mitophagy⁹.

Mitophagy è un meccanismo che coinvolge la degradazione selettiva dei mitocondri interi utilizzando le macchine di autofagia. Mitophagy è il meccanismo di principio sottostante fatturato mitocondriale e la rimozione dei mitocondri danneggiati o disfunzionale. In questo processo, i mitocondri sono in primo luogo circondati da una membrana, causando la formazione di autofagosomi, che poi si fondono con i lisosomi per degradazione idrolitica⁹. Precedenti studi genetici in Drosophila hanno suggerito che due geni legati al morbo di Parkinson, indotta da PTEN putativa chinasi 1 (PINK1) (PARK6) e parkina (PARK2), funzionare nella stessa via^10,11. Sottosequenza studi hanno dimostrato che la via di PINK1-Parkin è responsabile per l'eliminazione dei mitocondri danneggiati e difetti in questo risultato di percorso in mitophagy disfunzionali e può contribuire a malattie umane^12,13. Difetti nei processi di mitophagy recentemente sono stati trovati in varie malattie umane, compreso il cancro, malattie cardiache, malattie del fegato e neurodegenerative malattia ¹⁴. Inoltre, recenti studi hanno inoltre dimostrato che mitophagy è fondamentale per molti processi fisiologici, quali la risposta immunitaria^{15,16,17,18, sviluppo e differenziazione ,19}, suggerendo che mitophagy può svolgere un ruolo più attivo nel controllare le funzioni delle cellule.

Nonostante la recente conferma che mitophagy svolge un ruolo importante nel controllo di qualità sia nei mitocondri e malattia umana, i meccanismi molecolari sottostanti mitophagy rimangono mal capito. Anche se meccanismi mitophagy-relativi sono stati studiati sistematicamente in lievito, studi volti a esplorare meccanismi correlati mitophagy in cellule di mammifero sono concentrati principalmente sulla via di PINK1-Parkin. Precedenti studi hanno stabilito che la via di PINK1-Parkin è principalmente responsabile per la rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati via mitophagy^12,20,21. Tuttavia, studi recenti hanno riferito che in alcuni modelli, può essere attivato anche in assenza del funzionale PINK1^22,23,24mitophagy. Questi risultati indicano che oltre la via di PINK1-Parkin, lì un percorso aggiuntivo non identificato che può attivare mitophagy.

L'assenza di un metodo pratico per valutare l'attività mitophagy è un ostacolo importante a esplorare le vie che regolano mitophagy e il suo ruolo in eventi patofisiologici. La microscopia elettronica è uno strumento potente per visualizzare direttamente i mitocondri autofagosoma-inghiottito. Tuttavia, la microscopia elettronica ha limitazioni nella quantificazione mitophagy attività. Anche se le strategie che utilizzano microtubule-associated protein-1 luce catena 3 (LC3)-coniugati sonde fluorescenti, come GFP-LC3, sono attualmente i più diffusi approcci²⁵, la natura transitoria del segnale basato su LC3 e suo alto tasso di falsi positivi segnali limitano la sua sensibilità per la rilevazione mitophagy in cellule²⁶. Una combinazione di western blotting per misurare il livello di proteina mitocondriale, la quantificazione di DNA mitocondriale e analisi di microscopia di fluorescenza per colocalize mitocondri con autofagosomi o lisosomi sarebbe un buon approccio per la valutazione mitophagy. Tuttavia, limiti di quantificazione e una mancanza di convenienza delle metodologie esistenti richiedono nuovi approcci. L'introduzione di una nuova proteina fluorescente pH-dipendente, l'obiettivo mitocondriale Keima (mt-Keima), ha notevolmente migliorato la capacità di rilevare mitophagy²⁷. Fondendo la sequenza mitocondriale-targeting di citocromo c ossidasi secondaria VIII (COX VIII) in Keima, mt-Keima è diretto alla matrice mitocondriale. Il grande cambiamento nel picco di eccitazione di Keima da 440 nm a 586 nm (corrispondente a pH 7 e pH 4, rispettivamente) possono essere utilizzati per valutare mitophagy con buona sensibile in sia in vitro che in vivo esperimenti^28,29 . Ancora più importante, la resistenza di mt-Keima a degradazione lisosomiale causa l'integrazione del segnale del mt-Keima nei lisosomi, consentendo la facile misurazione quantitativa dell'attività mitophagy. La variazione di fluorescenza che si verifica in mt-Keima flusso cytometry^28,29o possa essere analizzata usando sia la microscopia confocal. Tuttavia, un metodo basato su citometria a flusso per misurare l'attività di mitophagy utilizzando mt-Keima non è stato fornito in dettaglio fino ad oggi.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per una tecnica di base di cytometry di flusso per misurare l'attività di mitophagy in cellule utilizzando mt-Keima. Anche se vi abbiamo mostrato qui che l'analisi di citometria a flusso rilevato con successo mitophagy CCCP-indotta in cellule HeLa esprimendo Parkin, questa tecnica può essere applicata a una vasta gamma di tipi di cellule.

