Articolo metodologico

Determinazione della competenza riproduttiva confermando Inizio puberale e realizzazione di un test di fertilità in topi e ratti

DOI:

10.3791/58352

⸱

13 ottobre 2018

1Department of Animal Science, Michigan State University

In questo articolo

Sommario

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Molti trattamenti e mutazioni genetiche impatto i tempi della maturità sessuale e la fertilità. Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per valutare l'Inizio puberale in topi e ratti prima della creazione di uno studio di fertilità negli animali sessualmente maturi.

Abstract

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Valutazione della competenza riproduttiva è fondamentale per comprendere l'impatto di un trattamento o la manipolazione genetica sull'asse riproduttivo, anche definito l'asse ipotalamico-ipofisi-gonadi. L'asse riproduttivo è un integratore di chiave di input ambientali e interni, adattando la fertilità a condizioni favorevoli per la riproduzione. Prima di imbarcarsi su uno studio di fertilità nei topi e nei ratti, la maturità sessuale viene valutata per escludere la possibilità che i fenotipi osservati riproduttivi sono causati da ritardato o assente Inizio puberale. Questo protocollo descrive un approccio non invasivo per valutare Inizio puberale nei maschi attraverso la determinazione di separazione del prepuzio che nelle femmine attraverso l'apertura vaginale e primo estro. Dopo la conferma del completamento della pubertà e il raggiungimento della maturità sessuale, uno studio di fertilità può essere avviato. La procedura descrive le condizioni di allevamento ottimali per topi e ratti, come impostare uno studio di fertilità e i parametri da valutare e determinare se il trattamento o l'omissione del gene ha un impatto sulla fertilità.

Introduzione

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Per raggiungere la maturità sessuale e riproduttiva competenza è necessaria la transizione attraverso la pubertà. La transizione puberale e il mantenimento della fertilità in età adulta è regolata dall'asse riproduttivo, anche definito l'asse ipotalamico-ipofisi-gonadi (Figura 1). I tempi dell'Inizio puberale e mantenimento della fertilità è strettamente regolati da fattori interni, nonché dell'ambiente per aumentare le probabilità di sopravvivenza della prole e genitori1,2. Questo protocollo fornisce un approccio non invasivo per determinare l'Inizio puberale in topi e ratti per confermare la maturità sessuale prima della creazione di uno studio di fertilità per valutare la competenza riproduttiva.

Uno studio di fertilità viene eseguito negli animali sessualmente maturi e può essere avviato dopo che gli animali sono passati attraverso la pubertà. Prima dell'Inizio puberale, l'asse riproduttivo è quiescente, e il driver della chiave di maturazione sessuale, gonadotropina - releasing hormone (GnRH), viene rilasciato sulla ghiandola pituitaria in quantità insufficiente per iniziare la pubertà (Figura 1). Inizio puberale è un processo complesso che si traduce in un aumentato rilascio di GnRH presso l'eminenza mediana. GnRH promuove l'ormone luteinizzante (LH) e follicolo-stimolante secrezione dell'ormone (FSH) dall'ipofisi, due ormoni essenziali per maturazione gonadica e funzione riproduttiva (Figura 1)3,4,5 .

Insulti all'asse riproduttivo provocare ridotta fertilità e possono anche Inizio puberale di anticipo o ritardo. Condizioni note per influenzare la tempistica dell'Inizio puberale e competenza riproduttiva includono l'esposizione a sostanze chimiche6,7, aumentata/diminuita corpo peso1,8, cambiamenti nel sistema endocrino giorno lunghezza2,9 e mutazioni genetiche10,11,12,13,14,15.

L'inizio della maturità sessuale è un passo fondamentale che deve essere completato prima della creazione di un test di fertilità. I vantaggi della determinazione Inizio puberale attraverso la separazione del prepuzio, apertura vaginale e primo estro, sono le caratteristiche non-invasiva di queste procedure, in quanto non necessitano di raccolta del sangue o sacrificio dell' animale16, 17.

Dopo Inizio puberale è determinato, impostare correttamente da uno studio di fertilità fornirà importanti informazioni circa l'integrità dell'asse riproduttivo e di solito ha il secondo vantaggio di generare animali da esperimento per ulteriori studi (perfezionamento) 18. l'installazione di studio di fertilità descritto nel presente protocollo in grado di rilevare i deficit maggiori e minori in termini di competenza riproduttivo nei maschi e nelle femmine. Principali parametri valutati comprendono 1) tempo per la prima cucciolata, 2) numero di cucciolate generate in un determinato lasso di tempo e 3) lettiera le dimensioni. Infine, consigli per il tipo di follow-up studi che possono essere condotti per identificare la causa della compromissione della fertilità sono inclusi.

