Un anione cambio metodo a base di resine, adattato a liquido basato su urto bioaerosol campionamento dei virus è dimostrato. Quando accoppiato con rilevazione molecolare a valle, il metodo consente facile e sensibile di rilevazione di virus da bioaerosols.
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Articolo metodologico
Rilevamento di virus da Bioaerosols utilizzando resina a scambio anionico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo viene illustrato un metodo di campionamento di bioaerosol su misura per i virus. In questo sistema, resina a scambio anionico è accoppiata con dispositivi di prelievo di liquido aria basati su urto efficace concentrazione di virus caricati negativamente da bioaerosols. Così, la resina serve come un passo ulteriore concentrazione del flusso di lavoro di bioaerosol campionamento. Estrazione di acidi nucleici delle particelle virali viene quindi eseguita direttamente dalla resina a scambio ionico, con il campione risultante adatto per analisi molecolari. Inoltre, questo protocollo descrive una camera di bioaerosol su misura in grado di generare carichi di virus bioaerosols sotto una varietà di condizioni ambientali e consentendo per il monitoraggio continuo di variabili ambientali quali temperatura, umidità, velocità del vento e concentrazione di massa di aerosol. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo protocollo è aumento della sensibilità di rilevazione virale, come valutato tramite confronto diretto a un impinger liquido convenzionale non modificato. Altri vantaggi includono la possibilità di concentrare diversi virus caricati negativamente, il basso costo di resina a scambio anionico (~$0.14 per esempio) e la facilità d'uso. Gli svantaggi includono l'impossibilità di questo protocollo per valutare infettività delle particelle virali resina-adsorbito e potenzialmente la necessità per l'ottimizzazione del buffer campionamento liquido utilizzato all'interno del gorgogliatore.
Introduzione
Lo scopo di questo metodo è quello di fornire una piattaforma di campionamento di bioaerosol altamente sensibile per facilitare la rilevazione molecolare del virus caricati negativamente da bioaerosols. Microrganismi, tra cui particelle virali, possono sopravvivere in bioaerosols per lunghi periodi di tempo1. Bioaerosols può viaggiare su distanze relativamente lunghe e mantenere la vitalità e l'infettività, come evidenziato da un focolaio di malattia dei Legionari che ha provenuto da torri si trova ad una distanza di 6 km da individui commoventi di raffreddamento industriale e ha provocato 18 vittime2. Trasmissione indiretta del virus agli esseri umani mediati da bioaerosols può verificarsi in diverse impostazioni ed è stato dimostrato per focolai di norovirus in scuole e ristoranti3,4. Allo stesso modo, bioaerosol trasmissione di virus può verificarsi in ambienti agricoli come negli allevamenti di suini e pollame, con questo itinerario di trasmissione viene considerato come un fattore importante nel movimento di virus tra produzione strutture5, 6 , 7 , 8 , 9.
Campionamento effettiva di carichi di virus bioaerosols consente un miglioramento nella diagnosi rapida e la preparazione per la prevenzione di scoppio, come mostrato nelle dimostrazioni in cui H5 dell'influenza un virus sono stati rilevati da bioaerosols in animale vivo mercati in Cina e la Stati Uniti10,11. Le attuali tecnologie di campionamento di bioaerosol implicano una serie di principi di cattura delle particelle differenti e possono essere categorizzate largamente in gorgogliatori, cicloni, simulazione e filtri12. Esula dall'ambito di questo protocollo per coprire esaustivamente tutti i vantaggi e gli svantaggi di queste piattaforme per il campionamento di virus da bioaerosols; Tuttavia, si può affermare che la maggior parte di questi dispositivi di campionamento non è stata ottimizzata per la raccolta di virus e batteriofagi13. Inoltre, infettività delle particelle virali è spesso negativamente colpiti, con liquidi gorgogliatori considerati per mantenere più efficacemente di campionamento dispositivi come dispositivi d'urto o filtri solido14infettività virale. Tuttavia, uno svantaggio di urto liquido è l'effetto di diluizione di destinazione, che si verifica perché i virus sono raccolti in volumi relativamente grande (in genere ≥ 20 mL) di liquido nel recipiente di raccolta. Un altro svantaggio importante coinvolge l'efficienza suboptimale di liquidi gorgogliatori di concentrare le particelle < 0,5 µM in dimensioni15. Tuttavia, l'efficienza di cattura di questi dispositivi può essere migliorata tramite immobilizzazione su matrici solide, come immobilizzazione può migliorare la conservazione degli acidi nucleici virali e infettività virale16,17.
