Il protocollo descrive una tecnica per studiare la capacità delle cellule T umane policlonali primarie per formare sinaptiche interfacce utilizzando lipidici planare. Usiamo questa tecnica per dimostrare la capacità di formazione di sinapsi differenziale delle cellule T umane primarie derivata da linfonodi e nel sangue periferico.
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Articolo metodologico
Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attuale comprensione delle dinamiche e caratteristiche strutturali delle interfacce sinaptiche della T-cellula sono stato in gran parte determinati attraverso l'utilizzo di vetro-supportato bilayer planare e in vitro-derivata T-cellula clona o linee1,2 ,3,4. Come applicano questi risultati a cellule T umane primarie isolate da sangue o linfoide tessuti non è noto, in parte a causa di notevoli difficoltà nell'ottenimento di un numero sufficiente di cellule per analisi5. Qui ci rivolgiamo questo attraverso lo sviluppo di una tecnica sfruttando le diapositive di flusso multicanale per costruire planare lipidici contenenti molecole di adesione e di attivazione. La bassa altezza delle diapositive flusso promuove sedimentazione rapida delle cellule al fine di sincronizzare l'attaccamento cellulare: doppio strato, consentendo ai ricercatori di studiare la dinamica della formazione sinaptica interfaccia e la cinetica del rilascio granuli. Applichiamo questo approccio per analizzare l'interfaccia sinaptica di minor come 104 a 105 primaria crioconservati T cellule isolate da linfonodi (LN) e nel sangue periferico (PB). I risultati rivelano che la tecnica del doppio strato lipidico planare romanzo consente lo studio delle proprietà biofisiche delle cellule T umane primarie derivate dal sangue e dai tessuti nel contesto della salute e nella malattia.
Introduzione
Conoscenza scientifica delle caratteristiche strutturali delle sinapsi immunitarie T-cellula e loro collegamento con l'attività funzionale delle cellule T è stata generata principalmente dallo studio di linee cellulari e cloni derivata da PB. A quale grado di questi risultati si riferiscono a cellule T primarie ottenute da sangue o tessuti linfoidi umani rimane poco chiaro, come le interfacce sinaptiche delle cellule di T che risiedono nei tessuti linfoidi e altri non sono stati finora analizzate. Cosa importante, i dati emergenti suggeriscono che le cellule di T di residenti in tessuto e linfoide-organo-derivati possono avere differenze significative nel loro fenotip....
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki. Consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e campioni di sangue e di linfonodo sono stato acquistati con l'approvazione del Comitato di revisione istituzionale presso l'Università della Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Tutti i soggetti umani erano adulti. I campioni di sangue del cordone sono state gentilmente concesse da travaglio e il parto del reparto di Ostetricia & Ginecologia presso la Thomas Jefferson University. Tutti i campioni sono stati de-identificati.
1. isolamento di CD4+ T cellule per un'analisi di immagine
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Risultati
In primo luogo, abbiamo confrontato la struttura dell'interfaccia sinaptica formata da attivati CD8 cavo-sangue-derivate+ T cellule esposte a lipidici costruito sia in flusso tradizionale su larga scala sistemi di cellule (Vedi la Tabella materiali particolari)1 ,2,3,4 o nelle diapositive di flusso multicanale. Il bilayer contenuti f.......
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Discussione
La nuova tecnica descritta qui utilizza simili reagenti necessari per costruire bilayer planare in flusso convenzionale cella5 e può essere applicata con successo per eseguire l'imaging del primario umano delle cellule T – doppio strato interfacce3,4 ,15. La tecnica offre una significativa riduzione nell'uso di molecole fluorescenti e richiede 10-20 volte meno cellule di T rispetto ad un flusso cellulare.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione R01AI118694 NIH di Michael R. Betts, che include Sub-premio 566950 a Yuri Sykulev. Ringraziamo la Sidney Kimmel Cancer Center bioimmagini ha condiviso risorsa per il loro sostegno eccellente.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di isolamento delle cellule T CD4, umano | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| Kit di isolamento delle cellule T CD8, umano | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| CANI NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Albumina sierica umana | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Vetrini coprioggetti per vetrini adesivi | ibidi | 10812 | |
| Camera Bioptech FCS2 Anticorpo | anti-CD3 Bioptech | 060319-2-03 | |
| Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | Clone OKT3, le cellule di ibridoma sono disponibili da ATCC | |
| anticorpo anti-CD28 | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Caseina | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 kit di marcatura delle proteine con colonna per la purificazione delle proteine marcate | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Kit di marcatura delle proteine Alexa Fluor 568 con colonna per la purificazione delle proteine marcate | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His Vettori di espressione della Drosophila | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Vettore di espressione della Drosophila per la selezione positiva | ATCC | 37409 | |
| Terreni drosofici privi di siero Insetto-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Ibridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | L'ibridoma secerne anticorpo contro ICAM-1. |
| Cianogeno bromuro-attivato-Sefarosio 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilizzato per la preparazione di Sefarosio con anticorpo anti-ICAM legato covelentemente. |
| Concentratore a flusso tangenziale MasterFlex | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Utilizzato per ICAM-1 contenente la concentrazione di surnatante e la dialisi di ICAM-1 contenente il supernatante |
| Centramate Lab Sistemi a flusso tangenziale | Pall FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Utilizzato per ICAM-1 contenente la concentrazione di surnatante e la dialisi di ICAM-1 contenente il surnante | |
| Ni-NTA Agarosio | QIAGEN | 30210 | |
| Tubi per dialisi | Spectra/Por | 131384 | |
| Papaina da lattice di papaya | Sigma | P3125 | |
| anticorpo umano di topo contro CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Pinza a forbice in polipropilene | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Microscopio | Nikon TiE dotato di PFS per il controllo della stabilità dell'immagine a lungo termine, obiettivi a olio 60X, 4 laser con linee di eccitazione a 405, 458, 488, 514, 561 e 640 nm, 2 rivelatori GaAsP e 2 PMT ad alta sensibilità, luce trasmessa DIC, tavolino X, Y, Z programmabile per posizioni multiple e cucitura di grandi aree, funzioni time lapse, temperatura Tokai-Hit e camera controllata CO2 per l'imaging dal vivo e tavolo di isolamento antivibrazioni | ||
| Microscopio TIRF | Andor | Andor Revolution XD dotato di illuminatore Nikon TIRF-E, laser con 405, 488, 561 e 640 linee, luce trasmessa DIC, testa a disco rotante Yokogawa CSU-X1 per imaging confocale, obiettivo 100/1,49 NA, fotocamera Andor iXon X3 EM-CCD, riscaldatore dell'obiettivo e un tavolino piezoelettrico motorizzato con Perfect Focus System (PFS) | |
| Software di analisi delle immagini MetaMorph Premier | Dispositivi |
Riferimenti
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clin....
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Ristampe e permessi
