La linea cellulare del carcinoma embrionale del topo P19 (linea cellulare P19) è ampiamente utilizzata per studiare il meccanismo molecolare della neurogenesi con grande semplificazione rispetto all'analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo per la neurogenesi indotta da acido retinoico nella linea cellulare P19.
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Articolo metodologico
Neurogenesi con cellule carcinoma embrionale P19
In questo articolo
Sommario
Abstract
La linea cellulare P19 derivata da un teratocarcinoma derivato da un embrione di topo ha la capacità di differenziarsi nei tre strati germinali. In presenza di acido retinoico (RA), la linea cellulare P19 coltivata in sospensione è indotta a differenziarsi in neuroni. Questo fenomeno è ampiamente studiato come un modello di neurogenesi in vitro. Pertanto, la linea cellulare P19 è molto utile per gli studi molecolari e cellulari associati alla neurogenesi. Tuttavia, i protocolli per la differenziazione neuronale della linea cellulare P19 descritti nella letteratura sono molto complessi. Il metodo sviluppato in questo studio è semplice e giocherà un ruolo nel chiarire i meccanismi molecolari nelle anomalie del neurosviluppo e nelle malattie neurodegenerative.
Introduzione
Durante lo sviluppo embrionale, uno strato a cella singola viene trasformato in tre strati germinali separati1,2,3. Per aumentare le possibilità di ricerca dei fenomeni che si verificano in vivo, la generazione di aggregati tridimensionali (corpi embrionali) è stata sviluppata come un modello conveniente. Gli aggregati cellulari formati in questo modo possono essere esposti a varie condizioni causando differenziazione cellulare, che riflettono lo sviluppo dell'embrione4,5. La linea cellulare p19 murina carcinoma embri....
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Protocollo
1. Manutenzione della cultura
- Cultura la linea cellulare P19 in Maintenance Medium (il mezzo di Aquila modificato di Dulbecco con 4.500 mg/L di glucosio integrato con 10% FBS, 100 unità / mL penicillina e 100 unità / mL streptomicina). Incubare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.
2. Cellule sottocoltura
- Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, rimuovere il mezzo esaurito dai flaconi di coltura cellulare (superficie 25 cm2).
- Lavare le cellule con 2 mL di fosfato tamponato salina (PBS) senza calcio e magnesio.
- Aggiungere 1 mL di 0,25% di trypsin-EDTA (acido ....
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Risultati
Lo schema semplificato del protocollo per l'induzione della neurogenesi nella linea cellulare P19 è presentato nella Figura 1. Per definire il carattere della linea cellulare P19 in uno stato indifferenziato e durante la neurogenesi, è stato utilizzato il metodo RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction). La linea cellulare P19 indifferenziata esprimeva i geni di pluripotenza come cation organica/carnitina trasportatore4 (Oct4) e Omeobo.......
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Discussione
Qui, descriviamo un semplice protocollo per la neurogenesi usando la linea cellulare P19. Anche se molti rapporti sono stati pubblicati a questo proposito, una metodologia dettagliata per l'induzione della neurogenesi utilizzando la linea cellulare P19 rimane poco chiara. Inoltre, abbiamo utilizzato un semplice mezzo DMEM ad alto glucosio (4.500 mg/L) con 10% FBS per l'intero esperimento. Questo ci ha permesso di eseguire l'esperimento neurogenico in modo user-friendly ed espandere l'uso di questo metodo per il futuro.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Centro nazionale di scienze, Polonia (n. di sovvenzione. UMO-2017/25/N/N/N-N/3/01886) e KNOW (Leading National Research Centre) Consorzio scientifico "Animale sano - Cibo sicuro", decisione del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore n. 05-1/KNOW2/2015
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 6x Colorante di caricamento del DNA | EURx | E0260-01 | |
| Agarosio | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| Kit di sintesi del cDNA | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidina-2&primo;-fenilindolo dicloridrato) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Concentrazione di lavoro: 1 μ g/mL |
| DMEM alto glucosio (4,5 g/L) con L-glutammina | Lonza | BE12-604Q | |
| Etanolo 99,8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| Anticorpo MAP2 | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Diluizione 1:100 |
| Kit di reazione PCR | EURx | E0411-03 | |
| Penicillina/Streptomicina 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 1x concentrato senza Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Acido retinoico | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | disciolto in etanolo al 99,8%; conservare in -20 ° C fino a 6 mesi |
| Anticorpo secondario (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Diluizione 1:500 |
| Latte scremato | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Tampone | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Tripsina 0,25% - EDTA in HBSS, senza Ca2+, Mg2+, con | biosiero | LM-T1720/500 | |
| Plastica per colture cellulari Pipette | |||
| sierologiche da 1 mL Profilab | 515.01 | ||
| Pipette sierologiche da 10 mL | Profilab | 515.10 | |
| Piatto da 100 mm dedicato per colture in sospensione | Corning | C351029 | |
| Provette da centrifuga da 15 mL | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| Pipette sierologiche da 5 mL Profilab | 515.05 | ||
| Piastra a 6 pozzetti | Corning | CLS3516 | |
| Flaconi per colture cellulari, superficie 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
Riferimenti
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488(2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapte....
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Ristampe e permessi
