Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

Summary

Il protocollo descrive una tecnica per studiare la capacità delle cellule T umane policlonali primarie per formare sinaptiche interfacce utilizzando lipidici planare. Usiamo questa tecnica per dimostrare la capacità di formazione di sinapsi differenziale delle cellule T umane primarie derivata da linfonodi e nel sangue periferico.

Abstract

L'attuale comprensione delle dinamiche e caratteristiche strutturali delle interfacce sinaptiche della T-cellula sono stato in gran parte determinati attraverso l'utilizzo di vetro-supportato bilayer planare e in vitro-derivata T-cellula clona o linee^{1,2 ,3,4}. Come applicano questi risultati a cellule T umane primarie isolate da sangue o linfoide tessuti non è noto, in parte a causa di notevoli difficoltà nell'ottenimento di un numero sufficiente di cellule per analisi⁵. Qui ci rivolgiamo questo attraverso lo sviluppo di una tecnica sfruttando le diapositive di flusso multicanale per costruire planare lipidici contenenti molecole di adesione e di attivazione. La bassa altezza delle diapositive flusso promuove sedimentazione rapida delle cellule al fine di sincronizzare l'attaccamento cellulare: doppio strato, consentendo ai ricercatori di studiare la dinamica della formazione sinaptica interfaccia e la cinetica del rilascio granuli. Applichiamo questo approccio per analizzare l'interfaccia sinaptica di minor come 10⁴ a 10⁵ primaria crioconservati T cellule isolate da linfonodi (LN) e nel sangue periferico (PB). I risultati rivelano che la tecnica del doppio strato lipidico planare romanzo consente lo studio delle proprietà biofisiche delle cellule T umane primarie derivate dal sangue e dai tessuti nel contesto della salute e nella malattia.

Introduction

Conoscenza scientifica delle caratteristiche strutturali delle sinapsi immunitarie T-cellula e loro collegamento con l'attività funzionale delle cellule T è stata generata principalmente dallo studio di linee cellulari e cloni derivata da PB. A quale grado di questi risultati si riferiscono a cellule T primarie ottenute da sangue o tessuti linfoidi umani rimane poco chiaro, come le interfacce sinaptiche delle cellule di T che risiedono nei tessuti linfoidi e altri non sono stati finora analizzate. Cosa importante, i dati emergenti suggeriscono che le cellule di T di residenti in tessuto e linfoide-organo-derivati possono avere differenze significative nel loro fenotipo e l'attività funzionale rispetto a quelli in PB^6,7. Questo ulteriore ha solidificato la necessità di comprendere meglio le caratteristiche dell'interfaccia sinaptica delle cellule T in cellule T umane primarie.

A tal fine, abbiamo sviluppato un approccio di mini-scala romanzo sfruttando lipidici incorporati nelle slitte di flusso multicanale che ci permette di eseguire l'imaging delle interfacce di T-cellula/doppio strato con meno di 10 cellule T primarie⁵ isolate da PB umano e LN. Questa nuova tecnica consente lo studio delle proprietà biofisiche delle interfacce primarie della T-cellula umane sinaptiche al fine di meglio modellare e capire in vivo interazioni cellula-cellula.

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con la dichiarazione di Helsinki. Consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti, e campioni di sangue e di linfonodo sono stato acquistati con l'approvazione del Comitato di revisione istituzionale presso l'Università della Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Tutti i soggetti umani erano adulti. I campioni di sangue del cordone sono state gentilmente concesse da travaglio e il parto del reparto di Ostetricia & Ginecologia presso la Thomas Jefferson University. Tutti i campioni sono stati de-identificati.