Il protocollo descritto si riferisce ai topi e i dati rappresentativi riflettono il lavoro svolto in topi transgenici. Tuttavia, tutti i protocolli inclusi sono ugualmente validi in ratti.

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Michigan State University e condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. determinare Inizio puberale

  1. Seguire le linee guida istituzionali per l'abbigliamento, come minimo, è necessario indossare un camice da laboratorio pulito e guanti puliti. Maneggiare sempre topi indossando guanti puliti.
  2. Preparare l'area di lavoro posizionando un pad sul tavolo.
    1. Posizionare un top di gabbia pulita del mouse con la griglia rivolta verso l'alto sul pad.
    2. Impostare una scala nell'area di lavoro. Posizionare un bicchiere pulito 500 – 1000 mL sulla scala e Tara.
    3. Collocare un foglio accanto all'area di lavoro per peso corporeo record e separazione del prepuzio, apertura vaginale o primo estro.
  3. Identificare i topi per lo studio. Eseguire ispezioni giornaliere per Inizio puberale fino al raggiungimento della pubertà. Eseguire l'ispezione allo stesso tempo del giorno in tutto lo studio. Inizio puberale può accadere più presto postnatale giorno 11-1219, tuttavia, nelle configurazioni più sperimentale, monitoraggio di Inizio puberale inizia alle ~ 22 giorni.
  4. Posizionare la gabbia del mouse nell'area di lavoro (punto 1.2). Aprire la gabbia e mettere il coperchio, bottiglia d'acqua e titolare di cibo sul tavolo.
  5. Determinazione della separazione del prepuzio in di topo maschio.
    1. Tenendo premuto il mouse per la coda, posizionarlo sulla parte superiore della gabbia di mouse pulito dal punto 1.2.1. Tenendo delicatamente sulla coda, lasciare che il mouse Esplora la griglia della parte superiore della gabbia per ~ 5 s.
    2. Tirare delicatamente la coda indietro; Questo provoca solitamente l'animale muovendo in avanti tenendo la griglia con le zampe anteriori. Approccio l'altra mano alla pelle nelle vicinanze il collo e le orecchie.
    3. Afferrare la pelle flaccida tra le spalle e il collo con il pollice e l'indice. È importante ottenere una buona tenuta della pelle, come il mouse impedirà di girare la testa intorno a mordere.
    4. Afferrare la pelle sul retro con le barrette restanti e tenerlo premendo contro la mano. Tenere saldamente senza ostruire la respirazione, sangue flusso, o danneggiare le ossa, muscoli o pelle. Girare la mano per esporre la pancia del mouse, pur sostenendo il retro del mouse all'interno del palmo della mano.
    5. Con la mano libera, spingere delicatamente indietro la pelle intorno al pene senza forzare. Alla separazione del prepuzio, la pelle preputial scivola indietro esponendo il pene di glans (Figura 2A, freccia che indica la separazione del prepuzio). Registrare la presenza o l'assenza di separazione del prepuzio.
    6. Pesare il mouse posizionando delicatamente nel becher 500-1000 mL dal punto 1.2.2 e registrare il peso.
    7. Reintrodurre il mouse nella gabbia alloggiamento tenendo il bicchiere 0-2 cm sopra il pavimento della gabbia e rovesciarsi lentamente il becher permettendo il mouse per uscire da sola. Pulire il becher con acqua e detergente delicato e asciugarlo prima di restituirlo alla scala e tarare la bilancia.
