Il modello murino di frattura femorale chiusa è una potente piattaforma per studiare la frattura che guarisce e nuove strategie terapeutiche per accelerare la rigenerazione dell'osso. L'obiettivo del presente protocollo chirurgico è quello di generare fratture femorali chiuse unilaterale nei topi utilizzando un asta intramidollare in acciaio per stabilizzare il femore.
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Articolo metodologico
La generazione delle fratture chiuse femorale in topi: un modello per studiare la guarigione ossea
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fratture ossee impongano un carico tremendo socio-economico sui pazienti, oltre ad interessare significativamente la qualità della vita. Strategie terapeutiche che promuovono la guarigione ossea efficiente sono inesistenti e in alto la domanda. Modelli animali efficace e riproducibile di guarigione di fratture sono necessari per comprendere i complessi processi biologici associati con rigenerazione ossea. Molti modelli animali di guarigione di frattura sono stati generati nel corso degli anni; Tuttavia, i modelli murini frattura recentemente sono emerso come potenti strumenti per studiare la guarigione ossea. Sono stati sviluppati vari modelli aperti e chiusi, ma il modello di frattura femorale chiusa si distingue come un metodo semplice per la generazione di risultati rapidi e riproducibili in modo fisiologicamente rilevante. L'obiettivo del presente protocollo chirurgico è quello di generare fratture femorali chiuse unilaterale in topi e facilitare una stabilizzazione post-frattura del femore inserendo un'asta di acciaio intramidollare. Anche se dispositivi come un chiodo o una vite offrono una maggiore stabilità assiale e rotazionale, l'uso di un asta intramidollare fornisce una sufficiente stabilizzazione per i risultati di guarigione coerente senza produrre nuovi difetti nel tessuto osseo o danneggiando vicini soft tessuto. La formazione immagine radiografica viene utilizzata per monitorare la progressione della formazione del callo, unione ossuta e successivo rimodellamento del callo osseo. Risultati di guarigione dell'osso sono tipicamente associati con la forza dell'osso guarito e misurati con test torsionale. Ancora, comprendere i primi eventi cellulari e molecolari connessi con la riparazione di frattura è fondamentale nello studio della rigenerazione del tessuto osseo. Il modello di frattura femorale chiusa in topi con fissazione intramidollare serve come una piattaforma attraente per studiare la guarigione di frattura ossea e valutare strategie terapeutiche per accelerare la guarigione.
Introduzione
Le fratture sono tra le lesioni più comuni che si verificano all'apparato muscolo-scheletrico e sono associate con un carico socio-economico tremendo, compresi i costi di trattamento che sono progettati per superare $ 25 miliardi ogni anno in Stati Uniti d'America1, 2. Anche se la maggior parte delle fratture guarigione senza incidenti, la guarigione è associata con notevoli tempi di inattività e perdita di produttività. Circa il 5-10% di tutte le fratture si tradurrà in una guarigione ritardata o non-Unione, a causa di età o altre condizioni di salute croniche sottostanti, quali osteoporosi e diabete mellito3,4,5. Trattamenti farmacologico non approvati dalla FDA sono attualmente disponibile per promuovere la guarigione dell'osso efficiente e ridurre i tempi di recupero.
Guarigione della frattura è un processo complesso e altamente dinamico che coinvolge il coordinamento di più tipi di cellule. Quindi, una completa comprensione degli eventi cellulari e molecolari connessi con rigenerazione ossea è fondamentale per l'identificazione di bersagli terapeutici che accelerare questo processo. Come con altre malattie umane, l'istituzione di un modello animale altamente suscettibile e riproducibile è cruciale nello studio della guarigione ossea. Gli animali più grandi, come pecore e maiali, hanno proprietà rimodellamento osseo e biomeccanica simili agli esseri umani, ma sono costosi, richiedono tempi di guarigione sostanziali e non sono facilmente suscettibili di manipolazione genetica6. D'altra parte, piccoli modelli animali, come ratti e topi, offrono molti vantaggi, tra cui una facilità di gestione, bassi costi di manutenzione, cicli brevi di allevamento e un tempo di guarigione più brevi7. Inoltre, il genoma del mouse è completamente sequenziato, consentendo la rapida manipolazione e la generazione di varianti genetiche. Così, il mouse è un sistema potente modello per studiare la malattia umana, ferita e riparazione8. In esseri umani, comorbidità come l'osteoporosi e diabete mellito aumenta la probabilità di una guarigione ritardata. Un numero di modelli del mouse esistenti è disponibili per studiare gli effetti di comorbidità quali l'osteoporosi e diabete mellito sulla lesione ossea e guarigione. I pazienti affetti da osteoporosi hanno una formazione di osso contrassegnato in diminuzione durante le fasi successive di una frattura che guarisce9. Topi ovariectomizzati (OVX) esibiscono perdita rapida dell'osso e ossea ritardata guarigione simile a quella osservata nell'osteoporosi postmenopausale10,11. Inoltre, molti modelli murini di tipo I e tipo diabete di II imitare i fenotipi massa bassa dell'osso e frattura alterata guarigione visto in esseri umani11. Inoltre, modelli murini frattura servono come una piattaforma versatile per studiare i complessi processi biologici che si verificano nel callo ed esplorare nuove strategie terapeutiche che accelerano la rigenerazione del tessuto osseo.