1. isolamento di CD4⁺ T cellule per un'analisi di immagine

1. Scongelare un'aliquota da 1 mL contenente 10 cellule mononucleari del sangue periferico⁷ congelati (PBMCs) o cellule mononucleari di linfonodo (LNMCs) da campioni raccolti. In una cappa sterile, è necessario aggiungere le cellule scongelate a 9 mL di RPMI completate con penicillina/streptomicina e glutammina.
   1. Centrifugare le cellule per 10 min a 300 x g a 4 ° C, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di RPMI supplementato contenente 10% FBS (sostanza completa). Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a CO₂ a 37 ° C.
2. Il giorno successivo, purificare CD4⁺ T cellule immunomagnetica negativa l'ordinamento utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore.
3. Per misurare il numero di CD4 appena purificato⁺ T cellule, mescolare 5 µ l di sospensione cellulare con un volume uguale di una soluzione di blu di trypan. Caricare un emocitometro con un cellulare-trypan blu miscela e contare le cellule vive all'interno delle 5 sezioni dell'emocitometro.
4. Prendere la media del numero delle cellule e determinare il numero di cellule in sospensione delle cellule originali: il numero di cellule/1 mL = conteggio medio x 2 x 10⁴. Se il numero totale di cellule isolate è troppo piccolo, è possibile utilizzare le celle come è senza contare.
5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min e risospendere in un buffer di analisi (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2mm Na₂HPO₄, 5mm D-glucosio, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2mm CaCl₂e 1% di albumina sierica umana) 10^{5 < /C13 > cellule/50 µ l o meno e mantenere le cellule a 4 ° C (per 1 – 2 h) fino all'uso negli esperimenti.}
6. Smaltire tutti i rifiuti biologici secondo le pertinenti linee guida istituzionali.
7. Se si desidera come una popolazione delle cellule di controllo, preparare le cellule T CD8 attivate da sangue cordonale PBMC, posto 10⁷ cellule in 5 mL di terreno completo in un matraccio di cultura T25 coperto con una miscela di anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 a 10 µ g/mL e 1 µ g/mL , rispettivamente.
8. Il giorno successivo, rimuovere le cellule del sangue di cordone attivato dalla beuta, lavarli 1x con freschi completare medio ed espandere le cellule in presenza di IL-2 ricombinante (100 U/mL) per 2 settimane.
9. Purificare il sangue del cordone ombelicale CD8⁺ T cellule immunomagnetica negativa l'ordinamento utilizzando il kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Contare le celle e scambiare i media per il tampone, come descritto nei passaggi 1.3-1.6 per LN e PB CD8⁺ T cellule.

2. i componenti per la preparazione della lipidici planare

1. Preparare 3 tipi di liposomi come descritto altrove⁵: (a) 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl -sn- glicero-3-fosfocolina) liposomi, (b) 0,4 mM DOPC liposomi 33% in moli cani-NTA (1,2-dioleoyl -sn- glicero - 3-[(N-(5- ammino-1-carboxypentyl) acido iminodiacetic) succinil] (sale di ammonio)) lipidi, (c) 0,4 mM DOPC liposomi contenenti 4 mol % biotynil-Cap-PE (1,2-dioleoyl -sn- glicero-3-phosphoethanolamine - N-(cap biotynil) (sale di sodio)).
2. Preparare soluzione 5% caseina come descritto in precedenza⁵.
   1. Sciogliere 5 g di polvere di caseina in 100 mL di acqua ultrapura e 350 µ l di 10 M di idrossido di sodio. Mescola il tutto su un agitatore magnetico regolare a bassa velocità secondo la scala disponibile, a temperatura ambiente per 2 h e quindi durante la notte a 4 ° C. Regolare il pH a 7.3 e ultracentrifuga la soluzione per 2 h a 100.000 x g a 4 ° C. Filtrare il surnatante con un filtro sterile da 0,22 µm e conservare la soluzione in aliquote a-80 ° C.
      Attenzione: la soluzione di idrossido di sodio può causare ustioni chimiche e può indurre cecità permanente al contatto con gli occhi. Utilizzare guanti di gomma, indumenti di sicurezza e protezione degli occhi durante la manipolazione di questo prodotto chimico o le relative soluzioni.
3. Anticorpo anti-CD3 di etichetta con biotina per produrre molecole di anticorpo mono-bionylated con un approccio descritto in precedenza⁸.
   1. Preparare una soluzione di biotina-PEO4-NHS in dimetilsolfossido (DMSO) a 0,1 mg/mL. Aggiungere 3,7 µ l della soluzione di biotina-PEO4-NHS a 1 mg di anticorpo in 0,5 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente bicarbonato di sodio 100 mM.
   2. Incubare la miscela per 2 h a temperatura ambiente. Preparare una soluzione di estere di Alexa Fluor 488 NHS a 10 mg/mL in DMSO. Aggiungere la soluzione di Alexa Fluor 488 NHS estere per l'anticorpo marcato da biotina-PEO4-NHS presso un eccesso molare 10 volte.
   3. Incubare la miscela per 1 h a temperatura ambiente con agitazione lenta su un agitatore magnetico regolare. Separare il colorante non associato mediante cromatografia di esclusione dimensionale.
   4. Determinare la concentrazione di anticorpi misurando la densità ottica della soluzione dell'anticorpo a 280 nm (A₂₈₀). Misurare la densità ottica degli anticorpi con etichettati a 577 nm (un₅₇₇).
   5. Determinare il rapporto di tintura-a-anticorpo usando la seguente equazione:
      