  6. Determinare l'apertura vaginale nei topi femmina.
    1. Posto un batuffolo di cotone, bicchiere e una bottiglia di acqua sterile nell'area di lavoro (punto 1.2). Versare l'acqua nel contenitore. Umidificare il batuffolo di cotone con acqua sterile e posizionarlo accanto alla parte superiore della gabbia dal punto 1.2.1.
    2. Posizionare la gabbia del mouse nell'area di lavoro (punto 1.2) e trasferire il mouse dalla sua gabbia a casa fino alla cima della gabbia (punto 1.2.1) tenendolo alla base della coda. Tirare delicatamente indietro la coda per favorire un movimento in avanti del mouse.
    3. Sollevare la coda, sostenendo i fianchi con le dita gratuite. Consentire le zampe posteriori mantenere il contatto con la parte superiore della gabbia. Se il mouse si muove troppo, tenerlo in mano come descritto nella procedura 1.5.1-1.5.4.
    4. Pulire delicatamente la vulva con il batuffolo di cotone umidificata acqua dal punto 1.6.1. Usare un batuffolo di cotone pulito umidificato per ogni mouse. Per determinare l'apertura vaginale, esaminare la vulva e determinare se la vagina è completamente aperta (Figura 2A, apertura vaginale femmina).
    5. Record se si è verificato l'apertura vaginale. Pesare il mouse e ritornare alla gabbia a casa, come descritto nella procedura 1.5.6-1.5.7.
  7. Primo estro un indicatore di ovulazione prima.
    1. Porre un becher con acqua sterile, una lastra di vetro con etichetta e una pipetta 200 µ l con una punta pulita nell'area di lavoro (punto 1.2).
    2. Tenere la femmina come descritto nel passo 1.6.2-1.6.3. Posizionare la punta della pipetta contenente ~ 50 µ l di acqua sterile all'apertura vaginale.
    3. Lavare delicatamente le cellule dalla parete vaginale introducendo e riassorbire ~ 50 µ l di acqua 2 - 4 volte. Spalmare il contenuto dalla punta della pipetta su un vetrino per microscopio con etichetta.
    4. Osservare attentamente la morfologia cellulare su un microscopio a campo chiaro utilizzando un 10 X o 20 X obiettivo o lasciare che il airdry striscio per ~ 1 h e poi colorante di contrasto con una soluzione di blu di metilene di 0,1% (disciolta in ddH2O) (Figura 2B). Per colorante di contrasto, immergere la diapositiva secca nella soluzione 0,1% di blu di metilene per ~ 30 s. Lasciare asciugare per 1 h l'aria di diapositiva.
    5. Osservare le diapositive dal punto 1.7.4 su un microscopio a campo chiaro a 10x o 20x. Stabilire la fase del ciclo estrale (Figura 2B)20 osservando la morfologia delle cellule, che permette di distinguere le quattro fasi distinte del ciclo estrale (Figura 2B).
      Nota: Il Metaestro è caratterizzato da una miscela di cellule epiteliali squamose cornified e leucociti, diestro dai leucociti, proestro da una miscela di leucociti e cellule epiteliali nucleate ed estro di cellule epiteliali cornified (Figura 2B) 20.
    6. Registrare il peso corporeo e tornare il mouse alla sua gabbia a casa, come descritto nella procedura 1.5.6-1.5.7. Gli strisci vaginali sono terminati il giorno quando il mouse ha il suo primo estro (Figura 2B).

