Preparare un 68Ga-etichettato arginina glicina aspartato (RGD)-peptide per l'angiogenesi

Sommario

L'integrina di₃ α β_vè un tipo di proteina di adesione che è altamente espresso sulle cellule endoteliali attivate che subiscono l'angiogenesi. Quindi, valutando l'integrità dell'integrina è di grande interesse in oncologia. Qui, presentiamo un metodo per preparare ⁶⁸Ga-etichetta radiopeptides e un metodo per valutarne l'efficacia biologica.

Abstract

L'integrina di₃ α β_vè una molecola di adesione heterodimeric coinvolti nell'angiogenesi e migrazione delle cellule tumorali. L'integrina è overexpressed in cellule endoteliali angiogenici tumorali, dove in genere ha una bassa concentrazione. Questa espressione specifica di α_vβ₃ lo rende un valido biomarcatore per antiangiogenico e imaging droga. Come una modalità di imaging funzionale, tomografia a emissione di positroni (PET) fornisce informazioni su biochimici e fisiologici cambiano in vivo, dovuto la relativa sensibilità alta unico alla scala nanomolari. Quindi, basati su radiometal radiofarmaci PET hanno ricevuto grande attenzione per la quantificazione non invasiva dell'angiogenesi del tumore. Questo documento fornisce un protocollo sistemico per preparare un nuovo peptide radiometal-etichettati per la valutazione dell'angiogenesi. Questo protocollo contiene informazioni sull'affidabilità radiochimica, liposolubilità, uptake cellulare, stabilità del siero e proprietà farmacocinetiche. Il ⁶⁸Ga-RGD-peptide è uno dei ligandi PET rappresentante verso α_vβ₃ integrina. Qui, presentiamo un protocollo per preparare un ⁶⁸Ga-RGD-peptide e la valutazione della sua efficacia biologica.

Introduzione

L'angiogenesi è un processo biologico che è caratterizzato dallo sviluppo di nuovi vasi sanguigni. Tra i molti fattori angiogenetici, α_vβ₃ integrina è associato con l'invasività, perché l'integrina è altamente espresso nei vasi sanguigni del tumore angiogenica ma è assente nel tessuto normale¹_.

Peptidi radioattivi di grippaggio del ricevitore con il dominio di aspartato (RGD) arginina glicina, che ha un'alta affinità nei confronti dei recettori con integrina α_v3 β, sono considerati promettente angiogenesi imaging agenti^{2,3 , 4 , 5 , 6 , 7}. diversi radiofarmaci sono stati creati per PET e sue proprietà biologiche sono state convalidate in vari modelli animali^8,9,10,11. In termini di un radionuclide, ⁶⁸Ga presenta parecchi vantaggi sopra altri radioisotopi. In primo luogo, ha un'elevata accessibilità per gli utenti ed è economicamente vantaggioso perché non è necessario un ciclotrone. In secondo luogo, ⁶⁸Ga-based radiofarmaci producono alta risoluzione spaziale rispetto con tomografia computata dell'emissione del singolo-fotone (SPECT), consentendo più accurata quantificazione. Infine, l'emivita di 67,71 minuti di ⁶⁸Ga può essere sufficiente per la preparazione di piccoli peptidi o proteine.

Per produrre un complesso stabile con ⁶⁸Ga, sono stati sviluppati molti chelanti. Chelatori rappresentativi sono l'acido 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic (TETA), acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA), acido 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-bioconjugate (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic acido (DTPA) e N, n' '-di(2-hydroxybenzyl) etilendiammina-N, n' '-diacetic acido (O3333). NOTA è stato segnalato per formare un complesso altamente stabile con ⁶⁸Ga (registro stabilità costante 30.98)^12,13,14.