      Nota: Trovare ulteriori dettagli nel protocollo del produttore.
4. Esprimono una proteina ricombinante di ICAM-1 solubile in un sistema di espressione di Drosophila come descritto in precedenza^3,4,9,10.
   1. Clone, con cDNA encoding, il ectodomain di ICAM-1 in Drosophila espressione vettoriale pMT/V5-His con un promotore inducibile metallotioneina per produrre una proteina ricombinante aggiunta con una sua etichetta₆ all'estremità C-terminale.
   2. Co-transfect cellule S2 con il plasmide contenente risultante di ICAM-1 e un vettore di espressione G418. Selezionare trasfettanti stabili utilizzando supporti di Drosophila di Schneider completati con 10% siero fetale di vitello (FCS) e 0,5 mg/mL di G418 per 3 settimane. Espandere le cellule in medium senza siero insetto e indurre un'espressione della proteina con 0,5 mM di CuSO₄ per 3 d.
   3. Concentrarsi sulla cultura surnatante x 10 e Dializzare contro PBS tramite un concentratore di flusso tangenziale come descritto in precedenza¹¹.
   4. Applicare il surnatante della cultura concentrata a una colonna contenente Sepharose con un anticorpo monoclonale anti-ICAM-1 in covalenza immobilizzato ed eluire l'ICAM-1 associato con un tampone di glicina 50 mM, pH 3.0. Immediatamente neutralizzare la proteina di ICAM-1 eluita con un tampone di Tris di 2 M, pH 8.0.
   5. Dializzare il materiale contro PBS, pH 8.0 e aggiungere il materiale dializzato a una colonna contenente Ni-NTA dell'agarosi. Eluire ICAM-1 solubile con imidazolo di 200 mM, pH 8.0. Dializzare il materiale contro un tampone PBS, pH 8.0.
   6. Etichettare l'ICAM-1 purificata con estere NHS Cy5 secondo le istruzioni del fabbricante.
      Nota: Il miglior rapporto finale della tintura--proteina è 1:1.
5. Fab di produrre frammenti da un anticorpo anti-CD107a di digestione di papaina e purificare il Fab frammenti mediante cromatografia a scambio ionico come descritto in precedenza³. Etichetta il Fab frammenti con estere di Alexa Fluor 568 NHS secondo le istruzioni del fabbricante.