2. auspicabile camera condizioni di allevamento

  1. Assicurarsi che la camera di allevamento ha una temperatura di ~ 20-24 ° C, con 55 ± 10% di umidità e omogeneo in camera luce di un'intensità di ~ 300-400 lux circa 1 m di sopra del piano21. Questa intensità luminosa consente l'intensità della luce metà gabbia desiderabile di 25-80 lux. Per testare l'intensità della luce, utilizzare un misuratore di luce.
  2. Utilizzare un sistema automatizzato per controllare l'illuminazione della camera di allevamento per garantire adeguata temporizzazione dell'illuminazione in tutto l'esperimento. Condizioni ottimali di lunghezza del giorno per valutare la fertilità nella gamma di roditori da una giornata di 12 ore (12h luce e buio di 12 h, LD12:12), alle condizioni di "estate-like" con 14 h di luce e 10 h tenebre (LD14:10)21.
  3. Preparare le gabbie di allevamento.
    1. Preparare una gabbia pulita del mouse con coperchio, acqua, cibo, biancheria da letto e nidificazione per coppia di allevamento.
    2. Compilare le schede di gabbia con tutte le informazioni necessarie, compreso il sesso, data di nascita, razza del topo e la data quando l'accoppiamento è impostato.

3. studio di fertilità

  1. Identificare gli animali da utilizzare per lo studio di fertilità. Assicurarsi che gli animali siano sessualmente maturi (passaggio 1). Una fascia di età in genere usati per impostare uno studio di fertilità nei topi è di 10-16 settimane di età, un'età in cui la maturazione sessuale è stata completata in condizioni più sperimentali.
  2. Su un tavolo pulito, posizionare la gabbia di allevamento preparata al punto 2.3.
  3. Catturare e tenere premuto il mouse.
    1. Introdurre lentamente una mano guantata nella gabbia del mouse. Lasciare la mano nella gabbia per un breve periodo di tempo (~ 5-30 s), permettendo che i topi di adattarsi all'odore del guanto e della mano. Evitare movimenti a scatti e frenetici.
    2. Abbassare la mano a Coppa vicino al fondo della gabbia e lentamente si avvicinano ai topi. Corrono via. Quando corrono sopra la mano, intercettare la coda del uno mouse tra il pollice e il dito indice.
    3. Sollevare il mouse per la coda per 2-3 s. Se il mouse ha bisogno di essere tenuto più a lungo, tenere sulla coda e posizionare il mouse in mano a Coppa mantenendo la presa sulla coda.
  4. Trasferire 1 maschio e, successivamente, 1 femmina nella gabbia allevamento tenendoli per la coda (punto 3.3). Assicurarsi che le femmine siano nella stessa fase di estro, quando si configura il test di fertilità. Determinare la fase di estro delle femmine eseguendo uno striscio vaginale come descritto in passaggio 1.7.
  5. Chiudere la gabbia e assicurarsi che i topi hanno cibo, acqua e nidificazione materiale. Allegare il titolare della carta di gabbia con la scheda della gabbia della gabbia.
  6. Posizionare la gabbia di allevamento al ripiano di alloggiamento. Lascia la gabbia di allevamento come indisturbata come possibile per l'intera durata dello studio della fertilità. Condurre lo studio di fertilità per 30 giorni. Per ogni coppia di allevamento, conservare registri dettagliati e nota 1) la data che l'accoppiamento è impostato, 2) la data sono nate cucciolate e 3) il numero di cuccioli nati, compresi i cuccioli morti e dal vivo. Eseguire controlli di lettiera ogni giorno in tutto lo studio.
  7. Prolungare la fertilità Studio per altri 30-60 giorni se no o un debole impatto sulla fertilità è stabilito nel punto 3.6.

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Risultati

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I risultati presentati derivano da due modelli di topi transgenici differenti dove il fattore trascrizione anteriore ventrale homeobox 1 (Vax1) è stato eliminato in tutto il corpo su un allele, qui indicato come heterozygote topi (HET)13, o Vax1 è stato eliminato in modo condizionale all'interno di GnRH neuroni22, qui chiamato condizionale KO (cKO). Prima di impostare lo studio di fertilità, è importante confermare l'Inizio...

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Discussione

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Il benessere generale dei topi è critico per un test di fertilità successo21. Quando si esegue un test di fertilità, è importante controllare non fisicamente sui topi ogni giorno come questo può causare stress. Evitare ulteriori modifiche frequenti gabbia, come questi sono anche stressanti. Idealmente le modifiche gabbia saranno fatto non più di 1 - 2 volte alla settimana. L'esposizione alla luce durante la fase scura influisce negativamente sulle allevamento nei roditori notturni. Non accendere l...

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Dichiarazioni

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L'autore non ha nulla di divulgare.

Ringraziamenti

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Ringrazio gli autori che contribuiscono al lavoro iniziale che è alla base di questa pubblicazione. Grazie a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan ed Erica L. Schoeller per aiuto preparazione del manoscritto. Grazie a Jessica Sora Lee e Austin Chin per assistenza tecnica con il manoscritto. H.M.H è stato sostenuto da Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & sviluppo umano dei National Institutes of Health, sotto Premio numero R00HD084759.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Batuffoli di cotone steriliFisher22456885
Protezione di superficieFisher1420637
EsposimetroVWR21800-014
Blu di metileneSigma-AldrichM9140
Vetrini per microscopioGenesee Scientific29-101
Rack Optimouse con gabbieAnimalCare systemsC89100
Cestino per bottiglie d'acqua Sistemi AnimalCareC61011
Cime delle gabbie filtrateSistemi AnimalCareC78210
Optimice Standard FeederSistemi AnimalCare SistemiC40100SG
Gabbia Porta SchedeAnimalCare SistemiC43251
Schede GabbieSistemi AnimalCareM52010
Bottiglia AssambleySistemi AnimalCare
Letto R'Nest NidificazioneThe AndersonsBRN4WSR
1/8" Corn Cob lettiera The Andersons8B
Standard mouse chowTeklad7904 (7004)
ScalaVWR10205-004
Polipropilene BecherFisher14-955-111F
C79122P

Riferimenti

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