Lo scopo del presente studio è quello di fornire un protocollo conciso per lo sviluppo di un nuovo radiopeptide (Figura 1). Ad esempio, prepariamo ⁶⁸Ga-labeled RGD-peptidi e metodi attuali per la valutazione biologica di questi analoghi in un modello dello xenotrapianto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di ricerca animali sotto protocolli approvati dalla Korea Institute di radiologica e Comitato di studi degli animali scienze mediche. Tutti i reagenti e solventi sono stati acquistati e utilizzati senza ulteriore purificazione. NOTA-RGD-peptidi sono stati redatti secondo letteratura metodi¹⁵.

Attenzione: ⁶⁸Ga emette raggi gamma e positroni. Tutti gli esperimenti, compreso il contatto diretto o indiretto con sostanze radioattive, devono essere effettuati da addestrati e consentito solo al personale. Durante la manipolazione di materiali radioattivi, dispositivi di protezione appropriati, schermatura, distintivo del dosimetro di radiazione e anelli e un misuratore di sondaggio deve essere utilizzati.

1. radiolabeling RGD-peptidi con ⁶⁸GaCl₃

Nota: ⁶⁸Ga (t_1/2 = 68 min, β⁺ = 89% e CE = 11%) è stata ottenuta da ⁶⁸Ga /⁶⁸generatore di Ge.

1. Eluire il ⁶⁸GaCl₃ dal generatore con 4 mL di 0,05 M HCl.
2. Eliminazione dei fogli inceppati con gas di azoto a 80 ° C per 30 min ad asciugare ⁶⁸GaCl₃ (333 kBq, 1 mL) in un flaconcino di reazione da 5 mL.
3. Aggiungere una soluzione di RGD-peptide (100 µ g) in acetato di sodio 1 M (100 µ l, pH 5-6) nel flaconcino di reazione contenente ⁶⁸GaCl₃ dal punto 1.2.
4. Riscaldare la miscela di reazione a 80 ° C per 5 min. Quindi, raffreddare fino a temperatura ambiente.
5. Purificare il prodotto grezzo con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Utilizzare il seguente sistema: una colonna di C-18, una portata di 0,5 mL/min, una pendenza gradiente di acetonitrile di 1.17%/min (5% - 40% in 30 min) e componenti di eluizione: A = 0,1% acido trifluoroacetico (TFA) in acetonitrile, B = 0,1% TFA in acqua.
   Nota: L'HPLC è dotato di un rivelatore di matrice del fotodiodo e un rilevatore di radioattività. Il ⁶⁸Ga-RGD-peptide è stato raccolto a un tempo di ritenzione del min 12,5 (Figura 2).
6. Purificare il risultante ⁶⁸Ga-RGD-peptide utilizzando un sistema di estrazione in fase solida.
   1. Filtrare la soluzione attraverso una cartuccia di fase inversa C18 e lavare con 2 mL di soluzione fisiologica.
   2. Eluire ⁶⁸Ga-RGD-peptide con 0,7 mL di etanolo al 95%. Togliere il solvente a 80 ° C sotto azoto gassoso per 20 min e ricostituire con tampone fosfato salino (PBS) prima dell'uso.
   3. Filtrare il prodotto radioattivo attraverso un filtro sterile da 0,22 µm e formulare in 1 mL di soluzione salina sterile.
7. Verifica il rendimento radiochimico di cromatografia di radio-strato sottile (TLC).
   1. Depositare 1 µ l su una piastra di cromatografia di strato sottile istantanea (ITLC, 10 cm di lunghezza). Sviluppare la lastra in una camera contenente l'eluente (acido citrico in soluzione acquosa 0,1 M, pH 5.0) fino a 9 centimetri lontano dal luogo.
      Nota: Il coefficiente di conservazione per ⁶⁸Ga-RGD-peptide è 0 e il coefficiente di conservazione non reagito ⁶⁸Ga^{3 +} è 1.
8. Calcolare l'attività specifica finale dal rapporto di radioattività corrispondente alla non-radioattività come MBq/nmol.
   Nota: Dopo l'iniezione di 100 µ l di formulati ⁶⁸Ga-RGD-peptide per HPLC, la quantità di componente non radioattivo è stata calcolata sulla curva di taratura standard utilizzando non radioattivi Ga-RGD-peptide.