3. formazione di vetro-supportati planare lipidici

1. Preparare una soluzione piranha acida fresca con 140 mL di acido solforico concentrato e 60 mL di perossido di idrogeno 30%. Lavare i vetrini coprioggetti per le diapositive di flusso da li ammollo nella soluzione acida piranha per 30 min. Hold il vetrino coprioggetti con una pinza a forbice in polipropilene.
   Attenzione: La soluzione Piranha è un ossidante molto forte. Ricordarsi di indossare occhiali di sicurezza o occhiali di protezione o uno scudo integrale con guanti di gomma spessa in ogni momento mentre si maneggia la soluzione. Funzionano solo con soluzione piranha sotto cappa aspirante. Evitare il riscaldamento, trasporto o scuotendolo in qualsiasi momento durante l'uso, perché potrebbe esplodere. Raccogliere i rifiuti di piranha in una bottiglia di vetro con un buco contenenti piombo. Contattare il Comitato istituzionale di sicurezza circa l'utilizzo corretto dei rifiuti.
2. Sciacquare i coprioggetti lavati 7 x con acqua ultrapura trasferendoli in sequenza nel becher contenente acqua fresca. Set lamelle bagnate da parte per lasciare che il restante acqua rotolare fuori il vetro pulito, lasciando il vetro asciutto.
   1. In alternativa, è possibile utilizzare un puntale attaccato ad una pompa di vuoto per rimuovere accuratamente le gocce d'acqua rimanenti da lamelle.
3. Nella cappa sterile, eseguire diluizioni dei vari lipidi per produrre il mix di liposomi per fare strati lipidici. In primo luogo, combinare 37 µ l di liposomi DOPC e 3 µ l di liposomi biotynil-Cap-PE. In secondo luogo, mix 14 µ l di liposomi DOPC e 15 µ l di liposomi di cani-NTA. In terzo luogo, aggiungere 1 µ l della miscela prima a 29 µ l della miscela seconda per fabbricare la miscela finale liposoma.
4. Nella cappa sterile, impostare un'area di lavoro con vetrini coprioggetti asciutti nelle vicinanze. Aliquotare 2 µ l della miscela finale liposoma (Vedi punto 3.3) proprio nel centro di un canale di diapositiva autoadesiva. Immediatamente e molto precisamente allineare un coprioggetto pulito e asciutto con la diapositiva e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetto sul lato appiccicoso della diapositiva.
   1. Se preparare più di una diapositiva, lavorare su una diapositiva alla volta poiché la miscela del liposoma evapora rapidamente. Capovolgere la diapositiva e utilizzare l'anello esterno del forcipe forbice in polipropilene per applicare una leggera pressione al contatto periferico del coprivetrino con lo scivolo, assicurandosi che lo slittamento è strettamente collegato alla diapositiva per escludere perdite.
      Nota: Non premere contro i canali della diapositiva per evitare la rottura o fessurazione il vetrino coprioggetti.
   2. Capovolgere nuovamente la diapositiva e segnare la posizione del bilayer formata, che assomiglia ad una goccia tra il vetrino coprioggetto e lo scivolo di canale, da disegno 4 punti con un pennarello indelebile intorno il bilayer sul lato slitta esterna dell'Assemblea.
5. Prima la prima iniezione di un liquido nel canale, è necessario designare una porta del canale come la porta di entrata e l'altro come la porta di uscita e mantenere questa designazione in tutto l'esperimento.
6. Per evitare la formazione di bollicine, inserire l'estremità della punta della pipetta direttamente la porta di entrata del canale. Riempire lentamente i canali della diapositiva con 50 µ l di caldo (temperatura ambiente di almeno) tampone del saggio (Vedi punto 1.5 per la composizione di buffer).
7. Preparare una soluzione di cloruro di nickel 0,5 M. Scongelare un'aliquota di 2 mL di soluzione di caseina in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min e integrarla con una soluzione di cloruro di nichel ad una concentrazione finale di 200 µM.
8. Lavare il bilayer prima iniezione di 100 µ l della soluzione di caseina nella porta di entrata del canale e quindi immediatamente rimuovendo 100 µ l fuori la porta di uscita sulla diapositiva di pipettaggio. Bloccare il bilayer con la stessa soluzione da iniettare 100 µ l della soluzione caseina la porta di ingresso di ciascun canale e incubando il vetrino per 45 min a temperatura ambiente.
9. Disgelare aliquote di Cy5-ICAM-1-His proteine₆ e streptavidina. Combinare le proteine nel tampone alla concentrazione finale di 2 µ g/mL. Centrifugare la soluzione per 30 min a 20.000 x g e a 4 ° C per rimuovere qualsiasi aggregazione.
10. Rimuovere il resto della soluzione bloccante dalla porta di uscita del canale diapositiva pipettando. Iniettare 100 µ l di soluzione contengono ICAM-1 e streptavidina alla porta di ingresso.
11. Incubare il vetrino per 45 min a temperatura ambiente. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione della proteina della porta di uscita. Lavare il bilayer 2 x prima iniezione di 100 µ l di tampone di dosaggio nella porta di entrata del canale e quindi immediatamente rimuovendo 100 µ l fuori la porta di uscita.
12. Diluire un anticorpo anti-CD3 Alexa-Fluor-488-etichettati con il tampone di dosaggio a una concentrazione finale di 2 µ g/mL. Iniettare 100 µ l di soluzione di anticorpo alla porta di entrata della diapositiva e incubare per 45 min a temperatura ambiente. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione della proteina della porta di uscita. Lavare il bilayer 2 x con 100 µ l di tampone di dosaggio come descritto al punto 3.11.