Precedentemente abbiamo dimostrato che la resina a scambio anionico è uno strumento efficace per la cattura e la concentrazione di virus da matrici liquide, tra cui F-RNA batteriofagi, virus dell'epatite A, adenovirus umano e rotavirus18,19 ,20. Come definito dal costruttore, la resina a scambio anionico utilizzata in questo lavoro è una resina a scambio macroreticolari polistirene anionica altamente basica in cui funzionalizzati ammine quaternarie gruppi mediare attrazione e cattura di anioni in un liquido medio21 . Di conseguenza, la resina a scambio anionico è previsto di catturare i virus con cariche di superficie net-negativi, tra cui molti virus enterici, virus influenzali e altri virus rilevanti per la salute pubblica e degli animale.
Il protocollo attuale prevede l'aggiunta di resina a scambio anionico per un impinger liquido. In questo sistema, la resina serve come un passo di concentrazione secondaria per particelle virali catturato nel liquido gorgogliatore. Acidi nucleici può quindi essere eluiti direttamente in piccoli volumi, fornendo un campione concentrato per analisi molecolari. Così, il vantaggio principale di questo metodo è il miglioramento della sensibilità di rilevazione virale, principalmente attraverso la riduzione del volume del campione. Inoltre, a causa della cattura non specifico inerente di virus caricati negativamente, è probabile che il metodo applicabile per il rilevamento di un gran numero di virus di interesse. Qui, il metodo è dimostrato per i ceppi di vaccino del virus dell'influenza di tipo B e tipo A e il coliphage FRNA MS2 (MS2). Questi virus vengono successivamente rilevati tramite analisi standard qRT-PCR come descritto in precedenza22. L'utente finale non deve aspettarsi di incontrare difficoltà nell'esecuzione di questo metodo, perché le modifiche attualmente esistenti attrezzature non costituiscono gravi perturbazioni al flusso convenzionale di bioaerosol campionamento e analisi.
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Protocollo
1. installazione della camera Bioaerosol (Vedi Figura 2)
-
Pre-caricare i liquidi gorgogliatori con 20 mL di 0,01 M tamponato fosfato salino, pH 7.5 (PBS).
- Aggiungere 0,5 g di resina a scambio anionico e sospendere entro il PBS di uno dei gorgogliatori liquidi, con un altro liquido impinger che serve come controllo.
- Gorgogliatori liquidi posizione in parallelo all'interno della camera di bioaerosol utilizzando il morsetto stand con insenature di aerosol nebulizzatore di fronte.
Nota: Vedere la Figura 2 per ulteriori dettagli. - Co-individuare un monitor di lettura diretta aerosol vicino i liquidi gorgogliatori per misurare la concentrazione di massa (mg/m3) del bioaerosol.
- Co-localizzare strumentazione aggiuntiva a lettura diretta (anemometro monitor e thermal qualità di aria interna) vicino i liquidi gorgogliatori per monitorare le variabili ambientali, quali temperatura, umidità e vento velocità, all'interno della camera di bioaerosol.
- Eseguire ventilatori assiali negli angoli della camera di bioaerosol per facilitare la miscelazione di aerosol.
Nota: Ventilatori assiali eseguire ad una velocità fissa e non sono regolabili.
2. modello Bioaerosolization esperimenti (Vedi Figura 3)
- Eseguire serial, 10 volte diluizioni di MS2 batteriofago e l'influenza vaccino a concentrazioni desiderate in tampone fosfato salino (PBS).
