Mitophagy, la degradazione selettiva dei mitocondri, è stato implicato nell'omeostasi mitocondriale ed è liberalizzato in varie malattie umane. Tuttavia, convenienti metodi sperimentali per misurare l'attività di mitophagy sono molto limitati. Qui, forniamo un test sensibile per misurare l'attività di mitophagy mediante citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mitophagy è un processo di rimozione selettiva dei mitocondri danneggiati o non necessari utilizzando macchinari di autofagia. Stretti legami sono state trovate fra mitophagy difettoso e varie malattie umane, tra cui le malattie neurodegenerative, cancro e malattie metaboliche. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che mitophagy è coinvolto nei processi cellulari normali, quali la differenziazione e lo sviluppo. Tuttavia, il ruolo preciso di e meccanismi molecolari alla base di mitophagy richiedono ulteriore studio. Pertanto, è fondamentale per sviluppare un metodo robusto e conveniente per misurare i cambiamenti nell'attività di mitophagy. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per valutare quantitativamente mitophagy attività tramite citofluorimetria usando la proteina fluorescente mitocondrio-mirati Keima (mt-Keima). Questa analisi di citometria a flusso è in grado di analizzare più rapidamente e con sensibilità rispetto ai metodi convenzionali di microscopia o immunoblotting basato mitophagy attività. Questo protocollo può essere applicato per analizzare l'attività di mitophagy in vari tipi cellulari.
Introduzione
I mitocondri sono organelli che sono essenziali per la fisiologia e la proliferazione delle cellule. I mitocondri sono responsabili della generazione più dell'80% del rifornimento di ATP tramite fosforilazione ossidativa, e forniscono anche vari intermedi metabolici per biosintesi e metabolismo1,2. Oltre ai loro ruoli nella fornitura di energia e metabolismo, i mitocondri giocano un ruolo centrale in molti altri processi importanti, tra cui la generazione di specie (ROS) reattive dell'ossigeno, nella regolazione della morte cellulare e intracellulare Ca2 + dynamics3 . Le alte....
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Protocollo
1. generazione di cellule HeLa esprimendo mito-Keima (mt-Keima)
-
Preparazione di mt-Keima lentivirus
- Ricoprire una piastra di coltura 100 mm con l'aggiunta di 2 mL di 0,001% poly-L-lisina/tampone fosfato salino (PBS) e lasciare riposare per 5 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina usando una pipetta di vetro collegata ad un vuoto e lavare la piastra di coltura con l'aggiunta di 2 mL di 1X PBS.
- Piastra a 1,5 x 106 HEK293T cellule sulla cultura rivestito piatto con 10 mL di DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina e cultura le cellule a 37 ° C in un incuba....
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Risultati
Nella Figura 4è riportato un esempio dell'analisi di citometria a flusso di mitophagy CCCP-indotta in cellule HeLa-Parkin. Utilizzando il metodo di analisi di citometria a flusso sopra descritto, possiamo rilevare un aumento drammatico nelle cellule mitophagic nel cancello "alta". La percentuale di cellule nel cancello "alta" è stata aumentata di più di 10 volte rispetto alle cellule non trattate di controllo (Figura 4A). Questo .......
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Discussione
Qui, presentiamo un metodo veloce e sensibile per mediante citometria a flusso per misurare l'attività cellulare mitophagy in cellule che esprimono mt-Keima. Le cellule che subiscono un elevato livello di mitophagy presentano un rapporto aumentato di PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) eccitazione. Quindi, mitophagy attività può essere espresso come la percentuale di cellule che esibiscono un alto rapporto di 561/405. Abbiamo calcolato la percentuale delle cellule della regione "alto" cancello su un terreno di puntino di .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (di J. U.) e dalla National Research foundation di Corea (NRF) sovvenzione finanziati dalla government(MSIT) di Corea (n. 2016R1A2B2008887, n. 2016R1A5A2007009) (a J.Y. .)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillina/streptomicina | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Turbofect | Thermos scientifico | R0531 | |
| 0.45 μ m filtro per siringa | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polibrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromicina | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Cianuro di carbonile m-clorofenil idrazina (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| tripsina-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
Riferimenti
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
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Ristampe e permessi