Nonostante le differenze nella struttura dell'osso e del metabolismo, il processo generale di frattura ossea guarigione rimane molto simile in topi ed in esseri umani, che coinvolge una combinazione di endochondral e ossificazione intramembranous seguita da rimodellamento osseo. Ossificazione endochondral prevede il reclutamento di cellule progenitrici meno meccanicamente stabile nelle regioni che circondano il divario di frattura, dove si differenziano in condrociti che ipertrofia e mineralizzano la cartilagine per produrre un callo molle. La seconda ondata di cellule progenitrici infiltrarsi il callo e differenziarsi in osteoblasti maturi che secernono nuovo osso matrice12,13,14,15. Durante l'ossificazione intramembranous, progenitori sulle superfici endostali e periosteal direttamente differenziano in matrice secernenti osteoblasti e facilitano il superamento del divario frattura9,11,12 ,13. Insieme, il endochondral e intramembranous ossificazioni provocano lo sviluppo di un callo duro, che è ulteriormente rimodellato nel tempo per formare un forte osso secondario in grado di supportare carichi meccanici13,14 ,15. Nell'uomo sano, il processo di guarigione richiede circa 3 mesi, rispetto a solo 35 giorni in topi16.
Guarigione della frattura è stata studiata comunemente utilizzando sia modelli chirurgici aperti o chiusi17. Aprire approcci chirurgici, quali la generazione di un difetto criticamente dimensione o completare osteotomia, standardizzare la posizione della lesione e la geometria per ridurre le deviazioni causate da fratture comminute. Osteotomie servono come un eccellente modello per studiare il meccanismo di fondo dietro un non-Unione, perché la guarigione è spesso in ritardo rispetto alle fratture chiuse. Inoltre, una rigida fissazione esterna è necessaria per stabilizzare l'osso osteotomized, che significa che la rigenerazione dipenderà principalmente l'ossificazione intramembranous. Approcci chirurgici aperti utilizzano dispositivi quali chiodi di fissaggio, fascette e piastre di bloccaggio per fornire stabilità assiale e rotazionale all'arto fratturato; Tuttavia, tali dispositivi sono costosi e richiedono molto più tempo in chirurgia18,19,20,21. D'altra parte, i modelli chiusi sono stabilizzati con un dispositivo di fissazione intramidollare semplice, consentendo abbastanza instabilità stimolare la guarigione endochondral. Di conseguenza, modelli di frattura chiusa non imitare prontamente le condizioni di un non sindacale. Tecniche di fissazione interna, quali perni intramidollari, chiodi e viti di compressione, sono vantaggiosi in quanto sono a buon mercato, facile da usare e ridurre al minimo il tempo in chirurgia21,22,23. In alcuni casi, perni intramidollari sono inseriti prima della frattura, ma la flessione del perno intramidollare può portare all'angolazione o spostamento del femore fratturato, contribuendo a una dimensione variabile callo e guarigione. La posizione di frattura e la geometria sono più difficili da standardizzare in modelli chiusi, in cui vengono generate utilizzando un dispositivo di piegatura tre punti, in cui è caduto un peso sulla diafisi. Tuttavia, con la tecnica corretta, questo approccio chirurgico offre risultati rapidi e costanti. Inoltre, il modello di frattura chiusa serve come uno strumento clinicamente rilevante per studiare le fratture causate da elevata forza di impatto o stress meccanici22.
Questo protocollo chirurgico è stato adattato da metodi precedentemente descritti utilizzando un perno intramidollare per stabilizzare femori fratturati in ratti e topi22,24,25. In primo luogo, un ago intramidollare di piccolo diametro viene inserito attraverso la tacca di intracondylar per stabilire un punto di ingresso, e un filo guida è stato introdotto prima di generare una frattura trasversale al midshaft femorale utilizzando un tre-punto di gravità-dipendente dispositivo di piegatura. Dopo la generazione di successo di una frattura chiusa del femore, è incorporato un asta intramidollare di un diametro maggiore sopra il filo guida per stabilizzare il femore fratturato. Questo metodo evita il rischio di guarigione ritardata causata dall'angolazione del perno intramidollare durante la frattura, come il posizionamento della post-frattura asta permette per la stabilizzazione di riposizionamento e ottimizzata del femore ferito.