Protocol

1. generazione di cellule HeLa esprimendo mito-Keima (mt-Keima)

1. Preparazione di mt-Keima lentivirus
   1. Ricoprire una piastra di coltura 100 mm con l'aggiunta di 2 mL di 0,001% poly-L-lisina/tampone fosfato salino (PBS) e lasciare riposare per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina usando una pipetta di vetro collegata ad un vuoto e lavare la piastra di coltura con l'aggiunta di 2 mL di 1X PBS.
   3. Piastra a 1,5 x 10⁶ HEK293T cellule sulla cultura rivestito piatto con 10 mL di DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina e cultura le cellule a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto di CO₂ per un giorno.
   4. Transfect 2 µ g di mt-Keima lentivirali plasmide²⁹ DNA insieme imballaggio DNAs (psPAX 2 µ g e pVSVG 0,25 µ g) utilizzando un reagente di transfezione per 8 h secondo le istruzioni del produttore.
   5. Rimuovere il supporto di transfezione e aggiungere 8 mL di terreno fresco.
   6. Raccogliere i supporti contenenti particelle virali 48 ore più tardi. Rimuovere i detriti cellulari da parte dei media raccolti mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min e filtrare con un filtro per siringa da 0,45 µm.
      Nota: Per uso a lungo termine, rendere le aliquote di particelle lentivirali e conservare i campioni a-80 ° C. Evitare di sottoporre i campioni virali per cicli per infezione virale efficiente di gelo-disgelo.
2. Infettare le cellule HeLa-Parkin con mt-Keima lentivirus
   1. Cellule HeLa⁴ piastra 5x10 esprimendo Parkin (HeLa-Parkin) in una piastra di coltura di 60 mm con 4 mL di DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina a 37 ° C un giorno prima della raccolta i lentivirus mt-Keima.
      Nota: A causa dell'assenza di espressione endogena di Parkin in HeLa cellule³⁰, le cellule HeLa-Parkin usate qui per più chiaramente Visualizza CCCP-indotto mitophagy. Questa procedura può essere applicata anche ad altre linee cellulari immortalizzate o primario.
   2. Rimuovere il mezzo di crescita il giorno successivo e aggiungere 1 mL di mt-Keima lentivirali media. Aggiungere un ulteriore 2 mL di terreno di coltura contenente 3 µ l di soluzione madre polybrene (8 mg/mL in acqua distillata). Incubare per un giorno in un incubatore a CO₂ coltura del tessuto.
   3. Rimuovere la miscela lentivirali mt-Keima il giorno successivo e lavare le cellule due volte con PBS 1X. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura e trattare le cellule con 2 con puromicina µ g/mL per due giorni.
   4. Dopo due giorni di selezione con puromicina, rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule due volte con PBS 1x 1. Aggiungere mezzo di sviluppo e cultura le cellule in un incubatore a CO₂ fino all'utilizzo.
      Nota: Questo metodo può essere applicato per generare cellule che esprimono stabilmente mt-Keima, nonché sulle altre linee cellulari e cellule primarie.

2. indurre mitophagy utilizzando CCCP trattamento e preparazione dei campioni di FACS

1. Piastra 5 x 10⁴ HeLa-Parkin cellule esprimendo mt-Keima in una cultura di 60 mm piatto con 4 mL di DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina e cultura li per un giorno a 37 ° C in un incubatore a CO₂ coltura del tessuto.
2. Rimuovere il mezzo di crescita il giorno successivo e aggiungere 4 mL di fresco DMEM contenente 10 µM Carbonil cianuro m-chlorophenylhydrazone (CCCP). Incubare le cellule HeLa-Parkin-mt-Keima in incubatore a CO₂ tessuto per 6 h.
3. Rimuovere il mezzo di crescita 6 ore più tardi e lavare le cellule con 2 mL di PBS 1X. Staccare le cellule trattandole con soluzione di tripsina/EDTA e inattivare la tripsina aggiungendo terreno di coltura contenente 10% FBS. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.
4. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min.
5. Rimuovere il mezzo di crescita dall'aspirazione con cautela e risospendere le cellule con 1 mL di PBS 1X freddo.
6. Trasferire le cellule nella provetta FACS appropriata e posizionarlo sul ghiaccio.
   Nota: Preparare le cellule HeLa non infette come controllo negativo.
   Nota: Le cellule sono vitali sul ghiaccio per diverse ore, e segnali di fluorescenza mt-Keima anche rimangano stabili.

3. analisi FACS di mitophagy

Nota: In questo studio, le cellule sono state analizzate con un citometro a flusso dotato di un laser 405 nm e 561 nm. Le cellule erano eccitate con un laser violetto (405 nm) con emissione rilevato a 610 nm ± 10 con un rilevatore di BV605 e con un laser di colore giallo-verde (561 nm) con emissione rilevato a 610 nm ± 10 da un rivelatore di PE-CF594 contemporaneamente (Figura 1).

