Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull'espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.
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Articolo metodologico
Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cardiomiociti generati dalle cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC-CMs) sono uno strumento emergente nella ricerca cardiovascolare. Piuttosto che essere una popolazione omogenea delle cellule, l'iPSC-CMs generati da protocolli correnti di differenziazione rappresentano una miscela delle cellule con ventricolare-, atriale-e fenotipi nodale-like, che complica l'analisi fenotipiche. Qui, un metodo per registrare otticamente i potenziali di azione in particolare da ventricolare-come iPSC-CMs è presentato. Questo si ottiene attraverso la trasduzione lentivirale con un costrutto in cui un indicatore di tensione geneticamente codificato è sotto il controllo di un elemento promotore ventricolare-specifico. Quando iPSC-CMs vengono trasdotti con questo costrutto, il sensore di tensione è espresso esclusivamente in ventricolare-come le cellule, che permette registrazioni potenziali di membrana ottico sottotipo-specifici utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse.
Introduzione
Cardiomiociti (CMs) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono uno strumento emergente di sezionare i meccanismi molecolari di malattia cardiaca, per studiare nuove terapie e allo schermo per avverse cardiache effetti1,2 ,3. Fin dall'inizio, malattie aritmogene quali canalopatie sono stati un fuoco importante di questa ricerca zona4. Di conseguenza, metodi per studiare elettrici fenotipi di CMs, quali aritmie o cambiamenti di morfologie di potenziale di azione (AP), sono il cuore di questa tecnologia.
U....
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Protocollo
1. preparazione di cardiomiociti derivati iPSC per l'Imaging
Nota: Metodi per la differenziazione di cultura e cardiaco iPSC sono apparse prima12,13,14 e non sono discussi qui in dettaglio. La purificazione di iPSC-CMs di microdissection manuale, separazione magnetica delle cellule o selezione di lattato è raccomandata, a seconda del protocollo di differenziazione utilizzato. Per il seguente protocollo, espianti di microdissected battendo zone, generata utilizzando un protocollo di differenziazione monostrato13, erano scattate....
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Risultati
In Figura 4a, un singolo rappresentante iPSC-CM è raffigurato con le linee bianche tratteggiate marcatura il ROI disegnato durante l'analisi di imaging RFP (lato sinistro) e il canale GFP (lato destro). Il segnale dal canale RFP Mostra un aumento periodico intensità fluorescente durante ogni potenziale di azione (Figura 4b, pannello superiore). Come descritto nell'introduzione, questo è a causa di un crescente apprensione causata.......
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Discussione
Il metodo qui descritto consente una registrazione ottica di APs da un sottotipo specifico (cioè, ventricolare-come le cellule) di CMs generato da iPSCs umane. Umano iPSC-CMs sono uno strumento emergente per affrontare una grande varietà di problemi biologici e medici, e la differenziazione di diversi sottotipi di CM è un'importante fonte di variabilità sperimentale. Utilizzando elementi specifici promotore, l'espressione di un GEVI è specificamente realizzato in CMs che rappresenta il sottotipo di interesse, ch.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da German Research Foundation (Si 1747/1-1), l'altro Kröner-Fresenius-Stiftung e la Deutsche Stiftung für Herzforschung.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ß-Mercaptoetanolo | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (siero fetale bovino) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Aminoacidi non essenziali | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Integratore | Invitrogen | 35050061 | alternativa L-Glutammina |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectina plasma bovino | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenasi di tipo II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Bromuro di esadimetririna (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | che migliora l'infezione lentivirale |
| Micropiastre con fondo di vetro da 3,5 cm | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Supporto per microscopio | Leica Microsystems, Wetzlar, Germania | DMI6000B | |
| Obiettivo per microscopio | Leica Microsystems, Wetzlar, Germania | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Fotocamera | |
| Andor Technology, Belfast, Regno Unito | Zyla V | ||
| Cubo filtrante per microscopio: filtro di eccitazione | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | passa-banda 480/40 |
| Cubo filtrante per microscopio: specchio dicroico | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | Splitter di immagini T505lpxr | passa-lungo 505 nm |
| Cairn Research, Faversham, Regno Unito | OptoSplit II | ||
| Cubo filtro splitter di immagini: specchio dicroico | AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Germania | 568LPXR | passa-lungo 568 nm |
| Cubo filtro splitter di immagini: filtro di emissione 1 (emissione GFP) | AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Germania | 520/28 BrightLine HC | passa-banda 520/28 nm |
| Cubo filtro splitter di immagini: filtro di emissione 2 (emissione RFP) | AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Germania | 630/75 ET Passa-banda | passa-banda 630/75 nm |
| Inserto di stimolazione | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
Riferimenti
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A.
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Ristampe e permessi
