Articolo metodologico

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

DOI:

10.3791/58157

⸱

17 luglio 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular Imaging Group, Wellcome Centre Human Genetics, University of Oxford, 2Division of Structural Biology, Wellcome Centre Human Genetics, University of Oxford, 3Dynamic Structural Virology Group, Biocruces Health Research Centre, 4IKERBASQUE, Basque Foundation for Science

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un approccio privo di calibrazione per la quantificazione della proteina omo-oligomerizzazione in vitro basati sulla spettroscopia di fluorescenza fluttuazione mediante microscopia a scansione di luce commerciale. Le impostazioni di acquisizione corretta e i metodi di analisi sono mostrati.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numero e la luminosità è una tecnica di spettroscopia (FFS) fluttuazione di fluorescenza privo di calibrazione per la rilevazione di proteine omo-oligomerizzazione. Può essere impiegata utilizzando un microscopio confocale convenzionale dotato di rivelatori digitali. Un protocollo per l'uso della tecnica in vitro è mostrato per mezzo di un caso di utilizzo dove il numero e la luminosità può essere visto per quantificare con precisione lo stato oligomerico di FKBP12F36V mVenus-etichettati prima e dopo l'aggiunta del farmaco dimerizing AP20187. L'importanza dell'utilizzo dei parametri di acquisizione corretta microscopio e i metodi di pre-elaborazione e analisi di dati corretti sono discusse. In particolare, l'importanza della scelta della correzione photobleaching è sollecitata. Questo metodo poco costoso può essere impiegato per studiare le interazioni proteina-proteina in molti contesti biologici.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteina-proteina interazioni ho n Vitro

Tradizionalmente, cristallografia ed esperimenti di risonanza magnetica nucleare combinati con cRIO-microscopia elettronica (cryoEM) sono le tecnologie scelte di descrivere con precisione l'architettura tridimensionale di proteine e di dedurre la loro funzione di scrutando i dettagli strutturali ad alta risoluzione. Proteine, tuttavia, non sono strutture statiche e possono subire una varietà di cambiamenti conformazionali e vibrazioni nel tempo e nello spazio. Questo è il motivo strutturale informazioni da cristallografici o CryoEM dati devono esse....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. FKBP12 F36V - mVenus purificazione

  1. Trasformare (DE3) pLysS cellule con pET22b vettoriale contenente monomerized umano FKBP12F36V12 e tag di His6 e mVenus del N-terminale (vettore disponibile su richiesta). Cellule di piastra su agar LB completati con ampicillina 50 µ g/mL e 34 µ g/mL cloramfenicolo.
  2. Trasferire le colonie trasformate in coltura starter 100 mL LB e crescere per 16-20 ore a 37 ° C con agitazione.
  3. Diluire la coltura starter denso (OD600 > 1) 1: 100 in mezzo LB (lotti di 2 x 500 mL) e crescere per 2-3 ore per OD600 = 0.6 - 0.8 (37 ° C, 200 giri/min).
  4. Cool culture sul ghiaccio. Indurre con 2....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Luminosità di detrending e monomerica

Una volta che sono stati acquistati i dati, si possono iniziare i calcoli di luminosità per determinare lo stato oligomerico della proteina di interesse nella soluzione. Anche se l'effetto di sbiancamento in soluzione potrebbe non essere così drastico come esso può essere in vivo, la traccia di intensità probabilmente non avrà ancora stazionaria media, probabilmente.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N & B è una tecnica per rilevare multimerization utilizzando luce commerciale scansione microscopi confocali dotate di rilevatori digitali. Questo approccio è molto attraente rispetto al singolo punto FCS, FCCS e smFRET perché è libero di calibrazione e il calcolo di luminosità è semplice e indipendente di concentrazione6. È di grande importanza, tuttavia, per correggere le fluttuazioni di intensità di imbianchimento e a lungo termine prima di eseguire i calcoli di luminosità9

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da Wellcome Trust concedere 105278/Z/14/2 a R.N. Il Wellcome Trust Centre for Human Genetics è finanziato dalla Wellcome Trust Core premio 203852/Z/16/2. Lavoro nel gruppo C.S. è supportato da Cancer Research UK (C20724/A14414) e il Consiglio europeo della ricerca nell'ambito dell'Unione europea Horizon 2020 ricerca e innovazione programma Grant 647278.

....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cellule pLysS RosettaTM (DE3)Novagen70956-3
AmpicillinaSigmaAldrich PubChem ID sostanza 329824407
CloramfenicoloSigma AldrichPubChem ID sostanza: 24892250
LB coltura inizialeQIAGEN
LB mediumQIAGEN
IPTGSigma AldrichPubChem Substance ID 329815691
tampone IMACMedicago09-1010-10
Inibitori della proteasi senza EDTA Resina Sigma Aldrich11873580001
TALONClonetech
Nichel sefarosioGE Healthcare
S200 colonnaGE Healthcare
Piatto di osservazione a 8 pozzetti con fondo in vetroIbidi80827
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
  2. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Analisi della luminosit numericamicroscopia confocalespettroscopia delle fluttuazioni di fluorescenzapurificazione delle proteinecorrezione del fotosbiancimentoFKBP12 mVenusfarmaco per la dimerizzazione AP20187quantificazione senza calibrazione

Articoli correlati