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Protocollo
La seguente procedura è stata eseguita con approvazione dalla Indiana University School di medicina istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC). Tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza sono stati eseguiti in condizioni sterili, come indicato dalle linee guida NIH. Dolore e rischio di infezioni sono stati diretti con adeguati analgesici e antibiotici per garantire un esito positivo.
1. anestesia e preparazione
- Pesare il mouse e anestetizzare con una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) amministrato tramite la via intraperitoneale (I.P.). Posizionare il mouse in una gabbia vuota e monitorarlo fino a quando esso è completamente sedato.
- Assicurarsi che il mouse è sedato utilizzando un riflesso di pizzico di punta. Applicare unguento oftalmico ai suoi occhi per proteggerli dall'asciugarsi.
- Rimuovere la pelliccia dall'arto destro. Pulire il sito chirurgico con un etanolo a base di iodio macchia e 70%. Strofinare il sito chirurgico partendo dal centro del ginocchio e facendo una spazzata circolare verso l'esterno. Ripetere questo 3x con scrub fresco, terminando con etanolo al 70%.
- Somministrare una dose preoperatoria di analgesia di buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg) per via sottocutanea per la gestione del dolore postoperatorio immediato.
- Posizionare il mouse su un rilievo di riscaldamento coperto da un tampone chirurgico sterile.
2. chirurgico approccio
Nota: Prima della frattura, il peso e l'altezza di caduta dovrebbe essere empiricamente determinati per il ceppo specifico, età e sesso dei topi prima della chirurgia. Questa procedura chirurgica è ottimizzata per C57BJ6 topi maschi a 10 settimane di età.
- Posizionare il mouse sul dorso e flettere il ginocchio della gamba operativa. Usando un bisturi, praticare un'incisione di 1,5 cm centrata sopra l'articolazione del ginocchio.
- Spostare lateralmente la rotula utilizzando forcipe per esporre l'estremità distale del femore. Inserire un ago ipodermico di 1.5 - in acciaio inox lungo calibro 25 al centro del solco trocleare, giù la lunghezza del canale midollare in maniera retrograda e attraverso l'estremità prossimale del femore. Fare una radiografia per assicurare il posizionamento corretto del perno.
Nota: L'ago dovrebbe uscire il lato dorsale del mouse per creare un percorso per il filo guida. - Passare un filo di tungsteno lungo 36-calibro 4 in guida attraverso l'albero dell'ago, entrando attraverso l'hub al femore distale e uscendo la smussatura sul lato dorsale del mouse.
- In seguito il successo posizionamento del filo guida, rimuovere con cautela l'ago di calibro 25 tirando delicatamente l'hub tenendo l'arto e il filo guida in posizione. Confermare il posizionamento del filo guida da x-ray.
- Tenere un peso di 391 g da un'altezza di 34,6 cm sopra il disco di impatto (Figura 1A). Posizione del femore orizzontalmente attraverso i due punti, di supporto tale che le regioni intertrocanteriche e supracondylar del femore appoggiare le incudini di supporto (Figura 1B) e laterale dell'arto è rivolto verso il punto di carico (Figura 1 ). Eliminare il peso e rimuovere con attenzione il mouse dal dispositivo immediatamente dopo la frattura.
- Confermare la posizione di frattura di raggi x.
- Inserire il tubo di acciaio inox 24-calibro ipodermico sopra il filo guida per stabilizzare il femore fratturato.
Nota: Questa applicazione può risultare un po' forzato come il punto di ingresso è stato generato utilizzando un ago di un diametro inferiore. Questa differenza di diametro previene efficacemente una migrazione potenziale dell'asta del 24-calibro attraverso l'estremità prossimale del femore. La profondità di inserimento può essere sentita manualmente come il tubo smussato incontra l'osso corticale del grande trocantere. - Confermare la posizione dell'asta in acciaio e la stabilizzazione del femore fratturato da x-ray prima di rimuovere il filo guida.
- Tagliare il tubo in eccesso all'estremità distale del femore con tagliafili. Seppellire il tubo esposto sotto la superficie dei condili con forcipe per applicare una leggera forza verso il basso, stando attenti a non slogarvi l'articolazione del ginocchio.
- Riposizionare la rotula usando il forcipe. Chiudere il sito di incisione con una sutura riassorbibile 5-0.