Nota: Per dimostrare il metodo qui, 103.5 FFU/mL di ceppi di vaccino tipo A e B dell'influenza virus e 105 PFU/mL del batteriofago MS2 vengono utilizzati. Per determinare i titoli per gli inoculi, batteriofagi sono propagati in Escherichia coli HS (pFamp) R ed enumerati come descritto in precedenza20. Il vaccino commerciale contiene quantità note di quattro ceppi di virus dell'influenza attenuato dal vivo, due di tipo un virus dell'influenza e due virus dell'influenza di tipo B, espresso in unità fluorescenti attenzione o FFU. - Preparare inoculi all'interno del vaso di vetro di un nebulizzatore jet a 6 collisione creando sospensioni di desiderato concentrazioni di particelle virali in 100 mL di PBS e installare all'interno della camera di bioaerosol personalizzato.
- Avviare la strumentazione per misurare le variabili all'interno della camera di bioaerosol, quali temperatura, umidità relativa %, concentrazione di anidride carbonica e vento (generato utilizzando un ventilatore assiale). Utilizzare un monitor di lettura diretta aerosol per tenere traccia di concentrazione di massa all'interno della camera di bioaerosol e assicurare la coerenza all'interno e tra le prove.
- Tenuta la camera di bioaerosol e spurgo per 10 min con aria filtrata HEPA.
- Fornire aria secca e filtrata al nebulizzatore operanti a 6,9 kPa.
- Generare una concentrazione target di bioaerosols virale (tramite nebulizzatore) in ogni camera di bioaerosol prova. Per questa dimostrazione, vengono generati bioaerosols con una concentrazione di 5 mg/m3 .
- Una volta raggiunta la concentrazione di massa di destinazione dell'aerosol, smettere di nebulizzazione.
- Far funzionare una pompa di campionamento aria per ogni impinger liquido che è stato calibrato per una portata di 12,5 L/min calibrazione condotta utilizzando uno standard di flusso primario prima e dopo ogni evento di campionamento per garantire la coerenza in volume di campionamento. Diluizione di alimentazione aria utilizzando una linea filtrata HEPA situata vicino il nebulizzatore e mantenere costante la pressione nella camera.
- Attivamente di assaporare l'atmosfera di camera di bioaerosol per un periodo di 40 min per raggiungere un volume di campionamento di 500 L per campione.
Nota: Campionamento per 40 min a 12,5 L/min con due pompe in parallelo permette per il campionamento di 1.000 L del bioaerosol. Così, al termine dell'esperimento, si prevede che la maggior parte dell'aria presente nella camera di bioaerosol è stata provata e rilasciata nell'ambiente tramite un sistema di filtraggio HEPA. Ciò è dimostrato dalla diminuzione di concentrazione di particelle. Post-esperimento, le superfici vengono decontaminate con etanolo al 10% della famiglia candeggina e 70%. Gli indicatori sono utilizzati in questa dimostrazione; Tuttavia, se noti organismi patogeni vengono utilizzati in questo sistema, biosicurezza ulteriori misure possono essere attuate secondo le necessità.
3. acido nucleico estrazione e qRT-PCR Detection
-
Isolare gli acidi nucleici direttamente da resina a scambio anionico e, a fini comparativi, dal liquido utilizzato all'interno del liquidi gorgogliatori. In questo esempio, una procedura di isolamento del RNA è descritto, ma un protocollo simile potrebbe essere utilizzato per virus a DNA.
- Isolamento dell'acido nucleico dalla resina a scambio anionico.
- Trasferire tutto il liquido contenenti resina scambio anionico del gorgogliatore liquido in una provetta conica sterile 50 mL.
- Lasciare che la resina di stabilirsi e decantare lentamente il campione liquido dalla resina a scambio anionico. Utilizzare una pipetta da 1 mL per rimuovere tutto il liquido restante dalla resina a scambio anionico.
- Da un kit di isolamento di RNA virale, 560 µ l di tampone di lisi virale contenente RNA di operatore per la resina a scambio anionico e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con miscelazione periodica.
- Utilizzando la punta di una pipetta da 1 mL, trasferire il virale lisato (il buffer di lisi virale) a una sterile mL 1,5 conico tubo e procedere con RNA kit isolamento tramite un isolamento di RNA virale (Vedi Tabella materiali) conformemente alle istruzioni del produttore, ad eccezione che RNA viene eluito in un volume totale di 60 µ l di tampone di eluizione.