2. in Vitro assorbimento cellulare

Nota: Le cellule di glioblastoma umano di Uppsala 87 Glioma maligno (U87MG) sono state coltivate in media dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM), completati con 10% fetale bovino del siero e l'1% penicillina-streptomicina. Le cellule sono state coltivate in piastre da 150 mm a 37 ° C in atmosfera umidificata di 5% CO₂. Le cellule sono state raccolte o dividere di trypsinization: 0,25% (p/v) tripsina e 0,02% (p/v) acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS a 37 ° C per 3-5 min.

1. Le cellule U87MG di seme in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 1 x 10⁶ cellule per pozzetto.
2. Incubare le cellule con ⁶⁸Ga-RGD-peptide (111 kBq) a 37 ° C per 30, 60, 90 e 120 min preparare campioni in triplice copia.
3. Lavare le cellule 2 x 2 ml di PBS e harvest di trypsinization. Utilizzare tripsina 0,25% (p/v) e 0.02% (p/v) acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS a 37 ° C per 3-5 min.
4. Raccogliere la sospensione cellulare (500 µ l) e la misura in un γ-counter.
5. Calcolare l'assorbimento percentuale del composto dalle cellule di % (conteggi della conta di cellule/totale).

3. in Vitro del siero stabilità

1. Aggiungere 500 µ l di siero di topo preparati al momento, 500 µ l di siero umano e 500 µ l di PBS. Incubare la miscela a 37 ° C per 2 h.
2. Valutare di ITLC intervalli di tempo specificati (30, 60, 90 e 120 min). Punto 1-2 aliquota µ l della miscela alla piastra ITLC (fase mobile: acido citrico 0.1 M). Sviluppare la lastra come descritto al punto 1.7.
   Nota: ⁶⁸Ga^{3 +} si prevede di passare con il fronte del solvente, considerando che il composto con etichettato rimarrà all'origine.

4. la determinazione della lipofilia

1. Aggiungere ⁶⁸Ga-RGD-peptide (3,7 MBq, 3,7 µ l) per il sistema di ripartizione ottanolo-PBS (1:1, v/v, totale 1 mL).
2. Mescolare le fiale vigorosamente per 5 min a temperatura ambiente e centrifugare a 10.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
3. Prelevare 100 µ l campioni da ogni strato e misurare la radioattività con un contatore di γ. Il valore di registro segnalati P si basa sulla media di tre campioni.

5. tumore modello

Nota: Topi nudi di BALB/c (6-8 settimane vecchio, donna, n = 23) sono stati utilizzati per questo studio. I topi sono stati successivamente utilizzati per studi PET (n = 3) e biodistribuzione (n = 20) quando i volumi del tumore ha raggiunto 200-300 mm³ (1-2 settimane dopo l'impianto).

1. Caricare le cellule del tumore in 28 G, 1/2 pollice siringhe per insulina.
2. Iniettare cellule U87MG (5 x 10⁶) in 100 µ l di PBS in regione del braccio sinistro.
3. Anestetizzare il mouse con isoflurano 2% in ossigeno e gas durante l'iniezione delle cellule.
   1. Assicurarsi che il mouse è stato anestetizzato dalla perdita del pedale ritiro riflesso seguente pizzicamento con forcipe tra le dita del piede destra posteriore. Non lasciare incustodito un animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.

