Cellule enterocromaffini (EC) comprendono un piccolo sottoinsieme delle cellule epiteliali gastrointestinali. Dalle cellule EC sono elettricamente eccitabili e rilascio della serotonina, ancora difficoltà nella coltura e nell'identificazione di cellule EC hanno limitato gli studi fisiologici. Il metodo presentato qui stabilisce un modello di cultura primaria suscettibile di esame delle singole cellule EC di elettrofisiologia.
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Articolo metodologico
A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule enterocromaffini (EC) nell'epitelio gastrointestinale (GI) costituiscono la più grande sottopopolazione delle cellule enteroendocrine. Come le cellule sensoriali specializzate, cellule EC percepiscono stimoli luminal e convertono in eventi di rilascio di serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Tuttavia, l'elettrofisiologia di queste cellule è capito male perché sono difficili per cultura e per identificare. Il metodo presentato in questa carta contorni primaria CE, colture cellulari ottimizzati per elettrofisiologia singola cella. Questo protocollo utilizza un reporter transgenici ciano proteina fluorescente (CFP) per identificare le cellule di topo CE in colture miste di primarie, avanzando l'approccio per ottenere registrazioni di alta qualità di elettrofisiologia di tutta la cella in modalità di morsetto di tensione e di corrente.
Introduzione
L'epitelio gastrointestinale (GI) è una comunità variegata composta da diversi tipi di cellule. Le cellule enteroendocrine costituiscono circa 1% di tutte le cellule epiteliali e cellule enterocromaffini (EC) sono il più grande popolazione di cellule enteroendocrine1. Studi recenti dimostrano che ce3,4 cellule enteroendocrine2 e sono elettricamente eccitabili. Siamo interessati a capire primario elettrofisiologia cellulare di CE. Così, lo scopo di questo studio era di stabilire colture primarie di cellule CE ottimizzati per elettrofisiologia tutta la cella.
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Protocollo
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Mayo Clinic. La parte di cultura cellula primaria di questo protocollo è basata su metodi pubblicati in precedenza che è possibile fare riferimento per ulteriori dettagli10. Tutte le procedure sperimentali devono essere approvate da (IACUC), e tutti gli esperimenti devono essere eseguiti conformemente alle norme e linee guida pertinenti.
1. preparazione cultura
-
Media.
- Preparare terreni di coltura completo cella CE con alto glucosio per volta Eagle Medium (DMEM di [4500mg/....
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Risultati
Culture:
Cellule epiteliali murine primarie effettuate in un modello transgenico Tph1-CFP allegare ai piatti dopo 4 ore e sono pronte per esperimenti fisiologici tra 24-72 h. Quando le condizioni di coltura non avevano state ottimizzate, la coltura delle cellule epiteliali ha consistito di grandi ciuffi, galleggiante di detriti cellulari, membrane danneggiate e segnale debole di PCP nelle cellule CE (Figura 1A). Culture ch.......
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Discussione
Comprendere appieno la funzione delle cellule CE richiede un metodo di coltura primaria di alta qualità per generare cellule per elettrofisiologia tutta la cella. Colture primarie di epitelio GI erano stata tradizionalmente difficile dovuto la bassa sopravvivenza. Alleviare questo fattore di confusione, il presente metodo produce colture di cellule EC singolare dall'intestino sia piccolo o grande che sono in grado di sopravvivere per diversi giorni.
Abbiamo trovato che erano critici per miglio.......
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Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la signora Lyndsay Busby per l'assistenza amministrativa e Mr. Robert Highet Mayo il clinica divisione di ingegneria per la progettazione e la stampa 3D dell'inserto piatto cultura. Questo lavoro è stato supportato da NIH K08 AB (DK106456), pilota e fattibilità Grant a AB da Mayo Clinic Center per la segnalazione delle cellule in gastroenterologia (NIH P30DK084567) e 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) AB e NIH R01 GF (DK52766).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di coltura da 100 mm x 15 mm | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Pipetta di trasferimento | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Pipetta sierologica da 10 ml | Corning (Falcon) | ||
| 50 ml | di Corning conico (Falcon) | ||
| 15 ml | di Corning conico (Falcon) | ||
| Punte per pipette barriera da 1.000 mL | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Mantenere sterili |
| Piastre con fondo in vetro MatTek | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Mantenere sterili |
| Pinze per microdissezione - Punte molto fini ed extra lunghe | Strumenti per la scienza | fine SB12630M | |
| Forbici chirurgiche affilate | Nasco | 14002-14 | |
| Forbici per micro-dissezione | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Utilizzare topi maschi o femmine di età compresa tra 4 e 7 settimane |
| Aghi per siringa non metallici Microfil (calibro 34, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Film da laboratorio | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Siringa Dow Corning | ||
| da 6 ml con punta luer normale | Siringa monoject | ||
| da 3 mL con punta luer regolare | Monoject | ||
| Apparecchiature per elettrofisiologia | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Sistema di acquisizione dati (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Condizionatore | di segnaleDispositivi molecolari | CyberAmp 320 | |
| Software | Dispositivi molecolari | pClamp 10.6 |
Riferimenti
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al.
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Ristampe e permessi