1. Gating di cellule vive
   1. Accendere il citofluorimetro e il computer e accedere al software di analisi.
   2. Generare un nuovo esperimento o duplicare un esperimento esistente. Per eccitare le cellule con il violetto (405 nm) e giallo-verde (561 nm) laser e rilevare emissioni a 610 rilevatore di nm ± 10, selezionare BV605 e PE-CF594 oltre a forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) nella finestra di parametro come richiesto fluorofori.
      Nota: Tutti i fluorophores deve essere aggiunto in un modo lineare.
   3. Vortex ciascun campione cellulare brevemente per disperdere cella aggrega.
   4. Collocare la provetta contenente un campione di cellule di controllo HeLa-Parkin che non è infetto con mt-Keima lentivirus sulla porta di iniezione del campione e premere il pulsante "eseguire" il citometro.
   5. Nella trama puntino del FSC vs SSC, regolare la tensione FSC e SSC per posizionare le cellule al centro della trama del puntino.
   6. Disegnare un cancello P1 utilizzando l'icona del poligono intorno cellule vive ed eliminare le cellule morte e detriti cellulari (Figura 2A).
2. Regolare le tensioni per laser violetto e verde
   1. Collocare la provetta contenente cellule HeLa-Parkin infettate con mt-Keima lentivirus sull'iniezione del campione di porta e premere il pulsante "eseguire" il citometro.
   2. Nella trama del puntino di BV605 (405 nm) contro SSC, regolare la tensione di BV605 in modo che le cellule HeLa-Parkin esprimendo mt-Keima vengano tenuti chiaramente distinte dalle cellule di controllo che non esprimono mt-Keima (Figura 2B).
   3. Nella trama del puntino di PE-CF594 (561 nm) contro SSC, regolare la tensione PE-CF594 in modo che le cellule HeLa-Parkin esprimendo mt-Keima vengano tenuti chiaramente distinte dalle cellule di controllo (Figura 2B).
3. Valutare la percentuale di cellule in mitophagy
   1. Acquisire il BV605 contro PE-CF594 trama di dot utilizzando una scala lineare. Disegnare un cancello utilizzando l'icona del poligono intorno le cellule che esprimono mt-Keima ed eliminare le cellule non esprimono mt-Keima (Figura 3A). La popolazione di fluorescenza-positiva delle cellule mt-Keima è riferita come il cancello "mt-Keima".
   2. Creare un altro puntino trama di BV605 versus PE-CF594 mostrando solo "mt-Keima"-gated cellule. In questa trama di dot, disegnare un cancello intorno le cellule non trattate di mt-Keima-positivo. L'attività basale mitophagy di controllo HeLa cells è basso, e il rapporto di emissione a PE-CF594/BV605 è minore di 1. Così, questa porta è denominata il cancello "basso".
   3. Disegnare un altro cancello che contengono la regione sopra del cancello "basso". Questo cancello si riferisce a come "alto" cancello perché contiene cellule con attività di alta mitophagy, vale a dire le cellule con un alto rapporto di emissione a PE-CF594/BV605 (Figura 3B).
   4. Per calcolare la percentuale di cellule nel cancello "alta", selezionare il menu "Visualizza gerarchia di popolazione". Il valore "% del padre" (% padre) rappresenta la percentuale di cellule nel cancello "alta" tra la popolazione di mt-Keima-positivo.
   5. Impostare almeno 10.000 eventi per registrare nel "mt-Keima" arresto cancello ed eseguire ogni esempio.

Results

Nella Figura 4è riportato un esempio dell'analisi di citometria a flusso di mitophagy CCCP-indotta in cellule HeLa-Parkin. Utilizzando il metodo di analisi di citometria a flusso sopra descritto, possiamo rilevare un aumento drammatico nelle cellule mitophagic nel cancello "alta". La percentuale di cellule nel cancello "alta" è stata aumentata di più di 10 volte rispetto alle cellule non trattate di controllo (Figura 4A). Questo ...

Discussion

Qui, presentiamo un metodo veloce e sensibile per mediante citometria a flusso per misurare l'attività cellulare mitophagy in cellule che esprimono mt-Keima. Le cellule che subiscono un elevato livello di mitophagy presentano un rapporto aumentato di PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) eccitazione. Quindi, mitophagy attività può essere espresso come la percentuale di cellule che esibiscono un alto rapporto di 561/405. Abbiamo calcolato la percentuale delle cellule della regione "alto" cancello su un terreno di puntino di ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
penicillina/streptomicina	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermos scientifico	R0531
0.45 μ m filtro per siringa	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polibrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromicina	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Cianuro di carbonile m-clorofenil idrazina (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
tripsina-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)