Descriviamo un protocollo per indurre aterosclerosi nella radice aortica di ApoE- / - topi alimentati con una dieta atherogenic, attraverso un continuo rilascio di aldosterone. Inoltre vengono descritti metodi per caratterizzare la composizione della placca.
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Articolo metodologico
Induzione delle placche aterosclerotiche attraverso l'attivazione dei recettori mineralcorticoidi nei topi E-carenti dell'apolipoproteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Aterosclerosi è a causa di una risposta infiammatoria cronica che colpisce endotelio vascolare ed è promosso da diversi fattori quali ipertensione, dislipidemia e diabete. Ad oggi, ci è prova per sostenere un ruolo per la circolazione dell'aldosterone come fattore di rischio per lo sviluppo della malattia cardiovascolare. Modelli murini transgenici sono stati generati per lo studio dei processi cellulari e molecolari che conducono all'aterosclerosi. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo che si avvale dell'infusione continua dell'aldosterone nei topi di ApoE- / - e genera le placche aterosclerotiche in radice aortica dopo 4 settimane di trattamento. Abbiamo, quindi, illustrare un metodo per la quantificazione e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche a livello della radice aortica. Il valore aggiunto dell'infusione dell'aldosterone è rappresentato dalla generazione delle lesioni aterosclerotiche ricche di lipidi e cellule infiammatorie dopo 4 settimane di trattamento. Descriviamo in dettaglio le procedure di colorazione per quantificare il contenuto lipidico e dei macrofagi all'interno della piastra. In particolare, nel presente protocollo, eseguiamo cuore inclusione di tessuti in OCT al fine di preservare l'antigenicità del tessuto cardiaco e facilitare l'individuabilità degli antigeni di interesse. Analisi del fenotipo placca rappresenta un valido approccio per studiare la fisiopatologia dello sviluppo di aterosclerosi e di identificare nuovi bersagli farmacologici per lo sviluppo di farmaci anti--atherogenic.
Introduzione
L'aterosclerosi è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo1. È caratterizzata da uno stato infiammatorio cronico, dove i vasi sanguigni sono infiltrati da lipidi e leucociti che determinano la formazione di placche aterosclerotiche. La maggior parte degli eventi cardiaci acuti è associata con gli eventi trombotici a causa della rottura della placca. Placche alla rottura incline sono definite "vulnerabili" e sono caratterizzate da una maggiore infiltrazione dei leucociti pro-infiammatorie, un core necrotico e un cappuccio fibroso sottile2. Negli ultimi decenni, gli studi clinici e sperimentali....
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Protocollo
Lo studio è stato approvato dalle commissioni di utilizzo, numero autorizzazione 493/2016-Pr. e italiana istituti nazionali di sanità Tutte le procedure sono state condotte per le linee guida della Comunità europea per l'uso di animali da esperimento (direttiva europea 2010/63/UE).
Nota: L'impianto sottocutaneo di osmotico Minipompa contenente veicolo (etanolo in soluzione salina) o dell'aldosterone (240 µ g · kg-1 · d-1) in 8-10 settimana-vecchi maschi topi carenti per il gene ApoE . In generale, 8-10 settimana-vecchi maschi ApoEdel −/topi pesano intorno ai 25-26 g.
1. dis....
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Risultati
In 8-10 settimane topi- / - Apo, minipompe sono stati impiantati per infondere con veicolo o dell'aldosterone (Figura 1E-1I) e ha alimentato una dieta atherogenic (regolati calorie dieta 42% da grasso) per 4 settimane. Alla fine del trattamento, topi sono stati eutanasizzati ed irrorati con PBS e formalina al 10% come descritto sopra. La radice aortica è stata separata dalla parte apicale del cuore ed è stata incorporata nello stru.......
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Discussione
L'aterosclerosi è un disordine infiammatorio cronico connesso con medie e grandi vasi che coinvolgono interazioni tra diversi tipi di cellule, come i macrofagi, linfociti T, cellule endoteliali e cellule di muscolo liscio1. Nonostante le limitazioni dei modelli murini atherogenic, un grande corpo di prova il processo aterosclerotico è disponibile. Questi modelli hanno il vantaggio di generare rapidamente sperimentale coorti di una determinata età e sesso. Anche i topi mostrano un background geneti.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Ministero della salute italiano (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 e PE-2011-02347070 a C.U.)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dieta a calorie aggiustate (42 % da grassi) | Envigo | TD.88137 | dieta aterogena |
| Minipompa osmotica con tubo di riempimento | Alzet | modello 1004 | per realasi continua |
| Aldosterone | SIGMA | A9477 | ormone |
| Etanolo | SIGMA | 34852-M | solvente |
| Alchol Preps saturo con alcool isopropilico al 70 % | Kendal Webcol | 6818 | |
| Disinfettante Filo per chirurgia (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | chirurgia |
| 10% Povidone/iodio unguento | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Formalina antisettica |
| 10% | SIGMA | HT5012 | per fissare la vascolarizzazione |
| Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | per l'inclusione |
| di O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | per l'inclusione |
| criostato | Strumento Leica | CM1900 | per il sezionamento |
| soluzione tampone salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Aurogene | AU-L0615-500 | |
| Vetrini di adesione Vetrini per microscopio Polisina | VWR | 631-0107 | |
| Occhiali di copertura Occhiali | copertura | Bio-Optica | 72015 |
| Formaldeide 37% | SIGMA | 252549 | solvente |
| Olio Rosso O soluzione (0,5 % in isopropanolo) | SIGMA | O1391 | soluzione colorante |
| Mayer' s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | soluzione colorante |
| Carbonato di litio | SIGMA | 62470 | tampone di lavaggio |
| Mezzo di montaggio acquoso | Thermo Scientific | TA-125-AM | soluzione di montaggio |
| Acetone | SIGMA | 179124 | solvente |
| Soluzione di acido fosfomolibdico | SIGMA | HT153 | per istologia |
| Direct Red 80 (Rosso Picrosirio) | colorante | 365548 SIGMA | |
| Bio Clear (agente schiarente di origine terpenica) | Bio-Optica | 06-1782D | prodotto per la preparazione di campioni istologici |
| Eukitt Mezzo di montaggio a indurimento rapido (Poli(metacrilato-co-metilmetacrilato) | Soluzione di montaggio SIGMA | 3989 | |
| Sodio Dodecil Solfato | Fluka | 71725 | polvere |
| Soluzione di perossido di idrogeno (30 %) | Soluzione SIGMA | H1009 | |
| Vectorstain ABC KIT comprendente: IgG ABC anti-coniglio, siero di coniglio normale, IgG anti-ratto biotinilato secondario, | soluzione colorante | PK-6100 PK-6100 | Vector Laboratories |
| soluzione colorante | 3-ammino-9-etilcarbazolo | SK-4200 | |
| anticorpo Mac3 | BD Biosciences | 553322 | anticorpo |
| ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software per analizzare le immagini |
Riferimenti
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
- Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
- Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
- Bentzon, J. ....
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Ristampe e permessi