4. imaging dell'interazione cellule T con il Bilayer planare

1. Preriscaldare la fase e l'obiettivo di un microscopio a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale o confocale fino a quando la temperatura è equilibrata a 37 ° C. Impostare la diapositiva con il bilayer(s) sul piatto riscaldato. Spostare il palco in una posizione appropriata secondo i segni di inchiostro e concentrarsi sul bilayer impiegando la fluorescenza di molecole ICAM-1 Cy-etichettati.
   1. Utilizzare un obiettivo X 61 per il microscopio confocale, o un obiettivo 100x per il microscopio TIRF, con le impostazioni di filtro appropriato.
2. Per granello release formazione immagine di microscopia TIRF, aggiungere Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a frammenti di anticorpo Fab alla sospensione di cellule ad una concentrazione finale di 4 µ g/mL prima di iniettare le cellule nelle porte di entrata.
   1. Risospendere il CD4 preparato⁺ T cellule isolate da LN o PB o cavo di alimentazione del sangue e iniettare 50 µ l di sospensione cellulare nella porta di entrata del canale diapositiva contenente il bilayer.
3. Scegliere il numero desiderato di campi e registrare le immagini di ogni campo 1 x ogni 2 min per 30 min dopo l'iniezione.
4. Sfruttare il campo chiaro, riflessi luce fluorescente canali e (Alexa 488 e Cy5) del microscopio confocale per acquisire le immagini. Utilizzare la modalità TIRF per fluorescenza Alexa-Fluor-488 e Alexa-Fluor-568 e widefield per Cy5 fluorescenza, come pure il campo chiaro imaging, il microscopio di TIRF.

5. image Analysis

1. Analizzare le immagini acquisite utilizzando il software appropriato. Osservare la morfologia delle cellule in immagini di luce trasmesse ed Escludi cluster e visibilmente danneggiati o cellule apoptotiche dall'analisi. Includere nell'analisi solo quelle cellule che interagiscono in modo produttivo con la superficie di doppio strato (cioè, Alexa-Fluor-488 fluorescenza (anticorpi anti-CD3) all'interfaccia di accumulo delle cellule).
2. Determinare la dimensione della zona di adesione delle cellule a 20 min dopo l'inizio dell'interazione cellula-doppio strato.
   Nota: L'area di adesione è l'area scura sviluppato all'interfaccia cellula-doppio strato sulle immagini di microscopia (IRM) riflessione di interferenza.
3. Osservare eventuali accumuli di fluorescenza di Cy5-ICAM-1 e una formazione di anello di giunzione segregata Cy-ICAM-1 molecole all'interfaccia cellula-doppio strato. Se accumulate ICAM-1 molecole formano un anello di giunzione adesione su almeno due immagini consecutive, designare tali cellule come le cellule in via di sviluppo una periferica d'attivazione supramolecolari cluster (pSMAC)¹².
4. Valutare la versione di granulo misurando l'intensità della fluorescenza di Alexa-Fluor-568 all'interfaccia cellula T-doppio strato sopra la fluorescenza di fondo fuori l'area di contatto in prossimità della cella. Designare le cellule con un rapporto di Alexa-Fluor-568 segnale--fondo di almeno 1,3 come cellule degranulating.

Results

In primo luogo, abbiamo confrontato la struttura dell'interfaccia sinaptica formata da attivati CD8 cavo-sangue-derivate⁺ T cellule esposte a lipidici costruito sia in flusso tradizionale su larga scala sistemi di cellule (Vedi la Tabella materiali particolari)^{1 ,2,3,4} o nelle diapositive di flusso multicanale. Il bilayer contenuti f...