3. postoperatorio Management
- A seguito della chirurgia, i topi possono essere iniettati con fino a 500 µ l di sterile salina tramite il percorso I.P. per aiutarli nella loro recupero postoperatorio.
- Monitorare gli animali su un letto di recupero riscaldato fino a che si risvegliano da un intervento chirurgico. Una volta ambulatoria, restituirli alla loro gabbia.
- Continuare a monitorare attentamente i topi per diversi giorni dopo l'intervento chirurgico per assicurare che si stanno rimarginando correttamente e riacquistare la mobilità. Somministrare analgesia di buprenorfina cloridrato (0,03 mg/kg) per via sottocutanea ogni 6 h per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico e, se necessario in seguito. Evitare l'uso di anti-infiammatori non steroidei (FANS) come sono stati indicati per alterare la guarigione ossea dopo la chirurgia.
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Risultati
L'efficace attuazione della procedura chirurgica è stata monitorata con formazione immagine radiografica. Passaggi chiave includono l'inserimento di un ago intramidollare, il posizionamento di un filo guida, l'induzione di una frattura trasversale al midshaft femorale e la corretta stabilizzazione con un asta intramidollare (Figura 2Aho - 2Aiv). La progressione di guarigione del callo di frattura è stata monitorata con immagi...
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Discussione
L'obiettivo di questa procedura chirurgica è di generare fratture femorali chiuse standardizzate in topi. Un vantaggio chiave di questo modello è che la fissazione interna avviene dopo la generazione della frattura, evitando in tal modo un'angolazione dello stelo intramidollare. Forse l'aspetto più critico di questo protocollo è la generazione di una frattura trasversale standardizzata al midshaft femorale, come la geometria di frattura dipende la forza di piegatura applicata e il posizionamento degli arti posteriori. Il...
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Dichiarazioni
Gli autori di questo manoscritto non hanno nulla a rivelare. Gli autori maggiori affermano che non ci sono restrizioni sull'accesso completo a tutto il materiale utilizzato nello studio segnalato in questo manoscritto.
Ringraziamenti
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte del dipartimento della difesa (DoD) noi Army Medical Research e Materiel comando (USAMRMC) Congresso Regia Medical Research programmi (CDMRP) (PR121604) e istituti nazionale di artrite e patologie del sistema muscoloscheletrico e malattie (NIAMS), NIH R01 AR068332 a Uma Sankar della pelle.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Oster Minimax Trimmer | Animal World Network | 78049-100 | |
| POVIDONE-IODINE | Thermo Fisher Scientific 395516 | ||
| UNGUENTO OFTALMICO | Thermo Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Styker T/Pump Ricircolatore d'acqua calda | Kent Scientific Corporation | TP-700 | |
| Siringa Sub-Q da 1 ml | Thermo Fisher Scientific | ||
| ENCORE Sensi-Touch PF | Moore Medical LLC | 30347 | Lattice, guanto chirurgico senza polvere |
| PrecisionGlide 25G Aghi ipodermici | Thermo Fisher Scientific | 14-826-49 | |
| Filo di tungsteno ad altissima temperatura, | McMaster-Carr | 3775K37 | 0,005" di diametro, bobina da 1/16 di libbra, 380' di |
| lunghezza in acciaio inossidabile 304, tubo a parete sottile da 24G | Microgroup Inc | 304h24tw-5ft | |
| #15 Lame per bisturi | Strumenti per la scienza fine | 10015-00 | |
| #10 Lame per bisturi | Strumenti per la scienza | 10010-00 | |
| Pinze per modelli stretti | Strumenti per la scienza | 11002-12 | Forcipe per iride seghettata/diritta/12 cm |
| Strumenti per la scienza | 11066-07 | 1x2 denti/dritto/7 cm | |
| Forbici Dissector | Fine Science Tools | 14081-09 | Lame sottili/Angolate lateralmente/Affilate-affilate/10 cm |
| Forbici fini | Fine Science Tools | 14058-11 | ToughCut/Dritto/Affilato-Affilato/11,5 cm |
| Supporto per aghi Olsen-Hegar con taglierina per sutura | Fine Science Tools | 12002-12 | Dritto/Seghettato/12 cm/con blocco |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13004-14 | Seghettato/dritto/14cm |
| tungsteno filo taglierina | ACE Surgical Supply Co., Inc. | 08-051-90 | ACE #150 Tagliafili, punte in carburo di tungsteno |
| 3-0 VICRYL Suture | Ethicon Suture | J423H | 3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING |
| piXarray 100 Sistema di radiografia digitale per campioni | Bioptics, Inc | Sistema a raggi X per armadio | |
| Einhorn Dispositivo di piegatura a 3 punti | N/A | N/A | Costruito su misura |
Riferimenti
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