- Isolamento dell'acido nucleico da liquidi gorgogliatori.
- Pipettare 140 µ l del campione liquido in una provetta conica sterile 1,5 mL ed eseguire l'isolamento del RNA usando il kit di isolamento di RNA virale in conformità alle istruzioni del produttore, con l'eccezione di eluizione RNA in un volume totale di 60 µ l di tampone di eluizione.
Nota: 140 µ l è il volume di campione massimo che può essere elaborato con il kit di isolamento RNA virale specifico impiegato qui in un'unico passaggio preparazione.
- Pipettare 140 µ l del campione liquido in una provetta conica sterile 1,5 mL ed eseguire l'isolamento del RNA usando il kit di isolamento di RNA virale in conformità alle istruzioni del produttore, con l'eccezione di eluizione RNA in un volume totale di 60 µ l di tampone di eluizione.
- Isolamento dell'acido nucleico dalla resina a scambio anionico.
- Eseguire qRT-PCR per la rilevazione di MS2 e dell'influenza A e B virus come descritto in precedenza23,24. In questa dimostrazione, 5 µ l di acido nucleico eluati sono utilizzati per qRT-PCR.
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Risultati
Figura 1 viene illustrato il principio dietro basati su carica cattura di virus da bioaerosols tramite l'inclusione di resina a base liquida gorgogliatori. La figura 2 Mostra l'installazione della camera bioaerosol su misura. La figura 3 descrive i passaggi necessari a configurare l'esperimento di nebulizzazione e misure per garantire il controllo di qualità. La figura 4...
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Discussione
Questo protocollo descrive un metodo per cattura sensibile virale da bioaerosols utilizzando modificate liquidi gorgogliatori. Il metodo è ottimizzato per il rilevamento e la quantificazione della carica virale in bioaerosols. La modifica specifica dimostrata qui prevede l'aggiunta di resina a scambio ionico a liquido contenuto all'interno di un comune impinger liquido. Questo metodo è stato sviluppato per la sua semplicità nel trattamento dei campioni a valle, mentre altre tecniche di elaborazione del campione come cent...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dal CDC/NIOSH High Plains Intermountain centro agricolo di salute e sicurezza (5U54OH008085) e il Colorado Bioscience Discovery valutazione Grant Program (14BGF-16).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Escherichia coli batteriofago MS2 (ATCC 15597-B1) | Collezione di colture di tipo americano | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist AstraZeneca quadrivalente | Contatta | produttore | I componenti virali di questo vaccino sono soggetti a modifiche su base annua |
| CFX96 Touch Sistema di rilevamento PCR in tempo reale | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primer e sonde | Tecnologie DNA integrate | NA | |
| 0.2 µ M filtro sterile | NA | NA 1 | |
| L flaconi in pyrex o equivalente | NA | NA 1 | |
| mL puntali per pipetta | NA | NA 1 | |
| mL pipettatore | NA | NA | |
| 50 mL pipetta sierologica | NA | NA | |
| PROVETTE PER PCR | NA NA | Pipet-aid | |
| o equivalente | NA | NA | |
| Mini kit per RNA virale | QIAamp Kit RT-PCR per | 52904 | |
| Qiagen | 204443 | ||
| Amberlite IRA-900 forma cloruro | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Acqua (grado di biologia molecolare) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Provette per microcentrifuga Eppendorf DNA LoBind | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Provette per centrifuga coniche Falcon 50 mL | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Provette per centrifuga in polipropilene | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit con ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biocampionatore 20 mL, set di 3 bicchieri | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Pompe per campioni Vac-u-Go | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Nebulizzatore Collison (6 getti) | BGI Inc. | ||
| Capsula HEPA | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK Monitor della qualità dell'aria interna 8554 | TSI Inc. | ||
| Alnor velometro anemometro termico AVM440-A | TSI Inc. | ||
| SidePak AM510 monitor personale per aerosol | TSI Inc. | ||
| Camera per bioaerosol | NA | NA |
Riferimenti
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