Discussion

La nuova tecnica descritta qui utilizza simili reagenti necessari per costruire bilayer planare in flusso convenzionale cella⁵ e può essere applicata con successo per eseguire l'imaging del primario umano delle cellule T – doppio strato interfacce^{3,4 ,15}. La tecnica offre una significativa riduzione nell'uso di molecole fluorescenti e richiede 10-20 volte meno cellule di T rispetto ad un flusso cellulare...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di isolamento delle cellule T CD4, umano	Miltenyl Biotec	130-096-533
Kit di isolamento delle cellule T CD8, umano	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375C
CANI NTA	Avanti Polar Lipids	790528C
Biotinyl Cap PE	Avanti Polar Lipids	870273C
Albumina sierica umana	Octapharma USA	NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4	ibidi	80608
Vetrini coprioggetti per vetrini adesivi	ibidi	10812
Camera Bioptech FCS2 Anticorpo	anti-CD3 Bioptech	060319-2-03
	Thermo Fisher Scientific	16-0037-81	Clone OKT3, le cellule di ibridoma sono disponibili da ATCC
anticorpo anti-CD28	Genetex	GTX14664	9.3 clone
Caseina	Sigma	C5890
Biotin-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	21329
DMSO	Sigma	D2650-5
Alexa Fluor 488 kit di marcatura delle proteine con colonna per la purificazione delle proteine marcate	Thermo Fisher Scientific	A10235
Kit di marcatura delle proteine Alexa Fluor 568 con colonna per la purificazione delle proteine marcate	Thermo Fisher Scientific	A10238
Amersham Cy5 NHS Ester	GE Life Science	PA15101
pMT/V5-His Vettori di espressione della Drosophila	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo, G418 Vettore di espressione della Drosophila per la selezione positiva	ATCC	37409
Terreni drosofici privi di siero Insetto-XPRESS	Lonza	12-730Q
Ibridoma YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	L'ibridoma secerne anticorpo contro ICAM-1.
Cianogeno bromuro-attivato-Sefarosio 4B	Sigma-Aldrich	C9142	Utilizzato per la preparazione di Sefarosio con anticorpo anti-ICAM legato covelentemente.
Concentratore a flusso tangenziale MasterFlex	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	Utilizzato per ICAM-1 contenente la concentrazione di surnatante e la dialisi di ICAM-1 contenente il supernatante
Centramate Lab Sistemi a flusso tangenziale	Pall FS002K10 OS010T12 FS005K10		Utilizzato per ICAM-1 contenente la concentrazione di surnatante e la dialisi di ICAM-1 contenente il surnante
Ni-NTA Agarosio	QIAGEN	30210
Tubi per dialisi	Spectra/Por	131384
Papaina da lattice di papaya	Sigma	P3125
anticorpo umano di topo contro CD107a	BD Bioscences	555798	Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves	Fisher Scientific	19-014-539
Nalgene Pinza a forbice in polipropilene	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
Streptavidin	ProZyme	SA10
	Microscopio		Nikon TiE dotato di PFS per il controllo della stabilità dell'immagine a lungo termine, obiettivi a olio 60X, 4 laser con linee di eccitazione a 405, 458, 488, 514, 561 e 640 nm, 2 rivelatori GaAsP e 2 PMT ad alta sensibilità, luce trasmessa DIC, tavolino X, Y, Z programmabile per posizioni multiple e cucitura di grandi aree, funzioni time lapse, temperatura Tokai-Hit e camera controllata CO2 per l'imaging dal vivo e tavolo di isolamento antivibrazioni
Microscopio TIRF	Andor		Andor Revolution XD dotato di illuminatore Nikon TIRF-E, laser con 405, 488, 561 e 640 linee, luce trasmessa DIC, testa a disco rotante Yokogawa CSU-X1 per imaging confocale, obiettivo 100/1,49 NA, fotocamera Andor iXon X3 EM-CCD, riscaldatore dell'obiettivo e un tavolino piezoelettrico motorizzato con Perfect Focus System (PFS)
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