6. quantificazione in Vivo di α_vβ₃ integrina utilizzando PET

1. Anestetizzare i topi con isoflurano 2% in ossigeno.
   1. Assicurarsi che il mouse è stato anestetizzato dalla perdita del pedale ritiro riflesso seguente pizzicamento con forcipe tra le dita del piede destra posteriore. Non lasciare incustodito un animale fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.
2. Posizionare la testa al centro del portale PET.
3. Per via endovenosa amministrare il ⁶⁸soluzione Ga-RGD-peptide (7,4 MBq, 200 µ l) per il xenograft del mouse modello tramite vena caudale per 1 min.
4. Allo stesso tempo, è necessario eseguire una scansione PET in modalità elenco (esplorazione dinamica) per 150 min.
   Nota: I dati grezzi di PET sono stati ricostruiti da un lasso di tempo definito dall'utente (cioè, ogni 30 min). Dopo la scansione PET, una scansione di micro-tomografia computerizzata (CT) (50 kVp dei raggi x, 0,16 mA) è stata condotta per la correzione di attenuazione.

7. biodistribuzione Ex Vivo

1. Iniettare ⁶⁸Ga-RGD-peptide (0.37 MBq, 200 µ l) nella vena caudale del modello del topo dello xenotrapianto. Anestetizzare il mouse con isoflurano 2% in ossigeno e gas durante le iniezioni.
   Nota: Topi nudi di BALB/c, come descritto nella sezione 5, sono stati divisi in quattro gruppi e sacrificati a tempi differenti (n = 5 per gruppo).
2. Svegliare i topi immediatamente dopo la somministrazione di ⁶⁸Ga-RGD-peptide e sacrificarli a 30, 60, 90 e 120 min di postinjection con biossido di carbonio l'eutanasia.
   Nota: I tessuti di interesse sono stati estratti. Target selezionati erano sangue, muscolo, cuore, polmone, fegato, milza, stomaco, intestino, reni, osso e tumore.
3. Il tessuto di pesare e misurare la radioattività con un contatore di γ.
   Nota: I risultati sono stati espressi come la percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto (% ID/g).

Risultati

La chelazione di ⁶⁸GaCl₃ con NOTA-RGD-peptide è stato semplice, e la resa radiolabeling era 99%. Impurità di reazione sono stati rimossi con successo come mostrato nella Figura 2. La purezza radiochimica di ⁶⁸Ga-RGD-peptide era supera al 99%, e specifiche attività alla fine della sintesi era 90-130 MBq/nmol (Figura 3).

L'uptake cellulare...

Discussione

Nello studio presente, abbiamo introdotto un protocollo per preparare un radiopeptide α_vβ₃ integrina e sua valutazione biologica di targeting. Lo sviluppo di farmaci tradizionali comporta una procedura complicata. Richiede una grande quantità di materiale di riferimento e una durata relativamente lunga. Anche se la metodologia suggerita non può sostituire il processo di valutazione delicato, questo sistema può essere utilizzato ai fini dello screening. Questa proposta di sistema ridurrebbe considere...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
68Ga/68Ge generatore	ITG	Company-10	mCi
Soluzione di acido cloridrico	Sigma-aldrich	84429
Acetato di sodio	Sigma-aldrich	S2889
C18 cartuccia in fase inversa	Acque	WAT020515
0,22-μ m filtro sterile	Milllipore	SLGV033RS
Radio-TLC scanner	Bioscan	AR2000
ITLC carta	Agilent	SGI001
Acido citrico	Sigma-aldrich	251275
HPLC	Waters-Waters		1525 sistema contenente pompa binaria, array di fotodiodi (Waters 2998), rivelatore di radioattività (Raytest, Gabi)
Acetonitrile	J.T. Baker	14-650-359
Acido trifluoroacetico	Sigma-aldrich	302031
Eagle modificato di Dulbecco	Thermo fisher scientific	11965092
siero fetale bovino	Thermo fisher scientific	16000044
T175 fiasche.	Corning	CLS431080
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo fisher scientific	25200072
penicillina-streptomicina	Thermo fisher scientific	15240112
γ-counter	Perkin		Wizard 3
Siringa Insunlin	Becton Dickinson	326105
Pompa Synringe	Harvard Apparecchio	70-4500
micro-PET/CT	Siemens Inveon	-

Elmer-1480